Determinazione del coefficiente di estinzione (con Excel)

Unità di misura

𝐴
𝐴 =𝐶⋅𝐿⋅𝜀 𝐶=
𝐿⋅𝜀

L: lunghezza del cammino ottico, cm

C: concentrazione del cromoforo, moli/L
e: coefficiente di estinzione, L/(mole cm)
 Esercizio n. 1 (legge di Lambert e Beer)
Una proteina è caratterizzata da un coefficiente di estinzione e280 pari a 28500 L moli-1cm-
1. Una soluzione contenente la proteina ha assorbanza pari a 0.17 a 280 nm. La

lunghezza del cammino ottico è pari a 1 cm.

• Calcolare la concentrazione della proteina, assumendo che sia valida la legge di
Lambert e Beer.
• Calcolare quante moli della proteina sono presenti in 1 ml di soluzione.
• Se il peso molecolare della proteina è pari a 12300 Da, calcolare quanti mg della
proteina sono presenti in 1 ml di soluzione.

soluzione
A 0.17 moli
C= = = 5.96 10−6
L  e 1cm  28500 L L
moli  cm
moli
N moli = C V = 5.96 10−6 10−3 L = 5.96 10−9 moli
L
g
N g = N moli  PM = 5.96 10−9 moli 12300 = 7.33 10−5 g = 7.33 10− 2 mg
mole
 Esercizio n. 2 (legge di Lambert e Beer)
Una soluzione contenente una proteina alla concentrazione di 10-4 moli/L
ha assorbanza pari a 0.42 a 280 nm. Una seconda soluzione contenente la stessa
proteina ha assorbanza pari a 0.55 a 280 nm. Determinare la concentrazione della
proteina nella seconda soluzione, assumendo che sia valida la legge di Lambert e Beer.
La lunghezza del cammino ottico è pari a 1 cm.
.

soluzione
A 0.42 L
e= = = 4200
L  C 1cm 10−4 moli moli  cm
L
A 0.55 − 4 moli
C= = = 1.3110
L  e 1cm  4200 L L
moli  cm
 Esercizio n. 3 (legge di Lambert e Beer)
Una proteina è caratterizzata da un coefficiente di estinzione e280 pari a 33000 L moli-1cm-
1. Quanti grammi della proteina bisogna aggiungere a 30 ml di acqua affinché

l’assorbanza a 280 nm sia pari a 0.35? La lunghezza del cammino ottico è pari a 1 cm. Il
peso molecolare della proteina è pari a 18000 Da. Si assuma che sia valida la legge di
Lambert e Beer.

soluzione
A 0.35 moli
C= = = 1.06 10−5
L  e 1cm  33000 L L
moli  cm
moli
N moli = C V = 1.06 10−5  0.03L = 3.18 10−7 moli
L
g
N g = N moli  PM = 3.18 10−7 moli 18000 = 5.73 10−3 g
mole
 Deviazioni dalla legge di Lambert e Beer

Al crescere della concentrazione del soluto si verificano deviazioni notevoli con

conseguente scarsa attendibilità del dato analitico.
La legge di Lambert-Beer è valida solo al di sotto di un valore di soglia.

Se la concentrazione della soluzione da analizzare supera la soglia di linearità,

prima della misura la soluzione va diluita.
 Spettri di assorbimento

Lo spettro di assorbimento rappresenta l’andamento dell’assorbanza al variare della

lunghezza d’onda della luce che attraversa il corpo. Ogni composto ha uno spettro di
assorbimento caratteristico.
Criteri di scelta della lunghezza d’onda (1)
 Effetto della concentrazione sullo spettro di assorbimento

Al crescere della concentrazione della sostanza cromofora, lo spettro sarà caratterizzato

da valori di assorbanza più elevati. Ad ogni lunghezza d’onda corrisponde un valore
diverso del coefficiente di estinzione (e)
 Scelta della sorgente luminosa

• Range visibile/vicino infrarosso (λ=350-2200 nm): lampada

ad incandescenza (tungsteno, quarzo, iodio)

• Range ultravioletto (λ=160-380 nm): lampada a

scarica di un gas (deuterio)

Nella lampada a scarica le molecole di un gas,

come il deuterio, se sottoposte ad una differenza di
potenziale elettrico liberano elettroni (negativi) e
formano ioni (positivi), che emettono luce.

Gli spettrofotometri commerciali in genere contengono una lampada ad incandescenza

ed una lampada a scarica di gas.

