Corso Di Biologia Molecolare e Cellulare

Enrico Colombo
Biologia molecolare e cellulare
Biologia molecolare e cellulare 1
Indice
CORSO DI BIOLOGIA MOLECOLARE E

CELLULARE
II semestre 2007/2008
Prof.ssa Marina Colombi
Enrico Colombo
Introduzione.
La Biologia lo studio degli esseri viventi sulla terra, delle loro
strutture, dei loro meccanismi vitali.
Individua delle caratteristiche comuni e procede alla classificazione
degli esseri viventi e allapprofondimento delle specifiche
caratteristiche di ogni regno, classe, specie.
I procarioti sono cellule estremamente semplici, per quanto riguarda

levoluzione. Il loro materiale genetico non racchiuso in alcun tipo di
involucro, ma immerso nel citosol.
Le cellule eucariotiche invece, possiedono un nucleo che racchiuso
in un involucro, la membrana nucleare, che scambia informazioni con il
citoplasma della cellula.
Le cellule eucariotiche formano due grandi regni dei viventi:
Per essere vivente si intende un qualsiasi sistema molecolare in grado

di nascere, crescere, dar vita a nuovi viventi con caratteristiche simili.
Ciascun vivente pu raggiungere questo obbiettivo solamente perch

in possesso di un materiale genetico, che contiene in s tutte le
caratteristiche dellindividuo.
La vita permessa da complessi meccanismi che avvengono a livello

delle macromolecole biologiche, che sono formate sostanzialmente da
pochi elementi chimici, con caratteristiche idonee alla vita:
-
carbonio
ossigeno
idrogeno
azoto
zolfo.
I regni
La teoria dellevoluzione ha permesso di individuare le tappe con cui
avvenuta la formazione dei singoli individui. La classificazione, quindi,
avviene su scala evolutiva e parte inizialmente in una divisione per
stadio macroevolutivo.
Si possono individuare due grandi regni cellulari: procarioti ed
eucarioti.
protisti: sono cellule eucariotiche che permangono nello stadio

unicelulare e non si associano in organismi complessi.
Organismi pluricellulari: sono dei complessi di cellule
specializzate e differenziate, che assieme concorrono per il
mantenimento e lespletazione della vita.
Levoluzione ha portato gli individui pluricellulari a suddividersi in tre

grandi regni:
-
animali
vegetali
funghi
Lorigine della vita sulla terra.

4,6 miliardi di anni fa, latmosfera della terra era molto differente
rispetto a quella che si presenta adesso.
Latmosfera terrestre era composta da:
-
vapore acqueo (H2O)

anidride carbonica CO2.
Monossido di carbonio CO.
Idrogeno molecolare H2.
Azoto molecolare N2.
Inoltre, la forte presenza di radiazioni UV permetteva la produzione di:
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-
Ammoniaca NH3.
acido solfidrico H2S.
metano CH4.
Formazione di molecole organiche.

Nellatmosfera terrestre di quegli anni, vi era totale assenza di
ossigeno libero (O2), quindi la possibilit di formare molecole
organiche senza andare incontro ad ossidazione.
Vi erano, oltre allassenza di ossigeno, altre condizioni molto favorevoli
alla formazione di molecole:
-
presenza di enormi fonti energetiche: cerano innumerevoli

vulcani, tempeste di scariche elettriche, radiazioni ultraviolette
(UV) e continui bombardamenti da parte di meteoriti.
Presenza di precursori chimici: cera acqua sottoforma di
vapore, minerali inorganici che fungevano da catalizzatori
(rocce argillose e numerose bocche idrotermali e sulfuree), ad
esempio Zn e Fe.
Tempo sufficientemente lungo: queste condizioni si protrassero
per un tempo adeguato.
Lesperimento che prov la probabilit della formazione di molecole

organiche da elementi inorganici fu fatto da due coppie di scienziati in
due epoche differenti:
-
1920, da Oparin e Haldane

1950, da Miller e Ury, da cui prese il nome.
Lesperienza di Miller e Ury, consisteva nel simulare, allinterno di

unampolla le condizioni dellatmosfera primordiale:
-
misero vapore acqueo, metano, ammoniaca e idrogeno.

Li bombardarono con delle scariche elettriche.
Il risultato fu sorprendente: si trovarono degli amminoacidi, piccoli acidi

nucleici, altre piccole molecole organiche.
Questa dimostrazione permette di formulare la teoria dellorigine della

vita:
-
le prime molecole organiche si sono formate in piccole lagune

in seguito si accumularono in ci che venne definito brodo
primordiale.
Dal brodo primordiale si rese possibile la formazione di macromolecole

quali proteine, RNA, DNA, zuccheri, ecc
La polimerizzazione, in assenza di O2, avvenne su rocce argillose e in
prossimit delle sorgenti sulfuree:
-
si univano i monomeri con leliminazione di una molecola

dacqua.
La reazione era catalizzata dai numerosi elementi metallici
presenti nelle rocce argillose, come zinco e ferro, rame
metallico, magnesio, ecc
Nascita dei viventi.

Grazie alla formazione dei polimeri di maggiori dimensioni, questi, si
associano, dopo un lunghissimo lasso di tempo. La prima cellula
procariote comparse circa 3,5 miliardi di anni fa:
-
ebbero origine i procarioti che vivevano facendo respirazione

anaerobia.
Erano organismi eterotrofi, molto semplici.
Successivamente divengono autotrofi, ovvero capaci di
sintetizzare le proprie molecole vitali.
Gli eucarioti comparvero circa 2 miliardi di anni orsono, secondo la

teoria simbiotica, per internalizzazione e fusione di batteri, cloroplasti,
mitocondri:
-
questi iniziano la produzione di ossigeno molecolare

Pian piano, si forma latmosfera odierna, ricca di ossigeno e di
azoto.
Col passare del tempo si estinguono gli anaerobi e nascono gli
organismi a respirazione aerobica.
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In queste modalit si ha la nascita della vita, che dallacqua, si sposta

sulla terra ferma.
Il genoma umano.
dogma centrale della biologia.
Ciascun essere vivente ha una peculiarit, un proprio ciclo vitale, che
scritto nel suo codice genetico:
-
racchiude il progetto biologico di ciascun individuo.

Ogni patrimonio genetico unico.
Il patrimonio genetico costituito da una o pi molecole di
acido desossiribonucleico, il DNA.
Il dogma centrale della biologia, in cui racchiuso il progetto biologico

di ciascun individuo, riassume le seguenti tappe:
-
il DNA pu duplicare s stesso (replicazione) o codificare per

RNA (trascrizione)
lRNA codifica per le proteine (traduzione).
Il corretto funzionamento di uno di questi meccanismi pu causare

aberrazioni cromosomiche, le quali possono avere sia effetti positivi
che negativi:
-
evoluzione
malattie genetiche.
La vita garantita dal DNA, che codifica per le proteine, le quali

svolgono tutte le azioni di catalizzazione e di funzionamento per la
sopravvivenza di ogni cellula.
Gli acidi nucleici

Il genoma di un individuo linsieme di geni e di informazioni circa la
sua struttura e le sue funzioni, con i relativi meccanismi che le
regolano.
Negli anni 40 sinizi a porre il quesito della natura chimica del
patrimonio genetico umano. Era chiaro, che il patrimonio genetico
dovesse risiedere in una qualche struttura molecolare.
Risult, dopo esperimenti condotti da numerosi ricercatori, che il
genoma di qualsiasi cellula era composto di molecole di DNA: acidi
desossiribonucleici.
Prima della scoperta della struttura della molecola di DNA da parte di
Watson e Crick, era chiaro che il DNA era formato da una unit
chimica chiamata nucleotide, formato da:
-
Uno zucchero pentoso (a cinque atomi di C).

Un gruppo fosfato posizionato in posizione 5 sullo zucchero
Una base azotata.
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Zuccheri pentosi
Nel caso della molecola di DNA, lo
zucchero fondamentale il D-2
ribofuranosio, altres detto
desossiribosio, poich deriva dalla
deidrossilazione del carbonio 2 del
ribosio.
Le purine sono due, identiche sia nel DNA che nellRNA, e sono:
-
adenina
guanina
altrettanto chiaro, oggi, che la

molecola di RNA, che si origina a
stampo dal DNA composta da
ribosio, come zucchero pentoso.
Le pirimidine sono due nel DNA:
Sia nel DNA che nellRNA il

carbonio in 5 esterificato da un
gruppo fosfato, che consentir
anche allaltro anello zuccherino di
legarsi allo zucchero successivo.
NellRNA la pirimidina timina sostituita dalluracile, che differisce per

la mancanza di un metile sul C-2.
Il legame tra il desossiribosio e lo

zucchero successivo avviene
sempre in posizione 3:
I nucleotidi sono delle strutture formate da uno zucchero pentoso a cui

si legano una base azotata e un gruppo fosfato.
si vedr che sulla lunga

catena di DNA e di RNA si possono individuare due estremit,
una 3 e laltra 5.
Basi azotate.
Esistono due tipi di basi azotate nei nucleotidi:
-
pirimidine: ad anello singolo.

purine: ad anello doppio, uno esagonale e laltro pentagonale.
citosina
timina
Nucleotidi.
Sono presenti anche pi gruppi fosfato, legati tra loro da legami

fosfodiesterici. Tra questi si pu annoverare lATP (adenosintrifosfato)
e altri nucleotidi di o trifosfato, che svolgono funzioni differenti nella
cellula, non solamente quelle di codice genetico.
La nomenclatura dei nucleotidi prende il nome del nucleoside da cui
parte, cio la parte di molecola formata dallo zucchero e dalla base,
che si lega in posizione 1 sullo zucchero.
Al nome del nucleoside si fa seguire il numero dellatomo di carbonio
cui si lega il fosfato e mono-, di-, tri-fosfato.
Base
azotata
Nucleoside
nucleotide
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Adenina
(desossi)adenosina
(desossi)adenosina-5 monofosfato
Guanina
(desossi)guanosina
(desossi)guanosina 5-monofosfato
Citosina
(desossi)citidina
(desossi)citidina 5-monofosfato
Timina
(desossi)timidina
(desossi)timidina 5-monofosfato
Uracile
Uridina
Uridina-5 monofosfato
Ovviamente, il prefisso desossi- si inserisce qualora lo zucchero che

costituisce il nucleoside sia il desossiribosio.
Le scoperte di Chargaff
Le prime analisi a diffrazione di raggi X dimostrarono che un nucleotide
impilato su un altro nellambito della molecola di DNA occupava uno
spazio verticale di 0,34 nm.
Si sugger inoltre la presenza di una ripetizione ogni 10 nucleotidi,
circa, di 3,4 nm.
Erwin Chargaff, nel 1950, scopr importanti informazioni che permisero
a Watson e Crick di elaborare il modello della molecola:
-
La struttura della molecola di DNA.

I vari nucleotidi si dispongono ordinatamente tra loro, in un filamento
che costituisce la stampella primaria del DNA.
Il filamento singolo di DNA e RNA
Una molecola di oligonucleotide formata da una catena di nucleotidi
che si dispongono in serie, che differiscono solamente per le basi
azotate.
I legami sono di tipo fosfodiesterico e si instaurano tra:
-
il carbonio in 3 di uno zucchero

il fosfato posto in 5 sullo zucchero precedente
Questo tipo di legame permette di individuare una certa polarit nella

molecola di DNA. Si individuano infatti, agli estremi della catena, due
estremit differenti:
-
lestremit 3 in cui si ha un OH
lestremit 5 in cui si ha legato un PO32-.
sment la teoria del tetra nucleotide, che prevedeva che i

nucleotidi si ripetessero con la medesima sequenza di basi, il
che faceva pure dubitare del ruolo informazionale della
molecola.
Studiando i rapporti della composizione in basi dei nucleotidi
scopr che una purina si appaia sempre con una pirimidina,
nello specifico, in coppie:
o Adenina - timina
o Guanina - citosina
Era dunque presupposto, che la molecola era composta da coppie di

basi che si legavano tra loro.
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Il modello di Watson e Crick

Anche sulla base dei dati elaborati da diffrattometrie a raggi X da parte
di Franklin e Wilkins, i due scienziati che scoprirono la struttura della
molecola di DNA poterono formulare la loro ipotesi.
Il modello prevedeva:
-
la molecola composta da due catene di nucleotidi.

Le catene si avvolgono a spirale formando una doppia elica
destrorsa.
I due filamenti scorrono in direzioni antiparallele, uno da 5 a 3,
laltro da 3 a 5.
Lo scheletro formato dalle molecole zucchero fosfato

zucchero fosfato, situato allesterno. Il fosfato porta una
carica negativa alla molecola.
Le basi sono impilate una sullaltra con un decorso
perpendicolare allasse del filamento.
Le varie basi, seguendo la regola AT CG, sono appaiate
mediante legami idrogeno:
o Gli atomi di azoto legati a C4 della citosina e C6
delladenina sono nella configurazione amminica (-NH2),
piuttosto che in quellimminica
o Gli atomi di ossigeno legati a C4 della timina e a C6
della guanina sono nella forma chetonica (-C=O),
piuttosto che in quellenolica.
Ne consegue che i legami a idrogeno sono facili da scindere e
avvengono in numeri differenti:
o Tre per le coppie G-C
o Due per le coppie A-T.
La larghezza della catena, poich un singolo nucleotide largo
10 nm, di 20 nm.
Lavvolgimento delle due catene avviene con un solco
maggiore e un solco minore. Nel solco maggiore si inseriscono
le proteine associate al DNA.
La doppia elica, forma un giro completo ogni 10 coppie di basi.
I due filamenti seguono la regola della complementariet tra
basi azotate.
Limportanza del modello di Watson e Crick

Affinch il materiale genetico sia effettivamente portatore
dellinformazione, deve soddisfare a tre fondamentali funzioni:
1) deposito dellinformazione genetica: deve contenere le
istruzioni precise per il mantenimento e lespressione dei
caratteri dellorganismo.
2) Auto duplicazione ed ereditariet: il DNA deve essere in
grado di essere trasmesso alla progenie.
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3) Espressione del messaggio genetico: deve poter stabilire
lordine con cui alcuni amminoacidi che codificano per proteine
o enzimi, vengono espressi. Deve regolare il centro direzionale
delle attivit cellulari.
Dal punto di vista del primo e del secondo punto Watson e Crick
avevano azzeccato:
-
la sequenza di basi azotate codificava per amminoacidi

corrisposti nellordine in cui comparivano nel peptide
corrispondente. Un certo numero di basi sarebbe un gene.
Anche per quanto riguarda la replicazione. Le due catene si
slegano e ognuna funge da stampo per la cellula figlia. Il DNA
risulterebbe quindi un materiale semiconservato.
Per quanto riguarda la regolazione dellespressione genica e altre

specifiche funzioni regolative a livello cellulare, se si accetta la
proposta di Watson e Crick, ogni futura teoria sul DNA deve essere
coerente con tale modello.
Vi da aggiungere che la conformazione del DNA come descritta da
Watson e Crick non lunica possibile, ma quella pi stabile che
riguarda il DNA inattivo o in particolari condizioni.
Questa forma detta B-DNA, mentre ne esistono altre, tra cui la forma
A e la forma Z:
-
la forma A sempre una doppia elica destrorsa ma con un

passo pi elevato
la forma Z un avvolgimento sinistrorso e irregolare, senza
solchi difformi.
Ordine e lunghezza dei nucleotidi

Quanto DNA nelluomo
La unit di misura del DNA sono le coppie di basi. Un filamento di DNA
contiene miliardi di coppie di basi, infatti sono utilizzati i multipli del B:
chilo base (kb)

megabase (Mb)
gigabase (Gb).
Nel DNA umano sono presenti circa 6 gigabasi:

-
equivale a circa 60 libri di 600 pagine, ciascuna con circa 1000

caratteri per pagina.
come sono ordinati i nucleotidi

Le sequenze di basi portano in s linformazione genetica. Tutta
linformazione contenuta in un nucleo detta genoma.
Lordine con cui le basi si dispongono stato dato dallevoluzione, che
attraverso la selezione naturale ha selezionato gli individui che
possedevano sequenze pi vantaggiose.
Ogni specie ha generalmente un assetto nucleotidico proprio.
I nucleotidi, allinterno del DNA sono ordinati con specifiche sequenze
che portano informazioni per la codifica delle proteine:
-
geni: sono sequenze di nucleotidi che codificano per una

proteina.
Cassette di sequenza con raggruppamenti specifici: sono
delle stringhe ripetute che portano informazioni non codificanti,
funzionali alla regolazione dellespressione genica o
allassunzione della conformazione della molecola stessa di
DNA.
Cassette di sequenza specifiche sono le TATA box, ad esempio, che

sono facilmente scindibili poich hanno per lunghi tratti solo due
legami idrogeno da scindere:
-
sono segnali riconoscibili da proteine specifiche.

