IGIENE DEGLI ALIMENTI

Prof. Marco Guida

(4° lez) 27-05-2008

NOTA: non è una sbobinatura, sono solo appunti.

MOST PROBABLE NUMBER

La differenza fra un terreno liquido e un terreno solido è relativa al fatto che in quest’ultimo è presente
l’agar, mentre nel primo no. L’agar non ha nessuna funzione per la crescita microbica, ma è solo un
substrato per far solidificare un terreno. I terreni liquidi non consentono di isolare batteri o colonie. In tale
terreno non è neanche possibile osservare le caratteristiche fenotipiche quali forma, colore, contorno della
colonia, f___________ l’odore può essere discriminante.
Il metodo del MPN richiede un secondo passaggio (di conferma). Una volta individuate le provette positive,
si preleva 1 mL di campione e lo ripassiamo in un altro terreno contenuto in un’altra provetta. Si tratta di un
terreno selettivo, magari il brillantine-preed brooth. In questo terreno viene aggiunta bile, che inibisce la
cresita dei Gram+. Nella prova di conferma si esegue una sola replica per ciascuno dei 10 campioni
(aliquote iniziali). Dopo 24 h a 37 °C si osservano le provette positive.

Di norma si tende a individuare 3 diverse diluizioni del campione che viene analizzato in più repliche (3 o 5).
Questo perché all’aumentare del numero di repliche il risultato (statistico) diventa più verosimile. Per
individuare le 3 diluizioni ed effettuare le 5 repliche utilizziamo dei contenitori dalle dimensioni opportune.
Nell’es. del lucido si fa riferimento ai coliformi e, per rivelare la loro presenza sii inseriscono nelle provette
le campanule di Duram che raccolgono i gas provenienti dalla fermentazione del lattosio operata dai
coliformi. Oltre a ciò si osserva anche un intorbidimento del brodo di coltura (abbiamo cioè due indizi di
crescita).

A questo punto si esegue la prova conclusiva all’interno di capsule Petri contenti terreno solido (terreno di
Levin, per i coliformi). Tecnica dello strisciamento: una tecnica di isolamento, eseguita con un’ansa. Dopo
24 h a 37 °C dallo striscio di osserva la presenza di colonie tipiche. A questo punto siamo quasi certi di aver
riconosciuto il MO d’interesse. La prova definitiva (ufficiale) è data solo da prove biochimiche e/o
genetiche. Le prove biochimiche consistono nella crescita o non crescita su terreni selettivi, quelle
genetiche consistono in una PCR per il riconoscimento genetico.

10 mL 1 mL 0,1 mL
1° prova (presuntiva) 4 3 3
2° prova (conferma) 3 2 1
3° prova (conclusiva) 3 1 1
negativi 2 4 4

I risultati dell’ultima riga vanno moltiplicati per il volume del campione nella formula di Thomas.
Quindi, 2 ∙ 10 mL; 4 ∙ 1 mL; 4 ∙ 0,1 mL. La somma di questi tre prodotti dà il valore di N.

FORMULA DI THOMAS

P
X=
√ NT
È riferita ad 1 mL (non a 100 come da figura). Se si vuole ottenere il numero di germi per 100 mL bisogna
moltiplicare per 100.
T è il volume totale del campione insemenzato; quindi 5 ∙ 10 mL + 5 ∙ 1 mL+ 5 ∙ 0,1 mL = 55,5 mL.
1
Tabella (p. 16 in basso)
Fornisce l’MPN sulla base delle triplette ottenute. Es. 3-1-1 => MPN/100 mL =2, con un limite di confidenza
compreso fra 4 e 0,5. Essa non risponde alle nostre esigenze perché abbiamo usato volumi differenti.
Quindi ne usiamo un’altra.

Tabella (p. 17 in alto)

Per la tripletta 3-1-1- ottengo un MPN = 75.

TECNICA MPN VANTAGGI

I nitrati fanno crescere i coliformi ma impediscono la fermentazione.