• In alternativa si utilizza una lampada a xenon che emette una radiazione nel visibile
e nell’ultravioletto (λ=160-380 nm):
 Scelta del contenitore del campione da analizzare

– Il contenitore dei campioni da analizzare (cuvetta) non deve assorbire luce alla
lunghezza d’onda alla quale viene effettuata la misura
– Deve avere una geometria semplice, con cammino ottico ben definito (in genere 1 cm)
I materiali utilizzati dipendono dalla lunghezza d’onda della radiazione:

» Quarzo - (150-3000 nm): utilizzabile sia nel visibile che nell’ultravioletto

» Vetro – (375-2000 nm): utilizzabile solo nel visibile
» Plastica – (380-800 nm): utilizzabile solo nel visibile (cuvette usa e getta)

Cuvetta Cuvetta con tappo Cella a flusso continuo

 Tipi di spettrofotometro

• Spettrofotometri a singolo raggio – nel determinare lo spettro di una sostanza, per ogni
misura (per ogni λ) si deve ripetere l'azzeramento contro il bianco, oppure registrare
prima lo spettro del bianco, poi lo spettro del campione ed infine sottrarre al secondo il
primo (procedura macchinosa)

• Spettrofotometri a doppio raggio – produce due raggi, identici per lunghezza d’onda ed
intensità, uno attraverso il campione e l'altro attraverso il bianco, per cui si ha un
confronto continuo tra l'assorbanza del campione e quella del bianco.
 Spettrofotometro per micropiastre (1)

Micropiastra (inglese: microplate, microwell) –

piastra che contiene un numero elevato di
microprovette disposte su una matrice rettangolare.

L’impiego di micropiastre consente di svolgere

rapidamente un gran numero di analisi attraverso
appositi strumenti, sia manuali che automatici.
 Spettrofotometro per micropiastre (2)

Lo spettrofotometro per micropiastre consente di analizzare rapidamente tutti i campioni

contenuti in una micropiastra. La misura dell’assorbanza viene effettuata in parallelo, ed
è possiile programmare lunghezze d’onda, eventuali diluizioni, tempertura.
 Metodi di determinazione spettrofotometrica
• Determinazione diretta dell’analita
– Soluzione con un solo cromoforo: lunghezza d’onda corrispondente alla max
assorbanza, possibilmente in un picco largo
– Soluzione con un più cromofori: lunghezza d’onda tale da evitare
sovrapposizione degli spettri

• Determinazione spettrofotometrica dopo trasformazione dell’analita in un’altra

sostanza cromofora
 Esempio di soluzione con un solo cromoforo:
soluzione con blu di metilene

Il blu di metilene è un colorante abbastanza diffuso, che dissolto in

soluzione acquosa assume un’intensa colorazione blu scuro. Non
assorbe alle lunghezze d’onda corrispondenti al blu (tra 400 e 500 nm).
Per la determinazione spettrofotometrica di una sostanza la scelta della lunghezza d'onda va
fatta in modo che:
• l'assorbanza sia massima, dunque il coefficiente di estinzione sia massimo (per
aumentare la sensibilità della misura: se l'assorbanza è alta è possibile rilevare quantità
piccolissime di sostanza)
• sia al centro di un picco largo (per aumentare la precisione della misura, in modo che
piccole variazioni di lunghezza d'onda comportino errori minimi sulla misura
dell'assorbanza).

Curva di calibrazione del blu di metilene a 660 nm

 Esempio di soluzione con un solo cromoforo:
soluzione di bilirubina
La bilirubina è un pigmento di colore arancione contenuto nella bile. La concentrazione di
bilirubina (bilirubinemia) è utilizzata per evidenziare disfunzioni epatiche (p.es. ittero). Non
assorbe alle lunghezze d’onda corrispondenti al giallo e al rosso (tra 560 e 700 nm).

Bilirubina
Curva di calibrazione della bilirubina 450 nm
 Esempio di soluzione con un solo cromoforo:
soluzione di rosso congo

Il congo red è un colorante usato nelle analisi istologiche. Non assorbe

alle lunghezze d’onda corrispondenti al rosso (tra 600 e 700 nm).

Rosso congo
Curva di calibrazione del rosso congo a 496 nm
 Soluzioni con più cromofori

Nel caso di miscele di più sostanze cromofore, gli spettri si sovrappongono,

rendendo impossibile determinare la concentrazione di un singolo componente.
La scelta della lunghezza d’onda, per la determinazione di una singola sostanza,
cadrà su una lunghezza d'onda dove le altre sostanze assorbono il meno possibile.
 Esempio di soluzione con più cromofori:
soluzione con NAD+ e NADH

NAD +
H H

Extinction Coefficient
20 NADH

(cm -1 M-1 x 10-3)

CONH 2 CONH 2

15

10
N N

R R
5

NAD NADH
260 300 340 380
wavelength (nm)

Le molecole di NAD+ e NADH, pur avendo una struttura abbastanza simile,

presentano degli spettri di assorbimento abbastanza diversi.
La concentrazione di NADH può essere ottenuta misurando l’assorbanza ad una
lunghezza d’onda maggiore di 300 nm, dove le molecole di NAD+ non assorbono le
radiazioni.
Curva di calibrazione del NADH a 340 nm