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METODI SPETTROFOTOMETRICI
 Radiazioni elettromagnetiche (1)
Una radiazione elettromagnetica è una perturbazione elettromagnetica che si propaga
nello spazio.
Le onde elettromagnetiche sono oscillazioni periodiche che si propagano nello spazio
trasportando energia.

Parametri che caratterizzano la propagazione delle onde:

• Lunghezza d’onda (l): distanza tra due punti adiacenti in fase (ad esempio tra due
massimi consecutivi)
• Frequenza (n): numero di vibrazioni nell'unita di tempo
• Periodo (T): tempo occorrente per compiere una oscillazione completa (o per
percorrere uno spazio pari alla lunghezza d'onda)
T = 1/ n
• Velocità di propagazione (c): nel vuoto è pari a ca. 300000 Km/s
 Radiazioni elettromagnetiche (2)

Frequenza e lunghezza d’onda sono inversamente proporzionali:

l = c/ n

Le onde elettromagnetiche possono essere classificate in base a frequenza e lunghezza

d’onda, e rappresentate nello spettro elettromagnetico:
 Radiazione visibile
La radiazione visibile rappresenta la parte dello spettro elettromagnetico compresa tra le
lunghezze d’onda di 380 nm (violetto) e 740 nm (rosso).
Ad ogni λ in questo intervallo il nostro cervello associa un colore dell’arcobaleno.
 Interazione radiazione-materia

Quando la luce interagisce con un solido o un liquido possono avvenire tre fenomeni:
assorbimento, riflessione e trasmissione. Per la legge di conservazione dell'energia, la somma
delle quantità di energia assorbita, riflessa e trasmessa è uguale alla quantità di energia
incidente.
Dunque solo una parte dell'energia radiante che incide sul corpo viene assorbita, dato che
una parte viene riflessa e una parte trasmessa.
 Cromofori
Non tutte le sostanze sono in grado di assorbire radiazioni in quantità significativa. Un
cromoforo è una sostanza in grado di assorbire radiazioni a determinate lunghezze
d’onda.
Molte sostanze naturali ed artificiali si presentano al nostro occhio colorate pur
essendo illuminate da una luce bianca. La luce bianca è in realtà una luce
policromatica, cioè un miscuglio di radiazioni di diversa frequenza. Ciò avviene in
quanto queste sostanze assorbono selettivamente le componenti della radiazione
luminosa a particolari lunghezze d’onda. La parte di luce che viene assorbita
corrisponde ad alcune lunghezze d'onda che vengono così sottratte alla parte di luce
che viene riflessa o trasmessa.

La luce riflessa o trasmessa dai cromofori si

presenta quindi colorata del colore
complementare a quello assorbito.
Ad esempio una provetta contenente
sangue si presenta rossa al nostro occhio
perchè l’emoglobina contenuta nel sangue
assorbe selettivamente la luce verde.
Al crescere della quantità di colorante la
soluzione assume un colore sempre più intenso.
• se una superficie riflette tutta la luce che la investe apparirà di colore bianco
• se invece assorbe tutta la luce che la investe apparirà di colore nero
• quando una superficie è trasparente e quindi lascia passare la luce (es. acqua o
vetro) essa viene definita incolore.
 Monocromatore (1)
Un monocromatore è un dispositivo che scompone un singolo fascio di luce
policromatica in più fasci di luce monocromatica (che contiene cioè onde di una sola
frequenza), permettendo così di analizzare l'intensità in funzione della lunghezza d'onda.
Ad esempio, la luce “bianca” è in realtà un miscuglio di radiazioni di diversa frequenza.
Quando un raggio di luce passa da un mezzo ad un altro viene deviato (fenomeno detto
“rifrazione”), e l'entità della deviazione dipende dalla lunghezza d'onda del raggio incidente.
Il rosso che ha la minore frequenza (e la più grande lunghezza d'onda) subisce la minore
deviazione, il violetto, che ha la maggior frequenza (e la più piccola lunghezza d'onda)
subisce la maggior deviazione.
Quando un raggio di luce bianca colpisce un prisma di vetro viene scomposto in diversi
colori, come nell'arcobaleno.
Una radiazione di un solo colore ottenuta tramite dispersione, caratterizzata da una ben
precisa lunghezza d'onda, viene detta monocromatica.
 Monocromatore (2)
Nel monocromatore la luce policromatica entra da una fessura; tramite un sistema
ottico viene inviata ad un prisma che scompone il fascio. Una seconda fenditura raccoglie
poi il fascio di una determinata lunghezza d'onda.
 Spettrofotometria
La spettrofotometria è una tecnica analitica basata sull’impiego dello spettrofotometro,
uno strumento in grado di misurare quantitativamente la frazione di luce, ad una data
lunghezza d’onda, che attraversa una soluzione liquida o un gas.

La spettrofotometria è basata sull’assorbimento di

radiazioni luminose nella regione spettrale compresa tra
200 nm e 900 nm da parte di soluzioni o di gas
 Principio di funzionamento dello spettrofotometro

Una lampada produce una radiazione luminosa contenuta nella regione vicino-IR/VIS/UV
(tipicamente una lampada a scarica in gas deuterio per l'IR e particolari lampade ad
incandescenza per l'UV/VIS).
La radiazione viene guidata attraverso un monocromatore che separa dallo spettro
complessivo la radiazione di una particolare lunghezza d'onda, la cui intensità (I0) viene
misurata attraverso un sensore luminoso.
La radiazione alla lunghezza d’onda prescelta passa attraverso il campione che deve
essere sottoposto alla misurazione. Attraversato il campione, l'intensità rimanente della
radiazione (I) viene misurata mediante un sensore luminoso.
 Assorbanza e Trasmittanza

La conoscenza dei valori di I e I0 consente di calcolare l’assorbanza o la

trasmittanza alla lunghezza d'onda in esame.

Trasmittanza: T = I/I0

La trasmittanza è una grandezza adimensionale che può assumere valori

compresi tra 0 e 1

Assorbanza: A = log(I0/I) = log (1/T)

L’assorbanza è una grandezza adimensionale che può assumere
qualunque valore maggiore di zero.
 Un liquido che si presenta verde al nostro occhio non è in grado di assorbire luce
verde. Se attraversato da luce verde avrà trasmittanza alta ed assorbanza bassa.

Se il liquido è attraversato da luce blu, questa sarà in parte assorbita: dunque la

trasmittanza diminuisce e l’assorbanza aumenta.
 Legge di Lambert e Beer

I0: intensità della luce incidente (ad una

lunghezza d’onda fissata)
I0 I
I: intensità della luce trasmessa

Assorbanza: A = log(I0/I)
L
Si dimostra che, se la concentrazione del cromoforo non supera un certo
limite, l’assorbanza della soluzione liquida è proporzionale alla
concentrazione stessa.
A
A = C  L e da cui: C=
L e
L: lunghezza del cammino ottico
C: concentrazione in moli/L del soluto in grado di assorbire la luce (cromoforo)
e: coefficiente di estinzione, riferito ad una specifica lunghezza d’onda
 Determinazione del coefficiente di estinzione

La costruzione della retta di taratura viene effettuata preparando soluzioni

del cromoforo a concentrazioni note, e misurando l’assorbanza di ciascuna di
esse alla lunghezza d’onda prescelta.
La pendenza della retta interpolante coincide con il coefficiente di
estinzione del cromoforo (relativo alla lunghezza d’onda prescelta).

Retta di taratura per il calcolo del

coefficiente di estinzione

A = C  L e
l = l*