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Acido malico

Si preleva il sangue dal paziente: malato (sale dell’acido malico), si aggiunge l’enzima (malato deidrogenasi).
Il malato reagendo con NAD+ si trasforma in piruvato + NADH.
Malato rappresenta A, NADH rappresenta B. Di questa possiamo conoscere la concentrazione finale (letta a
340nm).
L’asintoto orizzontale bisogna raggiungerlo per poter calcolare la concentrazione di NADH, quindi si conosce
quella del malato.

Colesterolo
Determina la formazione di placche che possono ostruire le arterie.
Colesterolo si trasforma in colestenone che è una sostanza cromofora in grado di assorbire luce (in questo
caso a 240nm).
Il colesterolo reagisce con l’ossigeno; l’enzima aggiunto è il colesterolo ossidasi.

Glucosio
Reagisce con ATP (esochinasi); nella seconda reazione si aggiunge NAD (glucosio-6-fosfato deidrogenasi).
Per fare avvenire la reazione aggiungiamo ATP e NAD, la concentrazione di questi reagenti deve essere
maggiore del glucosio per essere sicuri che tutto il glucosio si consumi. Se aggiungiamo ATP in quantità
minore alla fine si esaurisce l’ATP e il glucosio non si trasformerà nel prodotto desiderato NADH. Come
facciamo a conoscere la concentrazione di ATP da aggiungere? La concentrazione di ATP deve essere
maggiore dei limiti massimi del glucosio che è presente nel sangue.
La concentrazione finale di NADH (letta a 340nm) corrisponde a quella iniziale del glucosio.

Fruttosio
Avvengono tre reazioni diverse (esochinasi, fosfoglucosio isomerasi e glucosio-6-fosfato deidrogenasi) in
serie che portano al prodotto finale di NADH. Quindi concentrazione finale di NADH uguale alla
concentrazione iniziale di fruttosio.

Ammoniaca (reagente)
È prodotta dalla degradazione degli amminoacidi nel corso della digestione; è una sostanza tossica rimossa
grazie all’azione del rene, tramite l’urina.
I reagenti sono oltre all’ammoniaca, l’alfa-ketoglutarate e NADPH. Delle 6 sostanze coinvolte, solo una è
otticamente attiva: NADPH, reagente (340 nm). L’enzima è glutammato deidrogenasi.
A t=0 la concentrazione di questa sostanza non è 0, ma è massima. Quando la reazione inizia,
progressivamente le concentrazione dei reagenti si riducono, di conseguenza anche l’assorbanza si ridurrà
nel tempo. Bisogna fare la differenza tra il valore iniziale di NAPDH e valore finale.
Etanolo (due reazioni)
La reazione è catalizzata dall’alcool deidrogenasi; il reagente aggiunto è NAD+. L’etanolo viene trasformato
e uno dei prodotti è l’NADH (340nm). Ma poiché la reazione non è irreversibile, la concentrazione finale di
NADH non corrisponde a quella iniziale dell’etanolo. Si considera quindi una seconda reazione in grado di
consumare tutto l’etanolo. Man mano che si forma l’acetaldeide nella prima reazione, noi la consumiamo
con la seconda reazione (aldeide deidrogenasi), e la concentrazione di acetaldeide sarà prossimo a zero.
L’etanolo quindi si consumerà totalmente come se la reazione fosse irreversibile. Si produce tra i prodotti
anche NADH. Poiché ci sono due reazioni simultanee, per ogni mole di etanolo che si consuma, si formano
due moli di NADH (1 nella prima reazione e 1 nella seconda reazione). Quindi quando calcoliamo il valore
finale dell’assorbanza e tramite la legge di Lambert e Beer otteniamo la concentrazione di NADH. Se
dividiamo per due la concentrazione finale ottenuta riusciamo ad ottenere la concentrazione dell’etanolo.
Con reazioni reversibili bisogna accoppiare alla prima reazione una seconda reazione che consente alla
reazione di diventare irreversibile (etanolo deve consumarsi totalmente per poter individuare la
concentrazione).
Fosfatasi alcalina (determinazione enzima)
Prevede due reagenti: PNPP (paranitrofenilfosfato) ed acqua, i prodotti ottenuti per l’effetto catalitico sono
due. Uno dei prodotti (paranitrofenolo e acido fosforico) assorbe luce a 400nm. Nel caso in cui vogliamo
misurare la concentrazione dell’enzima, quando si preleva la concentrazione di sangue, bisogna solo
aggiungere i reagenti, non l’enzima, perché di esso vogliamo conoscere la concentrazione.
Immaginiamo di aver prelevato un campione di sangue e si aggiunge il PNPP (il sangue contiene già acqua),
quando aggiungiamo il PNPP avviene la reazione la cui velocità dipende dalla concentrazione dell’enzima. Si
segue nel tempo l’andamento dell’assorbanza. In questo caso non siamo interessati all’asintoto orizzontale,
ma abbiamo bisogno della pendenza iniziale della reazione. Tramite Micaelis-Menten si calcola la
concentrazione di enzimi. Si tratta di test più veloci perché non dobbiamo aspettare l’asintoto. La pendenza
della retta si può calcolare con Excel.

Analisi della transaminasi (determinazione enzima) + (due reazioni) + (reagente)


Ne esistono due: la prima SGOT (con malato deidrogenasi), la seconda SGPT (con lattato deidrogenasi).
La prima catalizza una reazione che non ha sostanze cromofore né tra reagenti né tra prodotti. Quindi la
reazione si accoppia ad altre reazioni in modo da arrivare ad una reazione in cui sia coinvolta una sostanza
cromofora (in questo caso NADH). L’ossaloacetato da prodotto della prima reazione diventa reagente della
seconda reazione. Accoppiando le due reazioni si può capire che la velocità di reazione della prima è uguale
alla velocità della seconda. Misuriamo a vari tempi i valori dell’assorbanza (stiamo seguendo il consumo di
un reagente, ovvero NADH, il reagente della seconda reazione. Si calcola sempre la pendenza della curva,
che rappresenta la derivata dell’assorbanza, che se dividiamo per il coefficiente di estinzione, otteniamo la
velocità di reazione (derivata concentrazione).

Per la transaminasi SGOT, funziona allo stesso modo (cioè ci sono due reazioni, perché non c’è nessun
reagente o prodotto cromoforo nella prima reazione). Troveremo comunque un diagramma assorbanza-
tempo negativo, da cui poi si deduce la concentrazione della transaminasi.

Gamma – Glutamiltrasferasi (determinazione enzima)


Il prodotto fotoassorbente è la gamma-glutamilgliciglicina a 400nm

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