Studio delle

comunità
microbiche
La coltivazione in laboratorio dell’insieme dei
microbi presenti in popolazioni miste di origine
ambientale provoca cambiamenti sostanziali
nella loro composizione. Controllare tali
cambiamenti è praticamente impossibile.

Per questo motivo si è storicamente preferito

isolare i singoli microrganismi in colture pure;
una procedura che ha portato a uno straordinario
progresso della conoscenza degli aspetti
fisiologici e genetici dei microrganismi, ma che
ha fortemente sacrificato gli aspetti ecologici.
Per la coltivazione in laboratorio di alcuni
microrganismi le difficoltà sono enormi.
Inoltre i microbi cresciuti in laboratorio
non si comportano come nel loro ambiente
naturale, dove per esempio la disponibilità
di nutrienti è di solito più limitata e
irregolare, ed è difficile ricreare le
interazioni con altri organismi (microbi e
altri) che si verificano nel sito originale.
In alcuni casi, il confronto della
composizione microbica di un
campione ambientale mediante
osservazioni microscopiche e analisi
degli isolati in colture pure mostrava
che, anche adottando ingegnose
tecniche di selezione e arricchimento,
solo una piccola frazione dei
microrganismi originali poteva essere
coltivata.
 Cause della non coltivabilità dei
microrganismi ambientali

 Il terreno approntato non contiene tutti i

nutrienti necessari.
 Il terreno è troppo ricco.
 Il terreno contiene sostanze tossiche per il
microrganismo.
 L’atmosfera utilizzata non è adatta.
 il microrganismo è incapace di crescere in coltura
pura.
 Esempio di un sito inquinato
Sito inquinato da un particolare combustibile e dove sono presenti
microrganismi in grado di degradarlo.
I batteri crescono,
Terreno di coltura minimo, combustibile alcune componenti
come principale fonte di carbonio. del combustibile
scompaiono.
L’analisi della popolazione batterica evidenzia la presenza di tre o quattro
tipi di microrganismi rispetto alle centinaia presenti nel suolo inquinato.

Spesso dopo la fase di crescita nel terreno di arricchimento non si

riescono ad isolare le componenti microbiche sullo stesso terreno
agarificato.
Questo risultato fa pensare che più di un microrganismo partecipi alla
reazione di degradazione contribuendo in maniera specifica e
differenziata: separando i microrganismi si impedisce il processo
degradativo e la crescita batterica.
Queste cooperazioni microbiche sono definite consorzi.
 I consorzi

Nei consorzi è attivo un fenomeno definito sintrofia.

La sintrofia è l’interazione tra due o più microrganismi

che rende possibile la degradazione di un substrato che
nessuno dei singoli microrganismi sarebbe in grado di
utilizzare.
Il problema è di tipo energetico.
Un primo microrganismo compie la prima parte della
reazione di degradazione che è energeticamente
svantaggiosa (valore positivo di energia libera), per cui il
processo non andrebbe avanti. Ma se il prodotto di questa
prima reazione viene utilizzato come substrato da un
secondo microrganismo la reazione torna ad essere
energeticamente vantaggiosa (valore negativo di energia
libera); il processo degradativo procede.
Analisi della composizione di una
comunità microbica

E’ necessario adottare nuovi strumenti di

analisi di comunità microbiche che
permettano di evidenziare la presenza di
tutti i componenti, anche di quelli che
risultano, per quanto detto in precedenza,
difficilmente isolabili e coltivabili in
laboratorio.

Si può utilizzare l’analisi di sequenza

dell’rDNA 16S.
 Analisi molecolare di comunità microbiche
Fasi (1, 2, 3 e 4) dell’analisi di
biodiversità di una comunità microbica
mediante PCR.

1.

2. 1. Clonaggio della popolazione di amplificati in un vettore

2. Trasformazione di un ospite batterico
3. Selezione trasformanti
4. Purificazione DNA vettore
5. Sequenziamento

3.

I campioni 1, 2 e 4 hanno una

4a. 4b. banda (gene) comune, mentre
i campioni 2 e 3contengono
una banda unica.

Sequenziando le bande di amplificato si costruisce un’albero filogenetico.

 Analisi delle sequenze amplificate

1 2 3

Profilo DGGE Le bande principali vengono L’analisi filogenetica

escisse e sequenziate identifica i microrganismi
Costruzione di alberi filogenetici utilizzando
i dati di sequenza
Il possibile risultato dell’analisi di una
particolare comunità microbica
 Sequenze tipizzanti
L’analisi delle sequenze di RNA ribosomiale ha rivelato la
presenza di sequenze tipizzanti (signature sequences). Sulla
base di queste sequenze possiamo progettare oligonucleotidi
che sono specifici per gruppi di batteri (per es., genere,
specie oppure ceppo). Queste oligonucleotidi possono
essere usati come sonde specifiche (sonde filogenetiche).

L’oligonucleotide viene marcato con un colorante

fluorescente e diventa una sonda che viene usata con cellule
batteriche permeabilizzate così che possa penetrare
all’interno della cellula e legarsi al bersaglio: l’RNA
ribosomale nei ribosomi. In seguito all’ibridazione della
sonda le cellule diventano uniformemente fluorescenti e
possono essere osservate al microscopio a fluorescenza.
 Sonde oligonucleotidiche

In teoria molte sequenze differenti possono

essere usate come sonde per analisi
filogenetiche.

Queste sequenze devono avere l’unica

caratteristica di essere uniche a livello
tassonomico desiderato.

Nell’analisi a livello di genere e a volte di

specie, vengono preferenzialmente utilizzate
le sequenze di geni dell’RNA ribosomale,
spesso quelle dell’rRNA 16S.
 FISH

La tecnica che utilizza le sonde fluorescenti su cellule

intere viene detta FISH (fluorescent in-situ hybridization)
e può essere applicata direttamente a cellule in coltura o
in ambiente naturale.
La tecnologia FISH è ampiamente usata in ecologia
microbica e diagnostica clinica. In ecologia, la FISH può
essere impiegata per l’identificazione microscopica e per
rintracciare i microrganismi direttamente nell’ambiente,
consentendo di acquisire migliori conoscenze sulla
composizione delle comunità microbiche e sul ruolo di
specifici microrganismi in processi naturali.
 FISH di un campione di flora batterica mista (E. coli,
Bordetella e Legionella) mediante una sonda batterica
aspecifica (verde) e una sonda specifica per Legionella
(rossa).

Legionella Bordetella

E. coli