Attraverso queste sequenze il DNA in grado di interagire con
le proteine specifiche per la sua regolazione, duplicazione,
espressione, ecc
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i geni
cosa sono i geni?
Un gene una specifica sequenza di DNA che codifica per un RNA
funzionale o per un RNA messaggero, quindi per una proteina.
Il quantitativo di geni presenti in una specie sintomo della sua
complessit:
-
se vi sono pochi geni, lorganismo sar molto pi semplice,

se ve ne sono molti, lorganismo avr specifiche funzioni.
Negli umani (homo sapiens), il contenuto in geni nel nucleo pari al

2% dellintero genoma:
-
il restante 98% ha funzioni strutturali e regolative

i geni sono assai scarsi, se non assenti, a livello dei telomeri e
dei centromeri. Questo permette di evitare errori di delezione
degli estremi del DNA.
In organismi pi semplici, con un minore rapporto geni/basi, il DNA

utilizzato e sfruttato al massimo:
-
possono presentarsi i geni policistronici.
Omologia di sequenza: se due specie possiedono almeno un 20% di

genoma in comune, un indice di origine comune dal punto di vista
evolutivo.
Solamente in seguito, levoluzione introdurr delle differenze speciespecifiche.
Il crossing-over ineguale
Il crossing-over ineguale un sorprendente meccanismo che porta
talvolta alla duplicazione genica, su un filamento, e alla delezione su
un altro.
Levento di crossing-over ineguale avviene quando nella meiosi i

cromosomi omologhi non si appaiano perfettamente, avendo uno
scambio genetico difforme, in cui:
-
un cromosoma possiede un tratto di DNA in pi che pu essere

un gene duplicato
laltro possiede un tratto di DNA in meno, quindi la delezione
dei geni in esso contenuto.
La maggior parte delle duplicazioni viene persa nellevoluzione, ma

alcune si rivelano vantaggiose e passano alla generazione successiva:
-
si origina un gruppo di geni disposti in tandem

successivamente, i geni possono subire delle mutazioni, che li
porta a codificare delle proteine che tra loro sono isoforme.
Sono numerosi i casi in cui le proteine sono delle isoforme, che

formano monomeri a funzione pi specializzata:
-
tubuline
actine
globine,
I loro geni sono disposti in tandem o capita che possano trovarsi, in

seguito, anche su cromosomi differenti (come nel caso dei monomeri
dellemoglobina), a causa di altri eventi sul DNA.
Pseudogeni: geni con sequenze analoghe a quelle funzionali che
hanno subito mutazioni che non gli permettono di funzionare
correttamente.
Perch possono avvenire gli errori?
Le basi azotate, formano i legami idrogeno con lazoto e lossigeno
presenti nella parte interna della catena di DNA.
Gli ossigeni sono normalmente nella conformazione chetonica, ma per
azioni esterne o condizioni chimico-fisiche particolari, si possono
portare alla forma enolica, per quel fenomeno che si chiama
tautomeria cheto-enolica.
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La medesima cosa avviene per le terminazioni dellanello che
possiedono un gruppo amminico, che per eventi chimici o fisici
particolari si possono portare nella forma imminica, per quellevento
che si chiama tautomeria immino-amminica.
Proprio per questa serie di fenomeni possono avvenire le mutazioni,

che coinvolgono le basi azotate:
-
si possono avere appaiamenti scorretti (AC, AG, TC, ecc..) a

seconda della configurazione atomica che si viene a creare sul
margine interno del filamento.
Sono eventi inevitabili, scritti nella natura stessa del DNA.
La molecola di RNA
tRNA: la molecola che porta lamminoacido al ribosoma

durante la sintesi proteica. formato da 76 nucleotidi circa, a
forma di trifoglio, possiede varie anse. Lamminoacido si lega
sullanticodone, un sito di legame sullansa complementare a
quello dellmRNA che passa nel ribosoma, corrispondente
allamminoacido che trasporta, al suo estremo terminale
(estremit 3). Sono circa il15% degli RNA della cellula.
mRNA: un RNA a un solo filamento, anche se pu
effettivamente ripiegarsi a formare un loop, che porta
linformazione per la proteina.
RNA serie U: sono molecole poco frequenti, la cui funzione
non del tutto chiara.
microRNA: sono piccoli frammenti che possono legarsi
allmRNA a formare porzioni di doppio filamento. Sembra che
abbiano la possibilit di inibire un punto di trascrizione.
Struttura e funzioni.
Gli rRNA
La molecola di acido ribonucleico formata da nucleotidi che

comprendono:
Gli rRNA sono gli acidi ribonucleici pi frequenti:
uno zucchero a 5 atomi di carbonio, il ribosio;

un gruppo fosfato legato su 5 del ribosio
una base azotata scelta tra due pirimidine (citosina e uracile) e
due purine (guanina e adenina), legata al carbonio in 1.
LRNA una molecola a singolo filamento, legatosi con legami

fosfodiesterici tra il carbonio 5 di uno zucchero e il 3 del successivo.
Nonostante sia una molecola a singolo filamento, lRNA pu appaiarsi
in vari punti per formare delle strutture particolari che gli permettono di
svolgere le proprie funzioni.
Si classificano vari tipi di RNA, che possiedono funzioni specifiche:
-
rRNA: il pi frequente (80%), che si compone di differenti

frammenti che vanno a costituire i ribosomi.
i tratti di DNA che li codificano sono sequenze mediamente

ripetitive disposte in tandem
esistono vari frammenti di rRNA che portano alla formazione di
un ribosoma, anche con modifiche post-trascrizionali.
Negli eucarioti, gli rRNA che formano un ribosoma, sono:

-
28 S
18 S
5,0 S
5,8 S
Lassemblamento e la modifica di questi rRNA di dimensioni e

caratteristiche differenti porta alla costituzione delle due subunit del
ribosoma eucariotico, con coefficiente di sedimentazione 80 S:
-
60 S (subunit maggiore)
40 S (subunit minore).
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Trascrizione
infatti, incorpora da 20 a 50 nucleotidi alla volta: dietro di s non ha

alcun ibrido, ma la catena di DNA si riavvolge.
La trascrizione un fenomeno per cui dal DNA si trascrive un

filamento di RNA.
Pi polimerasi funzionano contemporaneamente e trascrivono geni

differenti sulla medesima molecola di DNA.
La trascrizione in generale
La DNA polimerasi non ha una velocit prettamente costante nella

trascrizione:
Gli enzimi responsabili della trascrizione, sia in procarioti che eucarioti,

sono detti RNA-polimerasi:
-
sono in grado di assemblare i nucleotidi uno alla volta, a partire

da un tratto di DNA che funge da stampo.
Le RNA polimerasi possono riconoscere e legare delle
specifiche sequenze sul DNA.
pu arrestarsi per vari motivi e riprendere

pi veloce quando ha a che fare con la rottura di basi
appaiate AT, piuttosto che CG sul DNA, poich possiedono un
legame idrogeno in meno.
La RNA-polimerasi si slega quando incontra una sequenza di

nucleotidi sul DNA che porta uninformazione specifica di termine,
detta sequenza di termine.
Le sequenze a cui si lega RNA polimerasi sono definite promotore:

-
affinch le RNA polimerasi si leghino ai promotori necessaria

la presenza di numerosi fattori di trascrizione, delle proteine
ancillari es. GTF.
Il promotore contiene anche informazioni addizionali, ad
esempio il filamento su cui avviene la trascrizione.
La RNA polimerasi muove in direzione 3 >> 5 lungo il filamento di

stampo:
-
il filamento di DNA si srotola localmente

la polimerasi assembla un filamento complementare di RNA
che cresce dal suo 5 in direzione 3. (filamento antiparallelo al
DNA).
La reazione catalizzata dalla RNA polimerasi :

RNAn + nuc-PPP RNAn+1 + PPi
In cui i ribonucleosidi trifosfato vengono idrolizzati in nucleosidi
monofosfati e polimerizzati covalentemente nellRNA corrispondente.
Non appena la polimerasi ha oltrepassato una certa soglia di nucleotidi
funzionali, la doppia elica del DNA si riavvolge. La RNA-polimerasi,
La trascrizione nei procarioti

Nei batteri come E. Coli presente un solo tipo di RNA polimerasi, che
per legarsi correttamente al promotore necessita di alcuni fattori
opzionali, detti fattori sigma ().
La RNA polimerasi batterica formata da un nucleo enzimatico
composto da 5 subunit proteiche (di cui 2 alfa e 2 beta).
Il nucleo enzimatico della polimerasi batterica formato da una sorta
di chele che arpionano in mezzo il filamento di DNA, facendolo
scorrere in un canale carico positivamente.
I promotori batterici si trovano a monte del gene, subito in prossimit di
esso e sono composti da due sequenze di consenso:
-
CAAT box: una sequenza che inizia a -35, sullestremit 3

rispetto al gene, ed un tratto di circa 35 basi
TATA box: la sequenza di consenso che indica precisamente
il punto in cui viene aperta la catena (notare che TATA
formato per la maggior parte da nucleotidi con solo 2 legami
idrogeno, quindi pi facili da scindere).
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Possono esistere, a seconda delle condizioni, differenti fattori sigma.
La sintesi avviene seguendo le seguenti tappe:
1) il fattore sigma interagisce con il promotore, quindi lenzima
completo (2alfa, 2beta e sigma) si legano alla CAAT box
2) lenzima completo, detto anche oloenzima, dopo alcuni
tentativi separa le due catene avvolte di DNA.
3) Dopo che vengono incorporati alcuni enzimi nel complesso di
RNA nascente (ricordare 3 >> 5), loloenzima subisce un
cambiamento conformazionale che lo fa diventare complesso
di allungamento della trascrizione, che si muove poi
processivamente lungo il DNA.
4) La trascrizione si interrompe a livello della sequenza di
termine.
Talvolta il termine della trascrizione avviene ad opera di una proteina
detta fattore rho (), un anello che scorre lungo lRNA neosintetizzato
per poi scindere lRNA poli dal DNA.
Trascrizione negli eucarioti
Le cellule eucaristiche possiedono tre differenti tipi di RNA polimerasi,
ciascuna delle quali sintetizza per un determinato gruppo di RNA.
Questi tre tipi di polimerasi sono identici in tutte le cellule eucariotiche:
-
differiscono dalle procariotiche solamente per la presenza di

alcune subunit aggiuntive, mentre il nucleo resta
sostanzialmente lo stesso.
Le subunit aggiuntive hanno la principale funzione
nellinterazione con i numerosi fattori di trascrizione.
Le proteine accessorie, denominate fattori di trascrizione, svolgono un

ruolo fondamentale nella regolazione e nello svolgimento della
trascrizione negli eucarioti:
-
legame della polimerasi allo stampo

allungamento,
terminazione
inizio della trascrizione,

ecc
I principali tipi di RNA derivano tutti da molecole di RNA-precursori,

detti preRNA, o trascritti primari:
-
un segmento perfettamente complementare a quello del DNA

che funto da stampo.
I trascritti primari sono subito associati a proteine, dopo la copia
dellunit di trascrizione sul DNA.
Lo stadio finale in cui si possono raggiungere tRNA, mRNA, rRNA

viene raggiunto grazie ad operazioni di processing:
-
una sorta di taglia e incolla in cui le catene di preRNA

vengono tagliate e ricucite in punti specifici.
Perch avvenga il processing necessario che vi sia una gran
variet di piccoli RNA, lunghi circa 90-300 basi, e le proteine
che vi si associano.
I tipi di RNA polimerasi eucaristica sono riassunti in tabella:

enzima
RNA di sintesi
RNA polimerasi I
RNA ribosomi ali pi grandi (18, 28, 5,8 S)
RNA polimerasi II
mRNA, maggior parte dei piccoli snRNA e sno

RNA, microRNA e RNA delle telomerasi
RNA polimerasi III
Piccoli RNA, tRNA, rRNA 5S e RNA serie U6.
Sintesi e maturazione degli rRNA

Nelle cellule eucariote l80% dellRNA RNA ribosomiale:
-
i ribosomi sono numerosissimi e devono continuamente

sintetizzare le proteine pi disparate.
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-
Nel DNA le sequenze che codificano per rRNA (dette anche

rDNA) sono sequenze mediamente ripetitive, ripetute circa 100
volte in tandem in 5 macroregioni
Le 5 regioni di rDNA sono responsabili della formazione dei nucleoli:

-
questi contengono le neo codificate subunit ribosomiali

hanno un aspetto granulare, di primo acchito.
Sintesi e precursori di rRNA

Nei nucleoli, seguendo lanalisi che Oscar Miller fece nel 1960, si pu
osservare una grande fibra circolare che risulta composta da una
catena di alberi di natale:
1) i geni che codificano per gli rRNA sono disposti in tandem su
un filamento di DNA
2) lalbero di natale si compone di:
a. tronco: il DNA
b. rami: rRNA neo sintetizzato
c. base dei rami: RNA-poli I.
d. il tratto di DNA compreso tra il primo ramo (quello pi
corto, con sintesi appena iniziata) e lultimo ramo (il pi
lungo, con sintesi completata) si chiama unit di
trascrizione.
3) Le fibrille di rRNA precursore contengono gruppi di particelle
associate, che sono responsabili della formaizone delle
subunit ribosomiali:
a. Proteine
b. RNA
4) Tra le due unit di trascrizione presente una fibra che non
codifica per nessun RNA, detta spacers non trascritto.
Gli spacers non trascritti sono spesso presenti tra i codificanti con
media ripetitivit.
Maturazione dellrRNA precursore.

I ribosomi eucaristici contengono quattro rRNA distinti:
-
subunit maggiore: 28S, 5,8S, 5S

subunit minore: 18S.
Sul DNA vi due sequenze differenti:

-
preRNA: 28S, 18S, 5,8S

rDNA 5s: 5s.
Il preRNA composto da un unico filamento che contiene in s il 28S,

il 18S e il 5,8S, che poi vengono separati ad opera di varie nucleasi.
Le caratteristiche peculiari del preRNA sono:
-
gran numero di metilazioni e residui di pseudouridina.

Vengono aggiunti come modificazioni post-trascrizionali.
I nucleotidi metilati e i residui di pseudouridina sono rimasti sui preRNA

nel corso dellevoluzione sulle sequenze immutate:
-
le nucleasi non tagliano in prossimit dei nucleotidi segnati con

metilazioni
discheratosi: mutazione mortale nellenzima che promuove la
conversione di uridina in pseudouridina.
Nel processo di maturazione, dal trascritto 45S primario di preRNA di

circa 13000 nucleotidi ne rimangono circa 7000 nei tre segmenti
risultanti dalla maturazione.
Gli snoRNA: la maturazione del preRNA avviene grazie allaiuto di
piccolo RNA nucleo lari (snoRNA) che, assieme ad altre proteine
formano le ribonucleoproteine piccole nucleolari:
-
queste snoRNP si associano allrRNA ancora prima del termine

della trascrizione
alcuni possono recidere lestremit 5 del trascritto
altre recisioni sono ad opera di esonucleasi specifiche (circa 12
differenti).
Enrico Colombo
-
Alcuni snoRNP presenti in quantit minore svolgono funzioni

quali:
o Indicare quali nucleotidi vengono metilati sul ribosio
o Indicare quali uridine devono essere convertite in
pseudo uridine.
Gli RNA transfer (tRNA)

Le cellule animali hanno circa 50 tipi differenti di RNA transfer, uno per
tripletta codificante:
-
Questi snoRNP contengono piccole sequenze di RNA, che possono

ibridarsi e formare, per brevi tratti, dei doppi filamenti di RNA con il
neotrascritto.
Il nucleolo non solamente il sito di elaborazione di rRNA ribosomiali,

ma anche quello del montaggio delle due subunit:
vi si associano due tipi di proteine:

o proteine ribosomiali: sono stabili e formano le subunit
o proteine accessorie: si associano in maniera transitoria
e catalizzano le reazioni di maturazione (elicasi x
riarrangiamenti strutturali, esonucleasi, ecc..)
Sintesi e maturazione dellrRNA 5S

Una molecola di rRNA 5S, lunga circa 120 nucleotidi, presente come
componente della subunit maggiore del ribosoma.
Negli eucarioti le molecole di rRNA 5S sono codificate fuori dal
nucleolo, su una serie di sequenze identiche inframezzate a quelle che
codificano per gli altri rRNA:
-
sono codificate dalla RNApoli III.

Vengono poi trasportate nel nucleolo e assemblate assieme
agli altri rRNA
La RNA polimerasi III particolare poich si lega ad un promotore

che si trova allinterno della sequenza che viene trascritta:
-
codifica per tipi differenti di RNA, compreso il tRNA, ma per

questi tipi il promotore si trova a monte
si trovano allinterno del genoma pi sequenze che codificano

per lo stesso tRNA
i geni che codificano per tRNA sono raggruppati in cluster,
ovvero gruppi di sequenze brevi che codificano per differenti
tRNA
la sequenza che codifica per un dato tRNA si trova
generalmente in pi di un cluster.
I tRNA sono trascritti dalla RNA polimerasi III e la sequenza promotrice

si trova allinterno della parte codificante del gene, anzich
allestremit 5.
Il trascritto primario di una molecola di RNA transfer pi grande del
prodotto finale:
-
devono essere rimossi dei tratti sulle due estremit 5 e 3.

Uno degli enzimi che tagliano il pre-tRNA la ribonucleasi P.
Sintesi e maturazione degli mRNA (messaggeri).