D. lgs. N° 31 del 2 febbraio 2001

Non fa riferimento a terreni specifici ma direttamente alle norme ISO. La norma precedente (31/2001)
indicava nell’allegato le ricette per fare il terreno e la relativa metodica analitica. Con questo decreto non
viene fornita la ricetta ministeriale e la metodica, ma direttamente le norme ISO (nata vot). Es. la norma ISO
per l’ E.coli si fa riferimento alla ISO 9308-1 (non chiederà mai i numeri!). Questa norma non fornisce un sol
terreno, ma vari terreni diversi fra loro, in particolare 5 terreni diversi per E.coli. Analogamente, per gli
Enterococchi, ce ne sono 2, mentre invece Pseudomonas uno solo.

ISO … CEN …

ISO 9308-1 Escherichia coli (vedi solo per avere un’idea, non è da sapere)

DETERMINAZIONE DELLA CARICA BATTERICA MESOFILA

Per i terreni solidi, è necessario fare un passaggio preliminare che consiste nel trasferire i batteri
dall’alimento ad un terreno liquido. Un tempo si usava il pestaggio, oggi si usa invece lo stomacher
(omogeneizzatore a pale). Un campione dell’alimento da analizzare viene inserito in un sacchetto di plastica
sterile e viene poi aggiunta dell’acqua distillata o una soluzione fisiologica. Lo stomacher omogeneizza il
campione schiacciando il campione con movimenti laterali, avanti/indietro e rotatori. I limiti del pestaggio
sono due: l’omogeneizzazione non è ottimale e il surriscaldamento poteva inibire la crescita dei MO o
stressarli (injured). Lo stomacher invece mantiene la temperatura sempre al di sotto dei 50-60 °C.

RICERCA DEI CLOSTRIDI SOLFITO-RIDUTTORI

Sono batteri anaerobi, si utilizzano pertanto delle giare di anaerobiosi, ermeticamente chiuse ma che
consentono di modificare la concentrazione di CO 2 mediante catalizzatori per la produzione di CO 2.

2
CONOSCIAMO L’HACCP
Per poter analizzare un alimento bisogna campionarlo e ricercare i MO nelle unità campionarie. Dall’analisi
di questi possiamo definire l’alimento come edibile o non edibile.
L’HACCP è un sistema che tende a individuare i punti critici attraverso i quali è possibile tenere sotto
controllo la contaminazione batterica. Tale sistema non si applica solo agli alimenti, ma a qualsiasi
metodica per la quale è necessario tenere sotto controllo i rischi: ad es. esiste una metodica HACCP per
l’igiene delle piscine. Questo perché le contaminazioni non sono solo di tipo biologico, ma possono essere
anche chimiche e fisiche.
L’HACCP fu messa a punto per la prima volta negli anni ’60 dalla NASA, in occasione dello sbarco sulla Luna.
Dagli USA si è poi rapidamente diffusa prima in Canada poi in Gran Bretagna. In Italia è stata recepita solo
negli anni ’90 ed è stata attuata alle soglie del 2000.

DEFINIZIONI
Punto di controllo semplice (CP)  individua la fase critica di un processo.
Punto critico di controllo (CCP)  oltre ad individuare la fase critica consente anche di intervenire al fine di
minimizzare l’eventuale contaminazione dell’alimento.

es. nella cottura di carne “alla fiorentina”, il punto critico di controllo (CCP) è il cuore della fetta, che deve
raggiungere una temperatura > 64 °C per qualche secondo. Oppure la temperatura dei frighi => la
conservabilità varia.

Limite critico: è il valore oltre il quale non possiamo più consentire la manipolazione del prodotto o la sua
commercializzazione.
Verifica: possono essere semestrali, annuali, biennali. Dipendono anche dall’acquisto di nuovi macchinari.

NORMATIVE QUADRO PER LA TUTELA ….

l’HACCP è stata da poco inglobata nel pacchetto igiene per gli alimenti. Tale pacchetto è un regolamento
messo a punto dai paesi comunitarie e prevede, analogamente all’HACCP, un sistema di autocontrollo.