06/07/22

PCR tipizzazione allele 4 su campioni:

Gliead: 10/11/12/13/14/15/16/17/18/19

Ultimo protocollo risale a Simone in data 23/06/21

Controllo interno: COL5A1 (667 bp)

Alleli 4

COMPONENTI MIX 1X MIX 14X

H2O 12.75µl 178.5µl

Bu er Wonder Taq (5X) 5µl 70µl

F-366 (10µM) 1.5µl 21µl

R-143 (10µM) 1.5µl 21µl

COL5A1 F 1µl 14µl

COL5A1 R 1µl 14µl

Wonder Taq (5U/µl) 0.25µl 3,5µl

Volume Finale 23µl 322µl

Controllo Positivo: 23µl Mix + 2µl DNA G5 (10ng/µl)

Controllo negativo: 23µl Mix+ 2µl DNA G4 (10ng/µl)
Bianco: 23µl Mix+ 2µl H2O
Campioni: 23µl Mix+ 2µl DNA campione (10ng/µl)
PCR (termociclatore Aurogene Life Touch)

95°C X 3’
95°C X 20” |
59°C X 20” |==> 40 cicli
72°C X 20” |
72°C X 2’
10°C

Preparare un gel di agarosio al 2% TAE

Marcatore: 6µl di 100 bp DNA ladder (Promega)+ 1,5 µl di blu di bromofenolo
Caricare: 10µl PCR + 1,5µl di blu di bromofenolo
Controllo+
Controllo-
Campioni
Bianco

1
ff