Nella trascrizione dei messaggeri eucariotici sono presenti numerosi
fattori, sia sul DNA che a livello di proteine (fattori di trascrizione e RNA
polimerasi):
-
RNA poli II
Promotore distale
o Enhancer
o Silencer
Promotore prossimale
o Pseudo CAAT box
o TATA box
Fattori di trascrizione
o elementi in trans (non sul filamento di DNA)
Enrico Colombo
o elementi in cis (sul filamento che deve essere trascritto).

sequenza di termine.
Il promotore distale
Il promotore distale si compone di sequenze sul DNA che si possono
trovare a notevole distanza dalla sequenza da trascrivere, da -500 a
-10'000.
Possono essere presenti o non esserci. Quando ci sono possono
essere situati sia a valle che a monte del gene.
La sequenza enhancer una sequenza di circa 200 nt che potenzia la
trascrizione:
-
legato a fattori di trascrizione specifici, proteine che si legano

alla sequenza e ne permettono la regolazione.
I silencer sono sequenze a cui normalmente si lega un inibitore, che

quando si slega, al passaggio di fattori di trascrizione, reprimono la
trascrizione dellmRNA o di altri RNA.
Il promotore prossimale
Fattori di trascrizione o elementi in trans

I fattori di trascrizione in trans sono elementi che interagiscono con il
DNA, ma non appartengono al filamento:
-
I pi comuni fattori di trascrizione in trans sono proteine che pinzano il

DNA e ne modificano la conformazione, quali:
-
Il processo di trascrizione avviene in varie tappe, che comprendono:

-
delle pseudo CAAT box,

la TATA box.
sono elementi regolatori in cis, ovvero sul filamento che viene

trascritto
La TATA box una sequenza di nucleotidi ricchi in adenina e timina

posta sul DNA tra -20 e -35:
-
la cassetta di sequenza che indica il punto in cui deve essere

aperta la bolla di trascrizione.
lancoraggio di RNA poli II

la cascata di GTF sulla TATA box
La differenza tra endonucleasi e esonucleasi, quando tutte e due
sono impiegate nel taglio di una sequenza di nucleotidi :
Le CAAT box sono sequenze che consentono il legame delle proteine

che formano il complesso dell RNA polimerasi II:
-
zinc finger,
leucine-zipper
helix turn helix.
Il processo di trascrizione.
Il promotore prossimale si compone di due tipologie di sequenze:

-
si legano agli elementi regolativi in cis (promotore prossimale e

distale)
hanno una struttura quaternaria particolare.
Endonucleasi: sono enzimi che rompono i legami

fosfodiesterici tra due nucleotidi della catena.
Esonucleasi: sono enzimi che depolimerizzano una catena
nucleotidica dalle estremit del filamento.
lelongazione del filamento di pre-mRNA

- il termine della trascrizione.
Lancoraggio di RNApoli II sul filamento dipende dallinterazione di
fattori di trascrizione specifici in trans che si legano allenhancer e al
promotore:
-
questi complessi proteici legati a enhancer e promotore

ripiegano la catena e si legano tra loro
Enrico Colombo
-
formano una trappola sterica per lRNApoli II

permettono la formazione dellenhanceosome, un complesso
proteico di 12 proteine fondamentale per la trascrizione.
Con la formazione dellenhanceosome si ha una cascata di GTF sulla

TATA box:
-
alla TATA box si lega una proteina detta TATA binding protein
(TBP)
Questa proteina richiama numerosi GTF (general transcription
factors) che si legano alla TBP, che sono chiamati TF II
(transcription factors II)
I TF II sono sette proteine che si legano al complesso TATATBP, che permettono il legame della RNA polimerasi II.
Quando la polimerasi si lega, la trascrizione ha inizio e numerosi TF II

si distaccano dal complesso.
Lelongazione quel processo in cui la polimerasi allunga il filamento
di RNA, con la regola della complementariet delle basi rispetto al
DNA.
Il termine della trascrizione avviene quando lRNA polimerasi arriva
alla sequenza TTATTT, che posta circa 25 nucleotidi a monte del 3
del filamento da trascrivere:
-
sullRNA si trascrive la sequenza AAUAAA, che richiama una

endonucleasi che taglia il filamento di RNA dopo il passaggio
della polimerasi.
Con il taglio, si ha il distacco della polimerasi.
Vi sono delle eccezioni alla regola dei promotori con TATA: dei geni
detti TATA-less promoters. Questi, a monte della sequenza, non
hanno una TATA box, ma delle sequenze analoghe ricche in C e G,
che occupano la medesima posizione della TATA:
-
sono pi difficili da aprire

sono derivati da geni ripetuti in tandem
sono per le proteine in cui vi un enorme bisogno in qualsiasi
momento (istoni, rRNA, ecc)
hanno una efficienza generalmente minore per le proteine che

sono rare.
La derivazione di questa tipologia di promotore arcaica ed

eucariotica.
Enrico Colombo
Maturazione del RNA messaggero
Le modifiche che avvengono per la maturazione di un RNA
messaggero sono:
1) capping
2) poliadenilazione
3) splicing
Il capping di un mRNA
Il capping consiste nellaggiunta di una 7-metil-guanosina
sullestremit 5 del filamento di RNA neotrascritto, appena iniziata la
trascrizione:
-
una guanosinatrifosfato (GTP) viene metilata ad opera di

numerosi enzimi in 7-metil-guanosina
la 7-metil guanosina si lega con il suo gruppo fosfato al fosfato
del 5 del filamento di RNA
si ha un legame fosfodiesterico 5 5 invertito al capo dellRNA
nascente.
La funzione del capping multipla:

-
protezione dalle esonucleasi, per impedire che il filamento

venga depolimerizzato
esportazione e riconoscimento dal nucleo al citoplasma
inizio della sintesi proteica, permettendo il riconoscimento al
ribosoma.
Poliadenilazione della coda del mRNA

La poliadenilazione un avvento post-trascrizionale che permette di
portare tranquillamente lmRNA nel citoplasma:
-
dopo la sequenza AAUAAA sul filamento neotrascritto vengono

aggiunti da 50 a 250 nucleotidi di adenina, formando la coda
poli(A).
Questa non codificata da alcun gene, ed aggiunta un

enzima chiamato poli(A)polimerasi.
Le sue funzioni sono di protezione dallazione di esonucleasi e di

trasporto nel citoplasma.
I geni sprovvisti della TATA box non subiscono la poliadenilazione,
poich vengono subito tradotti, appena sono trascritti.
Splicing
Lo splicing un evento post trascrizionale che avviene nel nucleo:
-
comporta la rimozione degli introni dal filamento.
Il procedimento avviene nel seguente ordine:

-
lhnRNA (mRNA nucleare) si associa con un complesso detto

spliceosoma, che riconosce gli introni tagliando le estremit 5
e 3 di questi
lo spliceosoma, poi, riunisce le estremit degli esoni, a dare l
filamento di mRNA maturo.
Nel processo di splicing intervengon numerose molecole:

-
snRNA che con proteine formano le snRNP (ribonucleoproteine

nucleari)
U-RNA, altri complessi ribonucleoproteici.
Lo splicing alternativo un procedimento di regolazione

dellespressione genica che permette la formazione di proteine
differenti ma analoghe a partire da un solo trascritto:
-
avviene nel 60 % dei trascritti

il meccanismo comporta una scelta differente degli introni da
tagliare.
Solitamente la scelta degli esoni avviene in base alla specificit
del tessuto.
Enrico Colombo
Sequenze UTR.
Negli mRNA maturi sono presenti spesso delle sequenze non
tradotte (UTR, untranslated regions):
-
sono regioni che si trovano alle estremit degli RNA

proteggono questi filamenti dalle RNAasi (esonucleasi che
degradano gli introni eliminati)
vengono trascritte, ma non tradotte.
La traduzione
Il codice genetico
Il codice genetico una tabella che mette in relazione le triplette di
nucleotidi su un filamento di RNA con gli amminoacidi corrispondenti
per la sintesi delle proteine.
Le triplette che si trovano sugli mRNA sono dette codoni, che hanno
sequenze complementari sui tRNA, dette anticodoni.
Sul fondo dei tRNA si trovano gli amminoacidi corrispondenti agli
anticodoni, montati sui trifogli di tRNA dagli enzimi amminoaciltRNAsintetasi.
Il codice genetico gode di determinate propriet:
-
degenerato: codoni differenti possono codificare per lo

stesso amminoacido. Fanno eccezione met e trp e i codoni di
STOP.
Non ambiguo: a ogni codone corrisponde perfettamente un
aa o uno STOP.
universale: presente ugualmente in tutti i nuclei di tutti gli
organismi cellulari. Fanno eccezione solamente i mitocondri,
che nel loro unico filamento circolare hanno dei geni con
differenti codici genetici a seconda delle classi di appartenenza
degli organismi.
Mutazioni geniche o puntiformi.

Le mutazioni geniche sono mutazioni che coinvolgono solamente un
nucleotide. Si contrappongono a quelle cromosomiche, in cui si ha la
mutazione di un tratto di nucleotidi consistente.
Enrico Colombo
Le mutazioni sono modificazioni permanenti spontanee del DNA,
dovute alla tautomeria delle basi azotate, in cui si ha lappaiamento
scorretto di determinate basi.
I tipi di mutazione puntiforme sono:
-
sostituzione: la pi frequente, e pu essere casualmente

reversibile. Pu portare a:
o codoni missenso: triplette che codificano per un altro
amminoacido, poco gravi.
o Codoni non senso: codoni che codificano per uno
stop. Hanno una discreta gravit.
Inserzione, delezione o duplicazione: sono spostamenti
reciproci dei due filamenti. Possono provocare delle frame shift,
ovvero lo slittamento dellintera cornice di lettura nel DNA.
Molto spesso si ha un ptc, codone di terminazione prematura.
La struttura tridimensionale della molecola invece presenta una forma

di L rovesciata con due doppie eliche.
In realt non esistono 61 tRNA, tanti quanti i codoni del messaggero,
ma in minore quantit:
-
Pu capitare, che proprio la propriet di essere degenerato del codice

genetico, non porti ad una mutazione significativa:
-
molto spesso, un codone pu trasformarsi in un codone

degenere, che codifica per lo stesso aa, pur essendo differente.
il ruolo dei tRNA.

Gli RNA sono gli intermediari del processo di traduzione:
-
da un lato sono legati ad un aa, formando u aa-tRNA

dallaltro possiedono lanticodone, che pu riconoscere la
sequenza sullmRNA corrispondente allaa.
Bidimensionalmente, le molecole di tRNA hanno una struttura a

trifoglio, con:
-
3 anse in cui non v complementariet delle basi appaiate

quattro bracci in cui le basi si appaiano
La molecola di tRNA presenta inoltre numerose particolarit:
possiedono spesso dei nucleotidi modificati, che permettono il

legame di specifiche proteine.
allestremit 3 hanno sempre la sequenza CCA OH, a cui si
lega laminoacido
sullansa centrale presenta un anticodone formato da una
tripletta complementare al filamento di DNA.
questo reso possibile dalla regola del vacillamento in

relazione alla degenerazione del codice genetico:
o lamminoacido codificato da pi codoni caratterizzato
dalle prime due basi, mentre la terza meno
importante.
o Quindi vi sono tRNA che possono instaurare legami
differenti con la terza base.
Gli aa sono legati covalentemente al tRNA corrispondente da un

enzima chiamato amminoacil-tRNAsintetasi:
-
Ve n uno per ogni aa

Utilizza ATP per formare prima amminoacil-AMP, poi
amminoacil-tRNA e AMP
il legame tra laa e il tRNA un legame altamente energetico,
che permette di attuare facilmente la formazione dei futuri
legami peptidici.
se avviene lappaiamento sbagliato, lamminoacil-tRNAsintetasi
in grado di correggere le bozze, tramite un meccanismo detto
di proofreading.
Enrico Colombo
Il procedimento di traduzione
per gli eucarioti detta sequenza Kozak ed ACCAUGG

per i procarioti la sequenza Shine-Dalgarno, GGAGGA
Il processo di traduzione uno dei processi pi complessi che si

verificano allinterno della cellula, che porta alla sintesi dei componenti
funzionali della cellula stessa: le proteine.
Le sequenze tipo Shine-Dalgarno sono poste allestremit 3

dellmRNA e vengono ricononosciute da una sequenza complementare
presente sul ribosoma.
Per la sintesi proteica sono necessari:
Fattori di inizio. La sintesi, per iniziare necessitano di proteine

solubili, dette fattori di inizio (IF o eIF per eucarioti).
tutti gli amminoacil-tRNA

i ribosomi
lmRNA
proteine con funzioni ausiliarie
cationi e GTP.
Il processo pu essere diviso in varie fasi:

-
inizio della catena

elongazione della catena
terminazione.
Linizio della sintesi.

Affinch il ribosoma si leghi nel punto di lettura corretto, esso deve
riconoscere la sequenza dinizio AUG, codone sullmRNA che
codifica per la metionina:
-
una volta che il ribosoma ha riconosciuto il punto dinizio si

posto nellappropriato modulo di lettura.
Proseguir leggendo una tripletta alla volta e codificando e
sintetizzando gli amminoacidi del peptide.
Il processo avviene in varie fasi che si sintetizzano di seguito.

Fase 1. La subunit minore del ribosoma si porta al sito dinizio.
LmRNA si lega prima alla subunit minore del ribosoma, con il suo
codone AUG, che la sequenza dinizio.
Per riconoscere la sequenza dinizio corretta e non una allinterno della
catena che codificherebbe per la proteina i ribosomi si avvalgono di
una sequenza che si trova 5 o 10 nucleotidi prima dellAUG:
Nei procarioti si trovano:

-
IF1: facilita lattacco della subunit minore allmRNA e

impedisce un aggancio errato.
IF2: lega GTP richiesta per legare il primo amminoacil-tRNA
IF3: impedisce il legame prematuro della subunit maggiore.
Negli eucarioti son presenti invece 8 IF.

Fase 2. Il primo aa-tRNA si inserisce sul ribosoma. AUG lunico
codone che codifica per la metionina. Infatti, la metionina sempre il
primo amminoacido incorporato in una catena peptidica, anche se
nella maggior parte dei casi viene poi rimosso enzimaticamente.
Nei procarioti solitamente la met N-terminale viene formilata, mentre
negli eucarioti non si presenta formilazione.
Esistono per due distinti tRNA:
-
uno per la metionina dinizio

e laltro per incorporare la metionina in una catena.
La sintesi inizia quando il tRNAMet iniziatore si lega ad AUG sullmRNA:

-
si lega a IF2
vengono rilasciati IF1 e IF3.
Fase 3. Assemblaggio del complesso dinizio completato. Quando

il tRNA iniziatore si lega alla subunit minore si ha lidrolisi di GTP su
IF2:
-
si lega la subunit maggiore

si rilascia il complesso IF2 GTP.
Enrico Colombo
Particolarit negli eucarioti. Negli eucarioti gli eIF sono 12, ma
anche in questo caso si ha il legame di eIF2-GTP, quando il tRNA
iniziatore si lega alla sequenza dinizio.
La subunit minore cerca quindi il cap metilguanosinico sullestremit
5 di mRNA e avviene il legame.
Quando il complesso 43S che si formato dallaggancio del cap, il
messaggero scorre fino alla sequenza Kozak (5 CCACCAUGC 3):
-
viene raggiunto il codone appropriato AUG

eIF2-GTP viene idrolizzato e
la subunit maggiore si lega al complesso.
Il ruolo dei ribosomi. I ribosomi sono macchine molecolari che con

funzione meccaniche ripetitive permettono lo scorrimento del filamento
di mRNA, la selezione dei tRNA, la formazione dei legami peptidici,
tramite lutilizzo di energia rilasciata dallidrolisi di GTP.
La peculiarit dei ribosomi il contenuto di rRNA, che permette:
-
accuratezza della traduzione

lega fattori proteici
seleziona i corretti tRNA
polimerizzano gli amminoacidi.
Ogni ribosoma presenta tre siti in cui i tRNA scorrono nei vari passaggi
della sintesi e dellelongazione della catena peptidica:
-
sito A, amminoacidico
sito P, peptidico
sito E, di uscita, exit.
I tRNA che si legano a questi siti hanno:

-
codone legato alla subunit minore >> decodificazione delle

informazioni contenute nellmRNA
sito amminoacidico a contatto con la subunit maggiore >>
catalizza la formazione del legame peptidico.
Elongazione
La elongazione il vero e proprio processo di costruzione della catena
polipeptidica della proteina.
Fase1. Selezione dellamminoacil-tRnA. Quando il tRNA iniziatore
nel sito P, il sito A pronto ad accettare il secondo amminoacil-tRNA.
Per poter essere idrolizzato, lamminoacil-tRNA deve essere legato ad
un altro fattore di elongazione detto EF-Tu-GTP, che possiede GTP:
-
tutti i tRNA legati a EF-Tu possono essere immagazzinati nel

sito A, ma solamente quel tRNA complementare al codone si
lega
quando amminoacil-tRNA-EF-Tu-GTP legato viene idrolizzato
GTP e rilasciato il fattore di elongazione.
Fase 2. Formazione del legame peptidico. I due amminoacidi legati

ai loro tRNA sono vicini luno allaltro e possono reagire tra loro:
-
Lestremo N-terminale dellamminoacido nel sito A reagisce con

il carbonile dellaa nel sito P.
Si forma il legame peptidico catalizzato dalla peptidil
transferasi, complesso enzimatico (ribozima) della subunit
maggiore
A legame formato il tRNA del sito P si distacca
dallamminoacido.
Fase 3. Traslocazione. La traslocazione un processo mediante il

quale il ribosoma slitta di tre nucleotidi sullmRNA:
-
catalizzato da EF-G, che attua una modifica conformazionale

con lutilizzo di GTP.
Si rompono i legami idrogeno e il tRNA con legato il dipeptide si
sposta nel sito P
Il tRNA deacilato si sposta dal sito P al sito E.
Fase 4. Rilascio del tRNA deacilato. Nella tappa finale, il tRNA

deacilato si sposta ed esce dal ribosoma liberando il sito E:
Enrico Colombo
-
nel processo di elongazione vengono utilizzate 2 GTP per ogni

aa.
Ogni ciclo dura circa un ventesimo di secondo.
Il sito A nuovamente libero per poter iniziare un altro ciclo.
Terminazione.
La terminazione ha inizio quando sul messaggero sono presenti uno
dei tre condoni di STOP, che inducono il ribosoma a slegare lultimo
amminoacido dal tRNA nel sito P, anche senza la presenza di un
nuovo tRNA.
Affinch la terminazione abbia fine, necessaria la presenza di fattori
di rilascio, RF o eRF per gli eucarioti, che riconoscono i codoni di
stop.
Quando entrano nel sito A del ribosoma e riconoscono un codone di
stop (UAA, UAG, UGA), inducono la rottura del legame estereo tra
lultimo tRNA e la catena polipeptidica ad esso legata.
Per la rottura del legame necessaria la presenza di un altro EF, EFG, che lega ed idrolizza GTP.
Dispositivi di correzione degli errori
In caso del cambiamento di una base o dellinserzione di un nucleotide
nel mRNA o nel DNA sono facilmente pervenibili delle mutazioni
nonsenso, che comportano la presenza di un codone di STOP
prematuro:
-
le cellule possiedono un meccanismo di sorveglianza

dellmRNA in grado di rivelare la presenza di codoni di stop
prematuri
sono tradotte solitamente una sola volta prima di andare
incontro a distruzione ad opera di un meccanismo chiamato
nonsense-mediated decay o NMD.
LNMD protegge le cellule dalla produzione di proteine tronche e non

funzionali.
Quando si ha lunione tra due esoni ad opera dello spliceosoma, un

agglomerato di proteine detto complesso di giunzione esonica
(EJC), rimane associato allmRNA fino a che non viene tradotto:
-
quando passa nel ribosoma, prima dellingresso, lattivit

elicasica e altre attivit lo rimuovono
se si inserisce un codone di stop prematuro, parte del filamento
resta attaccato al ribosoma con addosso alcuni EJC
quando un mRNA possiede ancora EJC dopo essere stato
tradotto viene identificato come aberrante e distrutto
enzimaticamente.
Poliribosomi
Il filamento di mRNA, quando trascritto, pu esserlo ad opera di
numerosi ribosomi contemporaneamente, poich questi si legano al
cap e si dirigono verso il 3 uno dopo laltro.
Il complesso che si forma con i numerosi ribosomi sul filamento di
mRNA detto poliribosoma.
Enrico Colombo
La replicazione del DNA

La replicazione del materiale genetico un evento unico, che ha
permesso il tramandarsi della vita stessa e levoluzione ad organismi
complessi.
Infatti, la vita in s, non sarebbe potuta progredire se non avesse
conservato il proprio patrimonio informazionale:
-
inizialmente si aveva tramite RNA,

solo successivamente linformazione venne tramandata tramite
DNA.
Teorie sul tipo di replicazione.

La replicazione dei due filamenti di DNA, che sono complementari tra
loro lasciava intendere a Watson e Crick dei diversi modelli di
comportamento re plicativo, che potevano essere:
-
replicazione semiconservativa: ogni doppia elica figlia riceve

met della struttura parentale.
Replicazione conservativa: ogni filamento avrebbe fatto da
stampo per un nuovo filamento. I nuovi si uniscono tra loro e i
vecchi ritornano uniti. Una cellula figlia ha ancora il vecchio
patrimonio genetico.
Replicazione dispersiva: il DNA si replica a tratti, lintegrit dei
filamenti parentali viene dispersa.
Il modello semiconservativo, a seguito degli esperimenti di Mesleson e

Stahl, prevalse:
-
fecero crescere e riprodurre dei batteri in terreno di coltura con

un isotopo pesante dellazoto
quando posero in coltura batteri in terreno neutro, con azoto14, si vide, analizzando la densit dopo centrifugazione, che si
ottenevano degli ibridi pesante-leggero, senza il mantenimento
di una molecola di DNA pesante
lesperimento si conferm valido anche nelle generazioni

successive e si concluse che il DNA si replica con un modello
semiconservativo.
La replicazione nei procarioti

Con lo sviluppo delle tecniche biochimiche di laboratorio, oggi
possibile studiare anche i meccanismi di replicazione del DNA
eucariotico.
Tuttavia, alcuni anni fa, non era possibile fare per gli eucarioti due
passi fondamentali per lo studio del processo di replicazione:
1) avere disponibilit di mutanti incapaci di sintetizzare qualche
proteina necessaria per il processo di replicazione
2) avere sistemi di coltivazione in vitro che consentissero di
studiare la replicazione in cellule purificate di determinate
proteine.
In questo modo, si pot conoscere le proteine che intervengono nella
replicazione dei batteri (circa 30 in E. Coli). Oggi possibile studiare
anche il processo in cellule eucariotiche e si dimostra sensibilmente
simile.
Forcella di replicazione e replicazione bidirezionale.
Nella molecola circolare di DNA double strend batterico la replicazione
inizia in un punto detto origine, in cui sono presenti sequenze dette
oriC:
-
il doppio filamento si apre ad opera di proteine specifiche

si forma la forcella di replicazione.
La replicazione avviene in entrambe le direzioni rispetto allori,
quindi una replicazione bidirezionale.
A livello della forcella di replicazione corrispondono punti in cui:
Enrico Colombo
-
la doppia elica va incontro a separazione dei due filamenti

paterni
i nucleotidi complementari a quelli paterni vengono incorporati
nel DNA della cellula figlia.
La forcella di replicazione si ampia fino a quando i due filamenti neo

sintetizzati si incontrano dalla parte opposta e si staccano dal DNA
paterno.
Le sequenze di origine sono generalmente ricche in T e A, poich sono
pi facili da scindere i legami idrogeno che le tengono unite.
Srotolamento della doppia elica e separazione dei filamenti.
La doppia elica batterica, essendo circolare, presenta il problema dello
srotolamento:
-
quando si apre la forcella di replicazione, infatti, la doppia elica

tende a super avvolgersi a seguito della trazione esercitata
dalle porzioni di filamento scisse allorigine
Il problema di questo eccessivo avvolgimento risolto da un corredo

enzimatico detto di topoisomerasi, tra cui la DNAgirasi:
-
una proteina che in grado di eliminare, in E. Coli, lo stress

torsionale derivato dallo svolgimento dellelica
taglia i due filamenti del duplex, li fa passare dalla parte
opposta e li risalda perfettamente.
Il processo necessita di energia, fornita mediante lidrolisi di
ATP.
Le propriet delle DNA polimerasi

La replicazione del DNA avviene ad opera di enzimi chiamati DNA
polimerasi, che sono presenti in varie forme sia negli eucarioti che nei
procarioti.
Nei procarioti vi sono tre DNA polimerasi principali: la I, la II, la III.
Questultima la principale artefice del processo di replicazione.
Affinch avvenga la reazione di replicazione del DNA necessaria la

presenza di tutti i desossiribonucleotidi trifosfato, che vengono poi
incorporati nei nuovi filamenti (GTP, ATP, CTP, TTP).
Affinch la DNA polimerasi possa formare linizio, sono necessarie due
condizioni:
-
un filamento di DNA da cui copiare i nucleotidi (stampo)

una breve sequenza che fornisce una estremit 3 OH alla
polimerasi, detta sequenza primer.
Solamente una doppia elica con lapertura di una bolla di replicazione

pu soddisfare queste condizioni.
Con la scoperta delle varie DNA polimerasi si vide che lunica direzione
di replicazione consentita era quella della scrittura da 5 a 3 e della
lettura del filamento stampo 3 > 5.
La replicazione semidiscontinua
Entrambi i nuovi filamenti sul filamento stampo vengono sintetizzati in
direzione 5 > 3, poich la polimerasi non capace di sintetizzare nella
direzione opposta.
Nella replicazione il gruppo fosfato del desossiribonucleotide trifosfato
si lega allestremit 3 OH del filamento in sintesi, muovendosi lungo lo
stampo.
Il filamento che viene sintetizzato in maniera continua, secondo la
direzione della forcella di replicazione, detto filamento guida, e
procede senza interruzioni.
Laltro filamento, detto filamento in ritardo, avanza nella direzione
opposta rispetto a quella della forcella di replicazione:
-
viene sintetizzato a frammenti, detti frammenti di Okazaki.

Solo in seguito, la DNA polimerasi si porta indietro per
reiniziare, partendo da una nuova sequenza primer, dalla
forcella replicativa.
Enrico Colombo
-
A quel punto, la sequenza primer verr rimossa e si avr la

sintesi di DNA che si collega al filamento precedentemente
trascritto, grazie allenzima DNA ligasi.
Appunto perch la sintesi del filamento che ha come stampo di DNA la

direzione 5 > 3 avviene a piccoli frammenti di 1000/2000 nucleotidi, la
replicazione viene detta semidiscontinua.
Ma se la DNA polimerasi da sola non capace di dare inizio ad un
filamento, linizio dovuto da un altro particolare enzima, la RNA
primasi:
-
questa sintetizza una sequenza di RNA detta sequenza primer

queste sequenze primer servono come inizio per la DNA
polimerasi, la quale poi inizia dal primer a sintetizzare il
filamento di DNA.
I primer vengono poi rimossi e viene sintetizzato DNA e unito al
filamento mediante DNA ligasi.
stato dimostrato inoltre che i differenti frammenti di Okazaki sono

sintetizzati dalla medesima DNA polimerasi III. Affinch ci avvenga
necessario un meccanismo particolare:
-
Il macchinario che opera a livello della forcella replicativa.

La replicazione richiede non solo lincorporazione dei nucleotidi, ma
moltissimi altri processi che avvengono a livello del DNA.
Uno tra i processi pi complessi lo srotolamento del duplex e il
mantenimento dei filamenti slegati. Questi compiti sono attuati da:
-
elicasi: srotolano il duplex ad elica del DNA mediante lenergia

fornita dallidrolisi di ATP.
Proteine che legano il DNA a singolo filamento (SSB):
coadiuvano lazione dellelicasi legandosi al filamento singolo e
mantenendolo slegato, impedendone il riavvolgimento.
lelicasi si muove in direzione 5 > 3 sul filamento stampo

(DNA) in ritardo
si ritiene che le due DNA polimerasi dei due filamenti si

muovano assieme, legate una allaltra.
Si possono muovere assieme, nonostante si sintetizzi in
direzione opposta, poich sul filamento in ritardo si forma un
occhiello (ansa circolare) che permette di portare il filamento
in cui si sta sintetizzando il frammento nella stessa direzione
del filamento stampo guida (3 > 5 sul DNA)
Questo meccanismo permette alle due polimerasi di muoversi
assieme senza violare il meccanismo della direzione 5 3.
Quando la polimerasi che forma il filamento in ritardo raggiunge
lestremit 5 del frammento di Okazaki sintetizzato durante il
ciclo precedente, abbandona il filamento stampo, sposta
locchiello e si dirige, assieme alla primasi, su un nuovo
stampo.
Strutture e funzioni delle DNA polimerasi.

Lenzima che opera nella formazione del filamento di DNA nella
replicazione di E. Coli la DNA polimerasi III, che parte di un grande
complesso chiamato repli soma o oloenzima DNA polimerasi III,
formato da varie subunit:
-
Lazione dellelicasi avviene in contemporanea con quella della

primasi, poich i due enzimi si associano formando un complesso
detto primosoma:
-
la primasi si lega a intervalli regolari sulla elicasi rilasciando le

sequenze primer.
pinze : Sono pinze che circondano il filamento di DNA e

restano associate allo stampo. Hanno una struttura a ciambella
che formano una pinza scorrevole formata da due subunit.
o Le pinze sul filamento in ritardo vengono costantemente
sostituite ad opera di una pinza caricatore.
Pinza caricatore: pinza legata ad ATP, che permette il cambio
della pinza a livello del filamento in ritardo, al termine della
sintesi del frammento di Okazaki.
Enrico Colombo
-
Polimerasi: la parte funzionale nella sintesi dei nucleotidi sul

complesso enzimatico. Addossata alla pinza .
La DNA polimerasi I ha sostanzialmente alcune funzioni di

riparazione, ma la maggiore funzione che ha quella di rimuovere i
primers.
La DNA polimerasi II invece impiegata interamente nel riparo e nella

correzione del DNA neosintetizzato.
Attivit esonucleasica della DNA polimerasi I
La DNA polimerasi I ha tre tipi di attivit:
-
polimerizzazione
esonucleasica nelle due direzioni.
Lattivit esonucleasica 5 3 viene esplicata quando la DNA poli I

deve rimuovere i primer:
-
degrada le sequenze primer che prima sono state lasciate dalla

primasi.
Dopo aver degradato lRNA primer, la polimerasi sintetizza per la

sequenza mancante al posto del primer un filamento di DNA.
Alta fedelt della replicazione del DNA
Un errore nella replicazione del DNA rappresenta un fatto molto pi
grave rispetto ad un errore di trascrizione su un filamento di mRNA:
-
sullmRNA un errore incide per un solo ciclo sintetico di una

proteina.
Sul DNA invece, si trasforma in una mutazione ereditaria.
A causa della tautomeria cheto-enolica e di quella immino-amminica, le

basi possono essere riconosciute in maniera scorretta dalla DNA
polimerasi, che le prova una ad una:
-
la polimerasi ruota come le dita di una mano, mentre ha il

filamento nel palmo.
Se lappaiamento avviene in modo errato, si ha una

conformazione scorretta, e la polimerasi non pu attuare il
cambiamento conformazionale corretto per lattivit catalitica.
se nel tentativo di appaiamento una base che non rispetta AT
CG in una conformazione tautomerica scorretta si ha un
appaiamento errato,
o la frequenza di uno ogni 10000 nucleotidi incorporati
o le tre polimerasi batteriche possiedono un sito di
esonucleasi 3-5.
o La catena tende automaticamente a spostarsi in basso
verso il sito esonucleasico poich preferisce restare a
filamento singolo.
o Questo meccanismo di correzione di bozze funziona
nel 99% dei casi.
Tuttavia i batteri prevedono anche la possibilit di un altro meccanismo

detto riparazione dellappaiamento scorretto:
-
entra in azione dopo la replicazione

corregge quasi tutti gli errori sfuggiti alla correzione di bozze
abbassa a 10-9 il tasso di mutazione spontanea.
In definitiva, la precisione e la fedelt della replicazione del DNA

dovuta a:
-
accurata selezione dei nucleotidi

immediata correzione di bozze (sito esonucleasico 3-5)
riparazione dellappaiamento scorretto (post-replicazione)
Replicazione nelle cellule eucariotiche

Lanalisi della replicazione nelle cellule eucariotiche stata molto pi
difficile rispetto a quella dei batteri per la maggiore complessit e per i
minori meccanismi a disposizione dei ricercatori.
Enrico Colombo
Oggi, con nuove tecniche e scoperte di metodiche, stato possibile
conoscere pi a fondo la replicazione del patrimonio genetico di una
cellula eucariotica.
Deve quindi esistere un meccanismo che eviti che si apra una forcella
su un filamento che si gi duplicato, che consiste pressappoco in:
-
Inizio della replicazione

La replicazione di un batterio inizia in un solo punto chiamato origine,
mentre nelle cellule degli organismi superiori, che possiedono un DNA
molto pi complesso, avviene in pi punti, detti repliconi:
-
ciascun replicone ha una propria origine di replicazione

apre una forcella replicativa e la sintesi avviene in entrambe le
direzioni.
In una fase S di un ciclo cellulare sono attivi un 10-15% dei
repliconi, che iniziano la loro sintesi nello stesso momento
anche nei cicli successivi.
Probabilmente, nella scelta dei repliconi, implicato lo stato di
condensazione della cromatina e leventuale acetilazione degli
istoni ad essa legati.
Mentre nelle cellule eucariotiche di lievito la replicazione inizia su delle

specifiche sequenze, dette ARS, negli eucarioti dei vertebrati il punto
di inizio non sembra avere delle sequenze preferenziali, ma dipende
probabilmente da:
-
dallo stato di condensazione

dal tipo di modificazione istonica
dallo stato di metilazione del DNA
dal grado di superavvolgimento,
ecc
Restrizione della replicazione a un unico evento per ciclo

cellulare
fondamentale che durante la duplicazione, poich lorigine avviene in
pi punti, ogni parte del genoma venga replicata una volta sola.
un complesso di riconoscimento dellorigine (ORC) lega

lorigine di replicazione e resta associato durante tutto il ciclo
cellulare
proteine autorizzanti (fattori Mcm2 Mcm7) legano lORC,
costituendo un complesso di pre replicazione (pre-RC),
autorizzando linizio della replicazione.
Una ciclina protein-chinasi, la Cdk, durante la fase S resta
attivata ad alta concentrazione durante la fase S della mitosi,
impedendo la formazione di nuovi complessi di replicazione.
Una sola volta per ciclo si ha il legame di una Cdk, quindi non
si avr apertura di nuove origini.
Una volta che il complesso pre-RC stato attivato le Mcm2 e Mcm7 si

attivano e formano un complesso attivo durante la replicazione:
-
si ritiene che possano avere attivit elicasica.

Nei mammiferi, le proteine Mcm si dissociano e restano nel
nucleo quando hanno finito la loro attivit.
Non si possono associare ad un pre-RC gi attivato.
La forcella di replicazione negli eucarioti

La replicazione degli eucarioti praticamente identica a quella dei
procarioti, la replicazione effettiva avviene sempre nello stesso modo.
Gli attori di questo meccanismo non sono proprio gli stessi in termini
molecolari, ma sono totalmente analoghi:
-
elicasi
proteine che si legano al filamento singolo (RPA)
topoisomerasi
primasi
DNA polimerasi (sono maggiori e differenti)
DNA ligasi.
Enrico Colombo
Come avviene nei procarioti, il Dna delle cellule eucariotiche
sintetizzato in maniera semidiscontinua, con differenze minime:
-
il replisoma anche in questo caso formato da un dimero di

DNA polimerasi, che sintetizza con lo stesso metodo i
frammenti di Okazaki (formazione dellansa per rendere
complementari i due filamenti).
I frammenti di Okazaki sono sensibilmente pi corti (150 nt).
Nelle cellule eucariotiche sono finora state individuate cinque DNA

polimerasi classiche, ovvero presenti in tutte le cellule eucariotiche:
-
solamente due di queste 5 non sono coinvolte nella

replicazione del DNA nucleare
o La DNA polimerasi coinvolta nella replicazione del
DNA mitocondriale.
o La DNA polimerasi implicata nei processi di
riparazione del DNA.
Le altre tre DNA polimerasi hanno invece funzioni di sintesi
particolari:
o La DNA polimerasi associata allRNA primasi,
codifica un piccolo tratto di DNA dopo il primer (20 nt)
poi abbandona la replicazione.
o La DNA polimerasi si pensa che sia la principale
polimerasi implicata nella sintesi del DNA. Come nei
batteri, questa formata da:
Una pinza scorrevole, simile alle subunit dei
batteri, chiamata PCNA
Un caricatore della pinza sulla polimerasi
chiamato RFC.
Questa polimerasi completa la sintesi dei
frammenti di Okazaki sul filamento in ritardo, che
poi vengono uniti tra loro da una DNA ligasi.
o La DNA polimerasi ancora non ben definita. Ha
comunque funzione sintetica di nuovo DNA e possiede
un sito esonucleasico per la correzione degli errori.
Come nei batteri, le polimerasi sintetiche ( hanno caratteristiche

triplici:
-
Allungano il filamento neosintetizzato in direzione 5 3

Non possono iniziare replicazione senza un primer.
Possiedono dei siti esonucleasici per la correzione degli errori
di appaiamento.
La funzione delle telomerasi

I frammenti di RNA primer posti alle estremit dei cromosomi lineari
lasciano un gap di DNA non sintetizzato quando sono rimossi dal sito:
-
Nessuna DNA polimerasi in grado di sintetizzare nuovo DNA

su quelle sequenze senza la presenza di un Primer.
Le estremit 3 dei filamenti sono sempre pi corte.
Al margine dei cromosomi sono sempre presenti delle sequenze non

codificanti, dette telomeri, che servono appunto per proteggere
linformazione da delezioni o rimozioni locali nei punti pi esposti:
-
Nelluomo sono formati da circa 100-1500 unit di sequenze

ripetute
ad esempio TTAGGG.
Per ovviare allinconveniente dei buchi di DNA al termine 3 dei

filamenti neo sintetizzati vi sono degli enzimi detti telomerasi:
-
Aggiungono le stesse sequenze di desossiribonucleotidi

trifosfato.
Enrico Colombo
La riparazione del DNA
Riparazione per escissione nucleolitica.
Allinterno della cellula, il DNA la molecola pi importante, ma anche

la pi fragile.
I sistemi di riparazione per escissione nucleolitica (NER) agiscono

attraverso la rimozione di un piccolo tratto di filamento di DNA che
contiene una grossa lesione, quale ad esempio:
Delle alterazioni alle basi azotate o delle rotture nella catena

nucleotidica si possono verificare in qualsiasi momento (una cellula ne
subisce circa 10000 al giorno), ad opera di differenti fattori:
-
agenti chimici
radiazioni termiche
radiazioni ultraviolette
onde elettromagnetiche
ecc
Questo sistema di riparazione pu procedere per due vie:

-
Se queste lesioni non vengono riparate si trasformano

automaticamente in mutazioni, che si trasmettono alla progenie della
cellula.
La cellula ha dei sistemi di riparazione formidabili e molto vari, quasi
capaci di recuperare qualsiasi danno subito:
-
solo 1 lesione su mille circa sfugge ai sistemi di riparazione

cellulare
vi sono numerosi sistemi enzimatici capaci di riparare i danni
subiti dal DNA, che funzionano secondo differenti meccanismi:
o riparazione istantanea
o escissione
La grande propriet che permette al DNA una possibile correzione

delle aberrazioni la sua complementariet delle basi, che permette di
ricostruire il filamento che deve essere corretto su stampo delle basi
del filamento complementare.
Il processo tuttavia complesso e richiede il rimodellamento della
cromatina, poich questa limita laccessibilit ai complessi enzimatici
di correzione.
dimeri di pirimidina
nucleotidi con legati gruppi chimici non propri
via associata alla trascrizione: viene di preferenza riparato il

filamento stampo che contiene i geni che vengono trascritti.
o La riparazione del filamento stampo avviene in
contemporanea alla trascrizione del DNA
o La segnalazione avviene attraverso il meccanismo della
RNA polimerasi.
o I geni che vengono trascritti maggiormente, ovvero
quelli pi importanti, hanno la massima priorit
nellordine di riparazione.
via globale: pi lenta e meno efficiente che corregge i filamenti
di DNA nel resto del genoma.
Il fulcro di questo meccanismo il fattore di trascrizione TFII H, che

legge le sequenze scorrette del DNA durante la trascrizione. Questa
proteina possiede tra le sue subunit due siti elicasici, che qualora
venga ravvisato un errore separano il duplex e inizia il processo:
-
il filamento viene tagliato ai lati della sequenza scorretta dalle

endonucleasi e viene rimosso
la DNA polimerasi riempie il gap
delle DNA ligasi legano a livello dei nicks.
Nei procarioti vi un sistema simile, che ad opera di due proteine

Mut (H, L e S).
Enrico Colombo
Riparazione per escissione di base
Per la rimozione di singoli nucleotidi alterati dovuti a composti chimici
alterati introdotti con la dieta o prodotti dal catabolismo cellulare
interviene un meccanismo chiamato riparazione per excisione di
base (BER).
La BER inizia attraverso una DNA glicosidasi che legge il DNA e
rimuove, attraverso rottura del legame glicosidico, la base scorretta:
-
esistono DNA glicosidasi per ogni possibile base alterata.

La DNA glicosidasi scorre lungo il filamento di DNA facendo
flippare di 180 le basi ed analizzandole
Quando trova una base scorretta, la recide, lasciando soli lo
zucchero e il fosfato.
Il meccanismo, dopo la rimozione della base alterata, prosegue nel

seguente modo:
-
una particolare endonucleasi (AP) taglia lo scheletro del DNA

la DNA polimerasi reinserisce il nucleotide corretto
una DNA ligasi ripara i legami.
Nei procarioti come E. Coli, il meccanismo per excisione di base

avviene ad opera di proteine Uvr A, B e C.
In E. Coli, il riconoscimento del filamento neosintetizzato avviene

grazie alla metilazione del filamento stampo, quindi il complesso
enzimatico di riparazione non pu sbagliare.
Nelle cellule eucariotiche non esiste la metilazione del DNA, quindi
probabile che vi siano altri meccanismi per permettere di riconoscere il
filamento idoneo.
Riparazione delle rotture a doppio filamento

Quando radiazioni ionizzanti attraversano la cellula e colpiscono il DNA
o quando vengono introdotti degli agenti chimici che causano rotture,
pu avvenire che il doppio filamento si rompa.
Le rotture del doppio filamento (DSB) possono essere riparati
attraverso vari meccanismi di riparazione.
Il pi comune meccanismo di riparazione chiamato unione delle
estremit non omologhe (NHEJ), in cui in complesso di proteine
catalizza una serie di reazioni per unire le estremit rotte del DNA:
-
Riparazione degli appaiamenti scorretti.

Si gi visto come nel successivamente alla replicazione del DNA vi
sia un meccanismo di controllo che si chiama meccanismo di
riparazione degli appaiamenti scorretti:
-
questo prosegue risistemando le basi male appaiate che sono

sfuggite alla correzione di bozze fatta dalla polimerasi
riconosce le distorsioni della catena causate dal mal
appaiamento delle basi.
se non possibile appaiarsi al punto corretto intervengono

proteine Ku, che hanno attivit elicasica sui due filamenti e
attivit chinasica
permettono alle due estremit del DNA ss di trovare delle
regioni di micromologia, attraverso le quali i due filamenti si
appaiano.
Le porzioni di filamenti che restano esclusi vengono rimossi.
La DNA ligasi salda i Nick.
Si ha perdita di un tratto di gene.
Enrico Colombo
Un maschio avr una coppia detta XY

Una femmina una coppia XX.
La vita della cellula e la trasmissione del patrimonio

ereditario.
o
o
Il patrimonio genetico umano sta racchiuso nel nucleo e, durante le

fasi di divisione meiotica o mitotica, si organizza in strutture allungate
in cui il filamento di DNA sta ripiegato su se stesso e su uno scheletro
proteico, mediante vari superavvolgimenti.
Le divisioni cellulari
Negli organismi sessuati, le divisioni cellulari differiscono a seconda
del tipo di cellule che si prendono in considerazione:
Queste strutture allungate sono i cromosomi.
Un cromosoma formato da due cromatidi fratelli, dopo che

avvenuta la replicazione del patrimonio genetico nella fase S:
i due cromatidi contengono una molecola di DNA identica

sono il risultato della replicazione del patrimonio genetico.
Sono uniti tra loro in un punto detto centromero, in cui le fibre
del fuso si legano per separare i due cromatidi.
I due estremi dei cromosomi sono detti telomeri.
le cellule somatiche si dividono per mitosi, processo in cui da

una cellula madre 2n derivano due cellule figlie 2n
le cellule sessuali (gameti) sono invece generate dagli oogoni e
dagli spermatogoni mediante meiosi, in cui da un patrimonio
2n, mediante due successive divisioni, vengono generate
quattro cellule figlie con patrimonio aploide n.
La mitosi.
Formazione dellapparato mitotico
Il cariotipo umano
Il corredo cromosomico umano , nelle cellule somatiche, diploide:
-
formato da due coppie di cromosomi omologhi, uno di

origine materna e uno paterna
due cromosomi omologhi contengono le medesime sequenze
di geni e solitamente, solo uno utilizzato come filamento di
stampo per la sintesi delle proteine, laltro di riserva.
LHomo sapiens ha un corredo cromosomico di 22 coppie di

cromosomi omologhi, pi una coppia di cromosomi sessuali:
-
ha in totale 46 cromosomi, 23 derivanti dal padre e 23 dalla

madre.
I cromosomi sessuali differiscono tra maschio e femmina:
Allinizio della fase M:

-
i cromosomi si spiralizzano
si formano i costituenti dellapparato mitotico
Lapparato mitotico si compone di:

-
centrioli
materiale pericentriolare
fuso mitotico (fasci di microtubuli che collegano i due
centrioli)
Allinizio della mitosi i diplosomi (coppie di centrioli disposti

perpendicolarmente) sono gi stati duplicati:
-
sono circondati da unarea tondeggiante detta centrosoma
Enrico Colombo
-
allinizio della mitosi i centrosomi sono circondati da raggi di

microtubuli che formano le astrosfere.
I due centrosomi della cellula si vanno separando e tra loro si
evidenzia una struttura fusiforme, il fuso mitotico.
Il fuso mitotico costituito da due gruppi di microtubuli polari che

partono da ciascun centrosoma e si incontrano al centro del fuso:
-
quando la membrana nucleare scompare, compare un

secondo fuso che parte dai centrosomi e si lega ai cinetocori
dei cromosomi
i cromosomi si dispongono al termine della profuse lungo
lasse equatoriale della cellula, lungo un piano che viene
definito equatoriale, ortogonale alle fibre del fuso.
In metafase completo lapparato mitotico.
Il secondo stadio detto metafase, in cui i cromosomi si trovano

allineati sul piano equatoriale della cellula con i centromero diretti
verso il centro:
-
i cromosomi costituiscono una figura a forma di stella detta

aster o piastra metafasica.
I cromosomi raggiungono il massimo livello di spiralizzazione,
salvo che a livello del centromero.
Ai due cinetocori del centromero di ogni cromosoma sono
collegate le fibre del fuso mitotico che dividono i due
cromatidi
La localizzazione dei cromosomi al piano equatoriale dipende dalla

capacit dei cinetocori di legarsi ai microtubuli del fuso e dallazione di
proteine motore.
La terza fase definita anafase e viene distinta in due sotto-momenti:
Fasi e significato della mitosi
Il primo stadio del processo mitotico denominato profase:

-
nel citoplasma si organizza lapparato mitotico

tutta la cromatina si trova sotto forma di cromosomi al
termine della profase.
Ogni cromosoma appare come un duplice filamento, poich
costituito da due cromatidi fratelli uniti a livello del
centromero.
Verso la fine i nucleoli si disintegrano legandosi ai cromosomi
Si disgrega linvolucro nucleare (si disperde nel reticolo
endoplasmatico o si addossa alle fibre del fuso)
Con il termine prometafase si individua uno stato intermedio che

intercore tra:
-
la dissoluzione dellinvolucro nucleare

lorganizzazione dei cromosomi sul piano equatoriale da
opera dei microtubuli del fuso
anafase I: i cromosomi sono tirati verso i due poli dalle fibre

del fuso, verso i centrosomi. I cromatidi identici si scindono e
ognuno migra verso un polo differente
anafase II: allallontanamento dei cromosomi dal piano
equatoriale si somma anche un allontanamento dei due poli,
che divergono.
Lultimo stadio rappresentato dalla telofase, in cui si ha la

ricostruzione dellinvolucro nucleare:
-
i cromatidi sono diventati cromosomi delle cellule figlie

ogni polo possiede un corredo cromatidico identico
i cromatidi si vanno despiralizzando
si riforma il nucleolo
La formazione della membrana nucleare avviene per la fusione di:

-
lamine defosforilate che ricreano la lamina nucleare (strato

proteico sottostante al nucleo)
vescicole sintetizzate nuovamente nel RER
vescicole appartenenti al vecchio nucleo
Enrico Colombo
Con la formazione dei due nuovi nuclei intorno ai cromosomi figli si
riformano anche i pori nucleari e tutte le proteine di membrana
presenti nel nucleo:
-
lapparato mitotico si va depolimerizzando

i centrioli restano inalterati.
Lultimo processo che completa la divisione delle cellule quello di

citodieresi:
-
la cellula presenta una strozzatura in posizione equatoriale,

ad opera di fibre di actina e miosina disposte a circonferenza
sotto la membrana nucleare.
le membrane si introflettono, si fondono e si staccano le due
nuove cellule con i nuclei figli.
le nuove cellule sono geneticamente identiche, la mitosi un
processo conservativo.
La meiosi
La divisione meiotica avviene esclusivamente per le cellule germinali,
quelle destinate alla formazione dei gameti:
-
lultimo evento di divisione della gametogenesi

ha come scopo la formazione di cellule aploidi, differenti tra
loro per quanto riguarda il patrimonio genico.
La meiosi quindi la base della riproduzione sessuata, che consente

un ampio rimescolamento del patrimonio genico:
-
ha determinato la scelta di questo meccanismo riproduttivo

nellevoluzione
La fonte di diversit tra gli individui figli rispetto ai genitori data da:
-
rimescolamento delle informazioni presenti

unione di due genomi differenti
mutazioni.
La riproduzione sessuale di un individuo data dalla fusione di due

cellule aploidi dette gameti:
-
il gamete maschile lo spermatozoo

il gamete femminile lovulo, una cellula di grandi
dimensioni poich contenente parecchi materiali di riserva.
Lunione tra i due gameti detta fecondazione, che da origine ad una

cellula diploide detta zigote:
-
dallo zigote, per successive mitosi si origina il nuovo

individuo
Le cellule somatiche degli organismi pluricellulari sono generalmente

diploidi:
-
i cromosomi sono sempre presenti in doppia copia

si presentano copie di cromosomi omologhi, corrispondenti
per forma, dimensioni e contenuto genico.
I gameti, dopo la divisione meiotica, possiedono solamente met del

patrimonio genico della cellula diploide che li ha formati:
-
di ciascuna coppia dei cromosomi omologhi viene ereditato

solamente uno
ricostituendosi con il gamete dellaltro sesso, si ricostruisce il
patrimonio genetico diploide nello zigote
Ciascuna delle coppie di omologhi presenti nelle cellule di un

organismo a riproduzione sessuale costituita da:
-
un cromosoma di origine materna

un cromosoma di origine paterna
La meiosi porta alla formazione di quattro cellule aploidi a partire da

una cellula diploide che ha solamente una fase S, mentre vede due
divisioni nucleari consecutive.
Il passaggio di un cromosoma paterno o materno in un gamete
totalmente casuale, cosicch si possono ottenere 223 combinazioni
differenti solamente in un gamete.
Enrico Colombo
Un altro processo di rimescolamento dei geni dato dal crossingover:

-
geni presenti su cromosomi differenti possono in seguito

trovarsi su un solo cromosoma
permette un ampio rimescolamento genico.
N deriva che i gameti di un individuo sono sempre differenti tra di loro

dal punto di vista genetico:
-
si possono avere eventi che danno luogo ad una ampia

variabilit anche tra loro
questo processo aiuta enormemente il processo di selezione
naturale.
IL MECCANISMO DELLA MEIOSI

Il meccanismo della meiosi porta alla formazione di un gamete aploide,
con patrimonio genetico 1n, dopo una sola fase S seguita da due
divisioni nucleari cosecutive.
I processi delle divisioni consecutive sono simili a quelli meiotici
(profase, metafase, anafase, telofase), tuttavia presentano
caratteristiche peculiari. Si parla di:
-
prima divisione meiotica (meiosi I)

seconda divisione meiotica (meiosi II).
Il primo stadio della meiosi I la profase I, che un processo molto

lento che si pu dividere in 5 parti:
-
leptotene: inizio della spiralizzazione della cromatina che si

avvolge in filamenti. I telomeri sono tutti rivolti verso un polo
dellinvolucro nucleare
zigotene: i cromosomi iniziano ad appaiarsi e ogni
cromosoma (formato da una coppia di cromatidi fratelli) si
sovrappone al suo omologo mediante una struttura proteica
chiamata complesso sinaptemale (CS), formando i bivalenti
o tetradi (formati da 4 cromatidi dei due cromosomi

omologhi)
pachitene: i bivalenti si spiralizzano ulteriormente pur
rimanendo gli omologhi appaiati. Avviene il crossing-over.
Diplotene: i bivalenti iniziano a separarsi e rimangono in
contatto solamente nei punti in cui avvenuto il crossingover, detto chiasmo.
Diacinesi: i chiasmi scorrono verso le estremit e si
distaccano tra loro. Scompare linvolucro nucleare e i
cromosomi iniziano a legarsi ale fibre del fuso.
Il secondo stadio lo stadio della metafase I:

-
le tetradi (o bivalenti) si orientano sul piano equatoriale della

cellula
i cinetocori delle tetradi sono orientati verso un polo cellulare
a ogni coppia di omologhi si attacca una fibra del fuso.
La terza fase la anafase I:

-
i due cromosomi di ogni coppia si separano e si muovono

verso i poli opposti
ogni cromosoma ancora formato da due cromatidi fratelli
uniti a livello del centromero.
Segue la telofase I:
-
la cellula di partenza si divide in due cellule figlie, ciascuna

contenente un numero aploide di cromosomi con una
quantit 2c di DNA.
si forma un involucro nucleare
ha inizio la citodieresi
Tra la prima e la seconda divisione meiotica v una intercinesi molto

breve poich i cromosomi non si sono ancora despiralizzate ed
necessario solamente costruire un nuovo apparato mitotico in
ciascuna cellula figlia.
La profase II:
-
i centrioli migrano ai poli opposti della cellula
Enrico Colombo
-
si riforma lapparato del fuso
La metafase II comporta lallineamento del numero aploide di

cromosomi allequatore della cellula.
Con lanafase II i cromosomi figli (cromatidi fratelli) migrano verso i poli

opposti della cellula.
fase M: include il processo di mitosi, in cui i cromosomi si

separano, e di citodieresi.
Interfase: una fase che pu avere varia durata (o essere
addirittura permanente) in cui la cellula svolge le proprie
attivit metaboliche, di sintesi e di duplicazione del proprio
patrimonio genetico.
Il processo meiotico si conclude con la telofase II, in cui:

-
Il ciclo cellulare
si riforma linvolucro nucleare

avviene una seconda citodieresi
la seconda divisione meiotca equazionale, ha cio il solo scopo di

smistare ai gameti la met ordinata dei cromatidi fratelli presenti nelle
cellule della prima divisione.
Fase G2
I quattro gameti che si formano sono tutti geneticamente differenti tra

di loro, poich hanno subito una ricombinazione casuale con lo
scambio di quelli paterni e materni, oltre che al crossing-over.
Fase S
Fase M
Fase G1
Fase G1
Fase S
Fase G2
Fase M
Il crossing-over un meccanismo di ricombinazione che avviene nel

pachitene della profase I:
-
i cromatidi corrispondenti di due cromosomi omologhi

possono subire ricombinazioni, scambiandosi porzioni di
cromosoma tra loro
il punto di incontro detto chiasma.
Vengono scambiati segmenti corrispondenti tra cromatidi non
fratelli appartenenti a cromosomi differenti.
Il ciclo cellulare eucariotico.

In una popolazione di cellule, ciascuna cellula passa attraverso
numerosi stadi ben definiti, che nel complesso individuano il ciclo
cellulare.
Il ciclo cellulare si pu dividere inizialmente in due principali fasi:
Linterfase si compone di tre differenti fasi:

-
fase G1.
Fase S
Fase G2
La fase G1 una fase compresa tra la fase M e la fase S, in cui:

-
la cellula accresce le proprie dimensioni

svolge le sue attivit si sintesi di RNA e proteine.
La fase S la fase in cui la cellula duplica il DNA e sintetizza gli istoni

che devono duplicare il numero di nucleosomi.
Enrico Colombo
La fase G2 la fase che precede la fase M e si costituisce di un
periodo in cui la cellula prepara il proprio apparato mitotico:
-
sintesi del fuso mitotico

formazione dei cromosomi.
In base alla durata e alle peculiarit del ciclo cellulare, che

corrispondono alle funzioni delle cellule, si possono individuare tre
grandi categorie di cellule:
cellule estremamente specializzate (nervose,
muscolari, globuli rossi) che perdono la capacit di
dividersi
cellule che non si dividono in condizioni normali, ma
possono rigenerarsi in seguito a stimoli appropriati
(epatociti, linfociti)
cellule che possiedono normalmente un livello
relativamente alto di attivit mitotica.
La notevole variabilit della durata del ciclo cellulare ha permesso di
individuare una nuova fase particolare, che presente nelle cellule che
temporaneamente si bloccano in fase G1:
-
questa fase, che precede la replicazione del DNA detta

fase G0
in G0 la cellula temporaneamente ferma, si porta in fase S
solamente a seguito di uno stimolo, quando ci possibile.
Meccanismi di controllo del ciclo cellulare

Numerosi esperimenti condotti nel 1970 da Rao e Johnson in
Colorado, dimostrarono che le cellule subiscono meccanismi di
controllo positivo, quindi con presenza di fattori di stimolazione in
due passaggi:
-
dalla fase G1 alla fase S

dalla fase G2 alla fase M
Questi due passaggi erano dunque indotti da fattori che stimolavano,

nel primo caso la replicazione e nel secondo la divisione cellulare
(mitosi o meiosi).
I check-point del ciclo cellulare
Nella cellula sono presenti due punti di controllo principali, che, come
si gi detto, provvedono a verificare che vi siano le condizioni per il
passaggio alla fase successiva.
Inoltre, un tale meccanismo di controllo, permette anche lo
svolgimento delle attivit di crescita e di ciclo cellulare nellordine
corretto.
La stimolazione di un passaggio e lattivazione del check point dipende
da condizioni esterne quali ad esempio:
-
presenza di fattori di crescita

quantit di nutrienti
stimolazione ormonale.
Il primo punto di controllo al termine della fase G1 e verifica:

-
la dimensione della cellula

la presenza di nutrienti
la presenza di fattori di crescita
lassenza di danni al DNA
Il primo punto di controllo, in assenza di queste condizioni, pu anche

indurre il passaggio in fase G0.
Il secondo punto di controllo situato al termine della G2 e verifica:
-
dimensione della cellula

completamento della replicazione del DNA
assemblaggio dei cromosomi
Esiste in realt un terzo punto di controllo che per si trova allinterno

della fase M:
Enrico Colombo
-
verifica il corretto appaiamento delle fibre del fuso ai

centromeri dei cromosomi.
Il ruolo delle protein-chinasi

La maturazione e i passaggi attraverso le fasi del ciclo cellulare sono
regolati da dei fattori di promozione della maturazione (MPF), che
sono composti da:
-
proteina chinasica: proteina responsabile del trasferimento

di gruppi fosfato (fosforilazione) di specifici substrati proteici
cicline: subunit di tipo regolatorio.
La concentrazione della ciclina varia da una fase allaltra e, quando si

trova a concentrazione sufficientemente elevata si ha lattivazione della
protein-chinasi corrispondente.
La protein chinasi attivata fosforila determinati substrati che
intervengono nelle fasi di replicazione o di divisione.
Negli ultimi anni si scoperto che il ciclo cellulare controllato da
chinasi ciclina-dipendenti (Cdk):
-
si attivano in seguito alla concentrazione di cicline

fosforilano determinati substrati, attivandoli o inattivandoli.
Nei due punti di regolazione principali (al termine delle fasi G1 e G2)
intervengono rispettivamente:
-
ciclina G1
ciclina mitotica
La ciclina mitotica viene sintetizzata nel periodo che va da G1 a G2

ed aumenta costantemente di concentrazione:
-
ha una specifica Cdk che al termine del ciclo lega la ciclina

mitotica per fosforilazione
forma il complesso Cdk-ciclina mitotica che promuove il
passaggio dal check point G2 alla mitosi.
Le proteine che vengono fosforilate (con ATP) dal complesso Cdkciclina mitotica sono:
-
lamine nucleari, permettendo quindi la disintegrazione della

membrana nucleare.
Istoni H1, inducendo la condensazione della cromatina.
La ciclina G1 con la sua Cdk controlla il check-point G1 attraverso la

fosforilazione della proteina Rb:
-
la proteina Rb, quando non fosforilata, inibisce il fattore di

trascrizione E2F, che promuove la trascrizione e la sintesi
degli enzimi necessari per la replicazione
quando la proteina Rb viene fosforilata, libera lE2F
sequestrato e rende possibile la sintesi degli enzimi
replicativi, permettendone la trascrizione dei geni.
Lapoptosi
Lapoptosi un processo che avviene normalmente negli organismi e
segue una sequenza ben precisa di eventi che portano alla morte
cellulare programmata.
un processo pulito, ordinato e naturale, che prevede:
-
diminuzione complessiva del volume della cellula

scomparsa del nucleo e frammentazione del DNA
perdita di adesione alle molecole e rottura delle membrane
cellulari
rilascio di enzimi idrolitici dai lisosomi e idrolisi generalizzata
la membrana plasmatica si mantiene intatta
fagocitosi da parte dei macrofagi.
Perch avviene lapoptosi

Il significato dellapoptosi molto ampio e generalmente quello di
eliminare cellule invecchiate o dannose allorganismo:
Enrico Colombo
-
durante lembiogenesi ha unazione morfogena, ovvero serve

ad eliminare strutture transitorie
nelladulto di homo sapiens, vi sono parecchi esempi di
apoptosi:
regressione della ghiandola mammaria dopo
lallattamento
perdita di capelli
formazioni delle superfici cornee nella pelle.
Eliminazione di neuroni che non terminano correttamente
sugli organi bersaglio
Eliminazione di linfociti T potenzialmente autoimmuni
Eliminazione di qualsiasi cellula invecchiata.
Lapoptosi pu essere indotta o repressa, da differenti segnali:

-
segnali antiapoptotici:
segnali di adesione tissutale
fattori di crescita
segnali di adesione alla matrice extracellulare
segnali apoptotici:
TNF, tumor necrosis factor
Virus (granzimi)
Anoikis (integrine)
Danni del DNA
Lazione delle caspasi.

Lapoptosi causata da una serie di enzimi che oggi denominata
caspasi.
Le caspasi sono una serie di enzimi proteolitici che sono attivati dai
vari fattori apoptotici. Agiscono tagliando un gruppo selezionato di
proteine e strutture bersaglio nella cellula quali:
-
alcune protiein chinasi: la distruzione fa saltare le adesioni

intercellulari
lamine: distruzione dellinvolucro nucleare.
Proteine del citoscheletro: actina, tubulina, gelsolina, ecc

vengono tagliate, devastando la forma della cellula e delle
sue strutture.
Attivazione della DNasi attivata da caspasi: un enzima
che viene attivato dalle caspasi e frammenta in piccoli pezzi
la cromatina.
Le vie dellapoptosi
Lapoptosi pu essere indotta da due differenti vie, una estrinseca, e
una intrinseca.
La via estrinseca attivata da stimoli esterni alla cellula, come ad
esempio i TNF, che invitano la cellula ad andare a farsi fottere.
Nella via intrinseca la cellula si accorge da sola di essere ormai inutile
e dannosa al tessuto e, grazie a stimoli interni, si fa fuori da sola.
La necrosi
La necrosi, a differenza dellapoptosi, un processo che dovuto a
stimoli esterni e non programmato: presume che vi sia un danno.
Le cause di necrosi possono essere danni causati da:
-
urti meccanici
radiazioni elettromagnetiche radioattive
corrosioni chimiche.
In seguito al danno subito, la cellula inizia la sua distruzione:

-
scoppia e rilascia nellambiente le sue macromolecole,

provocando una risposta infiammatoria
il tessuto leso si trasforma in una massa amorfa friabile
secerne pus.
Viene a crearsi una zona scura.
Il sistema immunitario di macrofagi provvede, quando possibile, a

riparare il danno subito.
Enrico Colombo
I virus
Le tipologie di infezioni virali.
I virus sono degli oggetti macromolecolari dotati di patrimonio

genetico, che ne dirige il ciclo vitale una volta che ha infettato una
cellula ospite:
Il virus pu infettare la cellula con due differenti modalit:
i virus sono infatti definiti parassiti, ovvero riproducono s

stessi sfruttando i meccanismi sintetici delle cellule ospiti.
I virus sono sostanzialmente formati da:

-
molecola di RNA o DNA, a doppio o a singolo filamento, a

doppia elica o lineare.
involucro proteico detto capside, che comunemente ha
forma di icosaedro.
Quando il virus si trova al di fuori di una cellula vivente si dice che

sottoforma di virione:
-
un virione pu avere nel proprio patrimonio genetico da pochi

ad alcune centinaia di geni.
Il capside solitamente formato da subunit tutte uguali.
Pu avvenire, come nel caso del virus HIV nelluomo,
che il virione abbia anche un rivestimento fosfolipidico,
derivante dalla membrana plasmatica della cellula che
lo ha prodotto e esocitato.
Ogni virus ha sulla sua superficie alcune proteine che
sporgono e interagiscono con le proteine di membrana della
cellula ospite.
Infezione litica
Nella maggior parte dei casi il virus che penetra nella cellula ospite vi
inserisce il proprio patrimonio genetico e sfrutta gli apparati di sintesi
della cellula:
-
pu accadere che un virus abbia numerosissime cellule che

lo possono accogliere
nella maggior parte dei casi, per, sono solamente alcuni tipi
di cellula che possono ospitare un dato virus.
duplica il proprio patrimonio genetico

sintetizza le proteine del proprio capside.
La cellula, alla fine viene indotta a rompersi (lisi cellulare) e
a liberare i virioni neosintetizzati.
Formazione di provirus
In alcuni casi, tuttavia, i virus non infettano la cellula inducendola alla
lisi, ma si inseriscono integrandosi nel patrimonio genetico della cellula
ospite.
Il DNA virale integrato si chiama provirus e ha differenti effetti a
seconda del tipo di virus e della cellula ospite:
-
Ogni virus ha una propria gamma di cellule ospiti:

-
rubando le attivit sintetiche

inserendosi nel DNA della cellula ospite, diventando cio
provirus.
le cellule batteriche che contengono un provirus:

il Dna virale solitamente silente
viene attivata la sintesi dei geni virali solamente a
seguito di stimoli esterni come radiazioni UV o
innalzamenti della temperatura.
Alcune cellule animali infettate da provirus, sintetizzano una
nuova progenie sfruttando la cellula ospite senza indurla a
lisi:
Enrico Colombo
Il virus HIV infetta le cellule continuando a produrre

virioni che infettano le cellule vicine.
Alcune cellule animali che contengono un provirus divengono
cellule maligne:
Perdono il controllo della loro crescita
Questo tipo di virus causa linsorgenza di tumori.
I batteriofagi
I virus batterici, o batteriofagi, sono virus che infettano le cellule
procariote e sono generalmente formati da:
-
capside proteico a forma di icosaedro

lunga coda proteica
placca di adesione con alcune punte.
Fagi della serie .

I fagi di questa serie hanno una interazione pi mite con la cellula che
li ospita:
-
Vi sono differenti classi di virus che, ad esempio, infettano il caro E.

Coli:
-
T2, T6, T4: virus con DNA a doppio filamento lineare molto
lungo
Fago : virus a DNA ds lineare pi breve.
T1, T3, T5: fagi con DNA ds lineare intorno alle 38 000 nt.
X174: un virus a DNA con singolo filamento circolare. Il
genoma virale molto corto. Non possiede la coda.
Il fago T4
Il DNA a doppio filamento del fago T4 formato da 166000 bp che
codificano per 130 geni. un virus abbastanza complesso.
Il meccanismo di azione di questo batteriofago quello della lisi
cellulare:
-
viene assorbito dalla cellula ospite: la cellula batterica deve

possedere i recettori di membrana adeguati per il fago in
questione.
nel batterio penetra il genoma virale
vengono trascritti i messaggeri del DNA virale e sintetizzate

le proteine dellinvolucro
si assemblano i virioni con il patrimonio genetico duplicato
si ha la lisi batterica e lespulsione di nuovi virioni.
immettono il loro DNA nella cellula

questo DNA si integra con il DNA batterico, restando nello
stato di profago.
La lisi deve venire indotta da agenti esterni, come ad
esempio radiazioni UV.
In presenza di radiazioni UV i virioni vengono prodotti e
viene indotta la lisi.
Virus animali
I virus animali sono di differente natura ed hanno delle specificit
proprie, come ad esempio la possibilit di effettuare la retro
trascrizione da RNA a DNA.
Vi sono alcuni virus a DNA, quali lHerpesvirus o i numerosi virus
oncogeni (SV40, Adenovirus, Epstein-Barr, ecc).
I Virus a RNA comprendono il virus dellHIV o il retrovirus del
sarcoma di Rous, (oncogeno).
SV40 simian vacuolating virus 40.
Il SV40 un virus a DNA circolare formato da 5240 bp e da istoni.
Possiede due classi di geni dette:
-
geni precoci: codificano per 2 proteine T, funzionali alla

replicazione del DNA.
geni tardivi: codificano per VP1, VP2, VP3.
Enrico Colombo
Nelluomo il suo ciclo si struttura nelle seguenti tappe:
1. la cellula viene infettata e rilascia la sua molecola di DNA
2. il DNA viene trasferito nel nucleo, in cui vengono trascritti gli
antigeni T, che codificano per proteine funzionali alla
replicazione del DNA virale.
3. Viene degradato il DNA cellulare e vengono utilizzati i
nucleotidi per la replicazione del DNA virale.
4. Vengono sintetizzate le proteine del capside VP1, VP2, VP3.
5. Si assemblano i nuovi virioni e vengono rilasciati allesterno
della cellula.
Nel criceto, linterazione con lSV40 ha un effetto differente:
-
limmissione del DNA nel nucleo della cellula e la sintesi degli

antigeni precoci induce la duplicazione cellulare
ha leffetto di virus oncogeno.
Provirus a DNA e integrazione.
Virus a RNA e retrovirus

I retrovirus RNA sono una famiglia di virus provvisti di un genoma
diploide a RNA monocatenario con polarit negativa.
La peculiarit dei virus a RNA quella di poter fare la trascrizione
inversa, da RNA a DNA, attraverso un enzima detto trascrittasi
inversa:
-
Lintegrazione del DNA virale nel genoma della cellula ospite pu

avvenire in due differenti modalit:
-
ricombinazione: si ha la rottura di sequenze omologhe

presenti in entrambi i DNA e la loro ricombinazione
scambiandole.
Inserimento in siti fragili: nei siti di rottura del DNA
genomico si inserisce il DNA virale.
Anche le cellule animali, come quelle batteriche, possono avere

uninterazione temperata con la cellula ospite:
-
il Dna virale si integra con la cellula ospite e rimane latente

fino a quando non scatenato da fattori esterni
si trova nello stato di provirus
Nel caso dellHerpesvirus, virus a DNA, il genoma virale integrato

nel genoma ospite:
-
resta normalmente inattivo trascrizionalmente
ha propriet litiche qualora sia attivato da cause esterne

come stress, farmaci, raggi UV, antibiotici, ecc
una DNA polimerasi RNA dipendente

forma una molecola di doppio filamento ibrida DNA-RNA a
partire dal genoma virale a RNA
mentre sintetizza il primo filamento di cDNA depolimerizza
lRNA virale
in seguito sintetizza anche il secondo filamento, in modo da
formare il cDNA a doppio filamento.
Il genoma di un retrovirus RNA formato da tre sequenze particolari

che sono:
-
gag: codifica per le proteine strutturali del capside, i

capsomeri
pol: codifica per la trascrittasi inversa.
Env: codifica per le glicoproteine del pericapside.
Le sequenze LTR stanno per long terminal repeat:

-
la LTR sul 5 costituisce il promotore per la sintesi del

messaggero
quella sul 3 la sequenza di termine.
Enrico Colombo
Il ciclo di un retrovirus a RNA prevede:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
penetrazione del pericapside per endocitosi.

liberazione dellacido nucleico.
Retro trascrizione e sintesi del doppio filamento di cDNA
Trasporto nel nucleo della cellula e integrazione con il DNA
con la formazione di un provirus.
Traduzione delle proteine virali.
Sintesi di nuovi RNA
Assemblaggio del capside
Esocitosi dei virioni.
Un famoso virus con retro trascrizione quello del sarcoma di Rous,

che induce sarcomi nel pollo, comportandosi come un virus
oncogeno.
Enrico Colombo
Regolazione dellespressione genica nei procarioti
Loperone batterico
Una cellula batterica strettamente legata allambiente in cui vive, il

quale pu mutare la propria composizione chimica in ogni momento:
Nei batteri, i geni che codificano gli enzimi per una determinata attivit
metabolica sono raccolti insieme in un unico complesso funzionale
detto operone.
un composto pu essere presente in determinati periodi,

mentre non esserci in altri.
Si considerano ora due casi in cui dal terreno minimo si aggiungono:

1. lattosio
2. triptofano.
Il lattosio un disaccaride che viene scisso in due monosaccaridi dal
batterio mediante lenzima -galattosidasi:
-
in condizioni minime la presenza di tale enzima bassissima

allaggiunta di lattosio al terreno la presenza dellenzima galattosidasi e dellmRNA che lo codifica aumentano
sensibilmente.
Il lattosio ha indotto la produzione dellenzima funzionale
alla propria digestione.
Il triptofano un amminoacido necesario per la sintesi delle proteine.

Se nel terreno di coltura questo amminoacido non presente, il
batterio spende determinata energia per sintetizzarlo:
-
qualora si immettesse del triptofano nel terreno di coltura, le

cellule non producono pi gli enzimi adatti alla sintesi del
triptofano.
In presenza del triptofano, la sintesi degli enzimi stata
repressa.
Gli operoni batterici operano secondo meccanismi ben precisi e

possiedono tutti delle determinate sequenze chiave quali:
-
geni strutturali: son i geni che codificano effettivamente per

gli enzimi. Tutte le sequenze che codificano per gli enzimi
della via metabolica sono disposte una a fianco allaltra,
senza alcun introne, e vengono trascritte generalmente in un
unico filamento di mRNA.
Promotore: il sito in cui la RNA polimerasi si lega al DNA
prima di iniziare la trascrizione.
Operatore: una sequenza associata al promotore che
serve come legame per il repressore. Il repressore una
proteina regolatrice di geni, ovvero che pu selettivamente
legare una sequenza di DNA, regolandone la trascrizione
delloperone.
Gene regolatore: codifica per la proteina repressore.
La chiave di controllo dellespressione genica quindi il repressore:

-
quando esso legato alloperatore, non permette alla RNA

polimerasi di legarsi al promotore, quindi di trascrivere i geni
strutturali.
Quando la concentrazione del metabolita invece alta, il
repressore viene stericamente indotto a slegarsi dalla
sequenza per permettere la trascrizione dei geni strutturali.
Enrico Colombo
Loperone lattosio, inducibile.
Loperone lattosio un esempio di operone inducibile, ovvero che
induce la trascrizione dei messaggeri necessari per produrre gli enzimi
funzionali alla digestione del lattosio.
Loperone lattosio contiene tre geni strutturali disposti in tandem che
codificano per la -galattosidasi e altri enzimi:
-
se il lattosio disponibile nel terreno di coltura, allaumentare

della sua concentrazione nella cellula, questo si lega al
repressore, modificandone la conformazione.
Il repressore, normalmente legato alloperatore sul DNA, si
stacca e permette la trascrizione dei tre geni strutturali.
La proteina repressore, in un operone inducibile, si lega alloperatore

in assenza di lattosio, l quale un induttore.
Una molecola di cAMP non in grado di stimolare direttamente

lespressione di una batteria di geni:
-
Quando la concentrazione di lattosio scende, il repressore torna a

legarsi alla molecola di DNA.
Controllo positivo mediante cAMP
I repressori come quelli degli operoni lac e trp esercitano la loro
influenza mediante controllo negativo, poich quando interagiscono
con il DNA la trascrizione repressa.
Loperone lac anche sotto il controllo positivo dellAMP ciclico, in
presenza di un fenomeno detto effetto del glucosio:
-
quando nel terreno di coltura presente il glucosio in

contemporanea ad altri substrati (lattosio o galattosio, ecc)
il batterio ignora gli altri substrati e metabolizza il glucosio.
Il glucosio nel terreno di coltura, determina quindi la
soppressione della produzione degli altri enzimi
catabolici.
Con studi effettuati su E. Coli nel 1965, si scopr che nel metabolismo
era coinvolto il cAMP:
maggiore era la concentrazione di glucosio, minore era

quella di cAMP
con laggiunta di cAMP nel terreno di coltura, la cellula
produceva rapidamente tutti gli enzimi per il metabolismo
degli altri nutrienti (enzimi per lattosio, galattosio, ecc)
nei procarioti agisce legandosi ad una proteina recettore

del cAMP (CAP) che capace di legare il DNA quando
associata al cAMP.
In presenza di cAMP la CAP lega una regione di controllo
sulloperone lac, che determina un cambiamento
conformazionale del DNA.
Il DNA con la nuova conformazione indotta da cAMP-CAP
in grado di trascrivere i geni strutturali del lattosio anche
quando il repressore inattivo per la presenza comunque di
lattosio.
Fino a quando i livelli di glucosio sono elevati, lenzima adenilatociclasi non produce cAMP:
-
i livellli di AMP ciclico restano al di sotto della soglia di

trascrizione delloperone.
Operone triptofano, operone reprimibile.

Loperone triptofano un classico esempio di operone reprimibile:
-
il repressore non in grado di legare da solo il DNA, ma

deve essere complessato con un co-repressore.
Il co-repressore, in questo caso, lo stesso triptofano.
In assenza di triptofano loperatore non possiede legato il repressore:

-
il DNA libero di fare trascrivere i geni strutturali alla RNA

polimerasi
vengono sintetizzati gli enzimi per la sintesi del triptofano.
Enrico Colombo
Quando il triptofano diventa disponibile, gli enzimi della via sintetica
non sono pi necessari:
-
il complesso triptofano-repressore si lega al DNA

la trascrizione dei geni strutturali delloperone trp repressa.
Enrico Colombo
La regolazione genica negli eucarioti.

Ogni cellula possiede lintero patrimonio genetico dellindividuo, ma in
seguito a specializzazione, ne trascrive solo una parte per poi
codificare le proteine che vi sono necessarie.
Questo significa che vi sono alcuni geni che vengono trascritti ed altri
che vengono repressi:
-
ci si accinge quindi a capire quali siano gli stimolatori della

trascrizione di determinati geni.
Devono esserci segnali dallesterno che inducono una
regolazione interna della cellula specializzata.
Meccanismo degli ormoni steroidei.

La peculiarit degli ormoni steroidei quella di oltrepassare senza
ostacoli la membrana plasmatica:
-
Il recettore citoplasmatico per gli ormoni steroidei costituito

generalmente da una proteina o da una lipoproteina che possiede due
siti specifici:
-
Meccanismi di trasduzione del segnale.

I segnali
I segnali tra una cellula e laltra possono essere di varia natura:
-
ormoni steroidei
ormoni proteici
fattori circolanti o secreti
fattori derivati dallambiente:
contatti tra cellule mediante molecole di adesione
segnali nutrizionali
shock termico.
Ognuno di questi segnali ha una precisa tipologia di trasduzione

allinterno della cellula:
-
in seguito attiva dei meccanismi che intervengono nei vari

livelli della regolazione dellespressione genica.
il loro recettore si trova nel citoplasma.

Lormone si lega al recettore, il quale interagisce direttamente
con la cromatina.
sito per lormone: sequenza di amminoacidi idrofobici che

lega stericamente lormone.
Sito per il legame del DNA: un sito che si lega ad una
sequenza specifica sul DNA a monte del gene, nel
promotore.
Sul DNA, di contro, sono presenti delle specifiche sequenze, dette

elementi di risposta, secondo lormone che ne deve regolare la
trascrizione:
-
GRE: sequenza promotrice per i glicocorticoidi.

ERE: sequenza di regolazione per gli estrogeni.
TRE: sequenza di regolazione per il testosterone.
La sequenza GRE, per esempio, presente prima di vari geni, quindi

un solo stimolo pu attivare la trascrizione di pi geni, quindi la
sintesi di differenti proteine.
Ormoni proteici
Un ormone proteico, a differenza di uno steroideo, non riesce a
attraversare il plasmalemma, quindi necessita della presenza di
recettori di membrana.
Enrico Colombo
Quando il ligando si lega al recettore di membrana, nel citoplasma si
verificano una serie di reazioni che portano allattivazione dei
secondi messaggeri:
-
vi sono proteine che vengono fosforilate, quindi

attivate/disattivate da protein-chinasi, che poi intervengono
come fattori di trascrizione allinterno del nucleo.
Lattivazione di un secondo messaggero attuata con il comune

meccanismo di fosforilazione o di de fosforilazione:
-
per fosforilare una proteina necessaria lazione di un fattore

proteico detto protein-chinasi, che catalizza laggiunta dei
gruppi fosfato su residui di serina, treonina o tirosina della
proteina effettrice
la defosforilazioine, invece, avviene ad opera dellenzima
fosfatasi, che rimuove i gruppi fosfato, inattivando la
proteina effettrice.
Struttura e attivazione di un recettore con attivit tirosinchinasica.

Le tirosin-chinasi sono enzimi che fosforilano residui di tirosina su
substrati proteici:
-
la fosforilazione della tirosina un meccanismo per la

trasduzione del segnale proprio degli eucarioti
coinvolge differenti processi cellulari quali:
crescita
proliferazione
differenziamento
sopravvivenza (segnali antiapoptotici)
adesione alla matrice extracellulare
migrazione
Le tirosin-chinasi si dividono in due principali categorie:
recettori tirosin-chinasi: sono proteine transmenmbrana

con un dominio extracellulare in cui si lega un ligando e un
dominio tirosin-chinasico intracitoplasmatico
tirosina chinasi citoplasmatiche: non possiedono recettori
nellambiente extracellulare.
Le tirosin-chinasi recettoriali sono direttamente attivate da ligandi

extracellulari, come ad esempio:
-
EGF, epidermal growth factor

PDGF, fattore di crescita delle piastrine
Insulina
Altri regolatori metabolici.
Dimerizzazione del recettore. Il ligando induce la dimerizzazione del

recettore, la quale, permetter poi di giungere alla auto fosforilazione
delle code tirosin-chinasiche.
Il recettore per EGF, una volta legato allEGF, si accoppia con un suo
simile recettore EGF - ligando EGF appaiando, sul versante citosolico
le code tirosiniche:
-
i due domini tirosin-chinasici delle molecole procedono alla

trans auto fosforilazione, ovvero un dominio chinasico
fosforila la coda dellaltro
e vice versa.
Attivazione della proteina chinasi. I siti di auto fosforilazione hanno

una doppia funzione:
-
regolano lattivit chinasica

sono sito di legame per le proteine citoplasmatiche.
La fosforilazione della tirosina modula il rapporto con le proteine

citoplasmatiche:
-
lansa di attivazione, in assenza di fosforilazione, chiude il

dominio di legame per ATP e le altre molecole
citoplasmatiche
Enrico Colombo
-
con la coda fosforilata, si ha la progressiva fosforilazione di

tutti i residui tirosinici, che permette di liberare il sito di
legame per i secondi messaggeri.
Interazioni proteina-proteina dipendenti dalle fosfo-tirosine. Le vie

di segnalazione intracitoplasmatiche sono catene di proteine segnale
che interagiscono luna con le altre in modo sequenziale.
Le proteine segnale sono in grado di associarsi ai recettori tirosinchinasi attivati perche contengono dei domini che si legano
specificamente a residui tirosina fosforilati.
Una particolarit di questo meccanismo sta nel fatto che si legano a
precise sequenze amminoacidiche a partire dal pTyr.
Attivazione delle vie di segnalazione a valle. Nel caso del recettore
per EGF, la proteina che interagisce con le code fosfo-tirosiniche del
recettore la proteina Grb2:
-
questa si lega alla tirosina fosforilata ed ha legata a s un

complesso Sos o uno Gab.
Sos attiva una piccola proteina, Ras, che fa parte della
superfamiglia delle proteine G ed associata alla membrana
plasmatica sul versante citosolico.
La proteina Ras presente in due forme:
Attiva: legata a GTP
Inattiva: legata a GDP.
La Ras-GTP lega e attiva le proteine segnali e si disattiva
idrolizzando GTP a GDP, tornando nella forma inattiva
Lidrolisi GTP >> GDP mediata e accelerata da
proteine GAP, che inducono e favoriscono la fosfatasi.
Lo scambio in Ras tra GTP e GDP induce lattivazione di una
proteina Raf, una proteina-chinasi per serina-treonina che
induce il ciclo delle Map chinasi
Il ciclo delle MAP-chinasi una serie di reazioni a catena che portano

varie proteine MAP ad interagire direttamente con il nucleo:
il termine della catena interagisce, nel nucleo, con geni che

possono indurre la proliferazione cellulare.
Vengono quindi sintetizzate cicline, Cdk, ecc segnali che
inducono la cellula a duplicarsi.
Altri sistemi di trasferimento di segnale dal recettore a proteine

situate pi a valle
Sono noti altri sistemi di trasduizione del segnale associati ad attivit
protein-chinasica. Fosforilati da:
-
proteine fosforilanti di tipo G: sono proteine GTPasi che

dissociano GTP, si legano a recettori-ligandi e trasducono il
segnale mediante interazioni con altre proteine
adenilato ciclasi: converte ATP in cAMP, mediatore della
risposta cellulare.
Fosfolipasi C: converte dei precursori in inositolo-3-fosfato e
Diacilglicerolo (DAG) che mediano altre risposte cellulari.
Modello di unintegrina recettrice per la fibronectina.

Le integrine sono molecole che legano le cellule alle fibre della matrice
extracellulare.
La specificit di alcune integrine anche quella di essere un recettore
di segnali dallambiente esterno:
-
associata a s ha spesso meccanismi macromolecolari sul

versante citosolico
in seguito a particolari stimoli, probabilmente meccanici,
lintegrina attiva la fosforilazione di tirosina, che interagisce
con Grb2
Grb2 legata a Sos, che attiva Ras-GTP, che attivano la
cascata delle MAP chinasi, inducendo la proliferazione
cellulare.
Enrico Colombo
-
Linsorgenza di tumori legata alla regolazione

dellespressione genica
I fattori di crescita implicati nellinsorgenza del cancro.
Il controllo della crescita cellulare, dal punto di vista della stimolazione,
si avvale di 5 classi di geni che codificano per proteine quali:
-
sis: fattori di crescita

erb: recettori per fattori di crescita
ras: trasduttori intracellulari
myc, jun: fattori di trascrizione
cicline, Cdk e loro inibitori.
I geni che codificano per queste proteine regolatrici del ciclo cellulare
possono essere causa dellinsorgenza del tumore se la produzione
delle proteine non correttamente regolata:
-
questi geni, nella loro attivit regolare sono definiti protooncogeni

nella loro attivit scorretta diventano oncogeni.
Questi fattori che regolano il ciclo cellulare, in seguito a delle

mutazioni, possono comportare linsorgenza di tumori. Alcuni esempi:
-
Sis: i fattori di crescita come PDGF o EGF possono venir

prodotti senza regolazione ed indurre la proliferazione
barbara.
Erb: i recettori per i fattori di crescita possono avere, dietro
mutazione del proto-oncogene, il recettore tronco, quindi
trasdurre il segnale anche senza ligando.
Ras: nelle cellule tumorali, ras pu essere costitutivamente
attiva e non indotta!
Myc, jun: questi fattori di trascrizione sono espressi nelle
cellule tumorali senza controllo, inducendo continuamente la
trascrizione
Cicline e Cdk: possono essere espresse a livelli troppo

elevati, o possono mancare i loro inibitori.
Oncogeni e onco-soppressori.
I geni implicati nella cancerogenesi sono di due categorie:
-
onco-soppressori: agiscono da freni. Codificano per

proteine che limitano e regolano la crescita cellulare e
impediscono alla cellula di diventare maligna.
Oncogeni: codificano per proteine che favoriscono la perdita
del controllo della proliferazione cellulare. Possono indurre la
cellula a raggiungere uno stato maligno.
Le cellule possiedono normalmente alcuni geni che in
seguito a piccole e brevi mutazioni si possono
trasformare in oncogeni. Tali geni sono detti protooncogeni.
Una mutazione sola, al proto-oncogene o allonco-soppressore non

basta normalmente a far insorgere il tumore:
-
il cancro si sviluppa quando si hanno mutazioni simultanee

di proto-oncogeni in oncogeni e di onco-soppressori incapaci
di svolgere la propria attivit.
I virus possono inserire nel DNA dellospite degli oncogeni gi

precostituiti e causare insorgenza del cancro.
Attivazione di proto-oncogeni a oncogeni.
Lattivazione dei proto-oncogeni a oncogeni pu avvenire per varie
cause:
-
Amplificazione genica che aumenta il numero di copie del

gene trascritto.
Mutazioni puntiformi che mantengono la proteina ras
(trasduttrice del segnale) costitutivamente attiva.
Enrico Colombo
-
Traslocazione cromosomica, che crea un nuovo gene

chimerico che codifica per una proteina costitutivamente
attiva
Traslocazione cromosomica che genera un gene chimerico
trascritto sotto il controllo di un enhancer forte.
Inserzioni virali nel genoma della cellula ospite, in cui
vengono inseriti direttamente degli oncogeni.
Inattivazione di onco-soppressori
La trasformazione di una cellula sana in una cellula tumorale
associata alla perdita di funzione dei geni onco-soppressori:
-
in un modo o nellaltro, i vari geni onco-soppressori (ne sono

identificati 24 nelluomo) agiscono regolando negativamente
la proliferazione cellulare.
La loro eliminazione promuove la crescita incontrollata.
Sono anche garanti della stabilit genetica.
RB, il retino blastoma. Tumore ereditario.

Il gene che codifica per pRB stato il primo onco-soppressore che sia
stato riscontrato e studiato. Una alterazione di questo gene causa
linsorgenza del tumore della retina, detto retinoblastoma.
Questo tipo di tumore si verifica se entrambi i geni sono alterati, poich
se ne alterato solamente uno, laltro cromosoma 13 pu codificare
per pRB.
Si dimostr che vi sono alcune famiglie che hanno ereditariamente un
cromosoma Rb mutato:
-
hanno, nel 90% dei casi la possibilit di sviluppare il tumore.

Questo avviene se nelle cellule somatiche avviene una
mutazione spontanea al gene RB del cromosoma sano
la possibilit di sviluppare il retinoblastoma nelle famiglie non
a rischio scende notevolmente, poich devono avvenire
mutazioni spontanee su entrambe i cromosomi.
La proteina RB una proteina che controlla negativamente

lespressione dei geni necessari per il passaggio G1>>S:
-
lega, ad esempio, il fattore di trascrizione E2F, agendo da

repressore sui geni che codificano per enzimi implicati nella
replicazione.
Quando le cicline-Cdk G1 alzano il loro livello, RB viene
fosforilata e rilascia E2F, permettendo la trascrizione degli
enzimi replicativi
Qualora la proteina RB sia assente o non sia funzionale, a causa della

mutazione di entrambi i geni RB, il passaggio G1>S non pu essere
inibito, quindi si ha una crescita incontrollata della popolazione
cellulare.
La proteina p53.
La proteina p53 una proteina che ha funzioni rilevantissime nella
protezione della cellula e nella sua regolazione:
-
blocca il ciclo cellulare per consentire riparazioni del DNA

induce allapoptosi se le mutazioni sono troppo
compromettenti
La sua azione inibitrice del ciclo cellulare data dalla capacit di

indurre la produzione di CDK p21, che causa direttamente larresto del
ciclo cellulare:
-
questo spiega perch nel 50 % dei tumori, sono mutati

entrambi i geni TP53.
p21, se non presente nella cellula a causa di mutazioni di
p53, permette alle cellule di proliferare con il DNA non
riparato, divulgando le aberrazioni cromosomiche.
Inoltre, la mancata produzione di p53, la quale in grado di indurre

apoptosi, blocca il suicidio della cellula a seguito di mutazioni molto
dannose:
Enrico Colombo
-
dimostrato dal fatto che se vi un genoma danneggiato, i

livelli di p53 sono molto alti.
Un altro meccanismo di controllo, che per avviene a livello pi

evolutivo, quello della amplificazione dei geni:
I vari livelli della regolazione dellespressione genica
La regolazione dellespressione genica pu avvenire a vari livelli, non

solamente sulla trascrizione, ma:
1) cambiamenti del DNA: metilazione, amplificazione, mutazione

somatica, ricombinazione somatica, trasposizione
2) trascrizione: struttura della cromatina, inizio e termine della
trascrizione.
3) Maturazione post trascrizionale: capping, poliadenilazione,
metilazione, splicing, editing.
4) Stabilit dei messaggeri maturi.
5) Modificazioni post traduzionali: modificazione dei prodotti
proteici.
Tutto linsieme di processi che regolano lespressione genica sono
codificati e regolati geneticamente dal DNA.
Cambiamenti del DNA.
Una delle pi semplici regolazioni geniche a livello del DNA quella
della metilazione:
-
ha la funzione di inibire la trascrizione

vengono metilate le citosine a cui seguono delle guanine in
una sequenza ripetuta CpG.
La metilazione varia a seconda dei periodi della vita di un individuo:

-
differenti siti possono essere metlati nel feto e de metilati

nelladulto.
Uno degli esempi pi lampanti quello delle globine, che
hanno differente forma nel feto (due catene alfa e due
gamma) nellembrione (due catene chi e due epsilon) e
nelladulto (due alfa e due beta).
geni che devono essere trascritti pi volte

vengono replicate un maggior numero di volte le catene che
necessitano di maggior trascrizione (formazione di double
minuts), poi vengono ricombinate nel cromosoma.
Nelluomo ci avviene con lrRNA.
Regolazione a livello della trascrizione

Le proteine che legano il DNA e lo condensano in eucromatina non lo
rendono accessibile alla trascrizione:
-
gli istoni sono le proteine deputate allorganizzazione della

cromatina e non permettono la trascrizione quando sono
legati al DNA.
In fase G1 gli istoni devono essere rilasciati per permettere la
trascrizione dei geni.
Gli istoni sono slegati dal DNA mediante metilazione, acetilazione e

fosforilazione:
-
vi sono enzimi deputati al rilascio di istoni che vengono

attivati a seguito di stimoli del ciclo cellulare (istone
acetiltransferasi, HAT)
Anche la conformazione che il DNA assume un fattore che pu

influire sulla trascrivibilit di un dato segmento:
-
nella forma Z il DNA tende a srotolarsi ed maggiormente

facile raggiungere i nucleotidi
nella forma B, invece, il DNA ordinato ed idonea a legare
proteine.
Linizio di una trascrizione finemente regolato da vari fattori, detti

promotori distale e prossimale.
Il promotore distale si compone di:
Enrico Colombo
-
enhancer: elemento del DNA situato molto distante dalla

sequenza promotrice distale e dal gene, lungo circa 200
nucleotidi. intensificatore della trascrizione.
Coattivatori: si legano allenhancer e al promotore
prossimale. Sono di due tipi:
Coattivatori in trans: sono elementi proteici che
interagiscono sulla cromatina permettendone il
ripiegamento del filamento e laccessibilit alla
trascrizione.
Coattivatori in cis: elementi che interagiscono
direttamente con lapparato di trascrizione.
Il ripiegamento a livello dellenhancer sul promotore prossimale

favorisce la formazione dellenhanceosoma, a cui si lega il complesso
di proteine GTF (TF II e TBP) e la RNA polimerasi.
Induzione da elevata concentrazione di metalli pesanti. Il gene che
codifica per una proteina detta metallotioneina codificato da
sequenze MRE, mettallic response elements:
-
codificata da fattori basali di trascrizione.
Modificazione post-trascrizionale dei messaggeri.

La modificazione post-trascrizionale dei messaggeri sostanzialmente
legata ai meccanismi di splicing.
Del meccanismo di splicing si gi parlato, ma ci che regola ancora
di pi la trascrizione di un determinato gene il meccanismo dello
splicing alternativo:
-
permette da un solo pre-mRNA di ottenere proteine differenti

in funzione di:
stadio di sviluppo della cellula
tessuto in cui fa parte.
Lo splicing alternativo avviene grazie a specifiche proteine presenti nel

nucleo della cellula che vengono sintetizzate nel particolare tipo
cellulare:
-
se in una cellula sono presenti alcune proteine regolatrici

specifiche, queste si legano a siti di splicing deboli e ne
impediscono il taglio da parte dello spliceosoma.
Se nella cellula non viene prodotta alcuna proteina
regolatoria, in presenza degli stessi siti pu avvenire il taglio.
Un esempio lampante, negli organismi procarioti, quello dello splicing

del pre-mRNA della fibronectina:
-
nel fegato vengono rimosse due specifiche sequenze (EDB e

EDA) che invece sono prodotte nei fibroblasti.
La fibronectina in circolo sar quindi differente rispetto a
quella che si trova a livello della matrice extracellulare.
Una cosa simile avviene nelle proteine di troponina T e tropomiosina di

ratto:
-
tra il ratto e luomo vi sono differenti meccanismi di splicing,

nonostante il gene sia molto simile.
Un altro caso il pre-mRNA del gene per la calcitonina, che in tessuti

differenti produce:
-
calcitonina nelle ghiandole della tiroide.

CGRP nei neuroni
Livello di stabilit dei messaggeri.

Il controllo a livello della traduzione degli mRNA gi trasportati nel
citoplasma avviene su tre livelli:
-
localizzazione degli mRNA nel citoplasma

capacit di controllare la frequenza di traduzione e la quantit
di proteine tradotte.
La longevit del filamento di mRNA.
Enrico Colombo
I meccanismi di controllo a livello della traduzione generalmente
operano tramite interazione tra il filamento di mRNA e proteine.
Determinanti nel controllo della stabilit e della traduzione di un mRNA
sono le sequenze UTR (sequenze non tradotte):
-
5-UTR si estende dal cappuccio di metilguanosina fino ad

AUG
3 UTR va dal codone di stop al termine della coda poliA.
Localizzazione citoplasmatica degli mRNA. Verr trattata in seguito,

parlando dello sviluppo embrionale.
Controllo della traduzione dellmRNA. Nelle cellule eucariotiche
umane vi sono differenti meccanismi che regolano la traduzione
dellmRNA in proteine.
ancora in fase di studio il ruolo dei microRNA.

Controllo della stabilit dellmRNA. La lunghezza della vita di un
RNA dipende dalla necessit della cellula ad avere pronta sintesi nel
citoplasma.
Uno dei principali meccanismi di controllo quello della coda poli(A):
-
Alcuni meccanismi possono essere definiti globali, poich influenzano

la traduzione di tutti gli mRNA.
Un meccanismo quello che influenza eIF2:
questa proteina, in seguito a stress della cellula, fosforilata

da una particolare chinasi.
La fosforilazione inibisce la traduzione di tutti gli altri trascritti.
Esistono quattro tipi di chinasi per diversi stress:
Termico
Infezione virale
Presenza di proteine mal piegate
Carenza di amminoacidi
Altri meccanismi agiscono alterando la frequenza di traduzione di

mRNA specifici. Uno degli esempi quello del mRNA per la ferritina,
proteina che regola la quantit di ferro nel citoplasma:
-
la traduzione regolata da una proteina regolatrice del

ferro (IRP), che dipende dalla concentrazione di ferro nella
cellula.
Quando la concentrazione di ferro bassa, il repressore si

lega ad un UTR dellmRNA chiamato elemento di risposta
al ferro.
Questo impedisce fisicamente la sintesi di altre ferritine.
Quando la concentrazione di Fe resta elevata, viene rimosso
IRP dal 5 dellUTR e sintetizzate nuove ferritine.
un mRNA che necessario per maggior tempo, esce con

una maggiore coda poliA
la coda viene gradualmente degradata dallenzima poli(A)
ribonucleasi.
Quando la coda si riduce a meno di 30 residui di adenosina,
il messaggero viene rapidamente degradato da ribonucleasi
generiche.
La longevit di un mRNA non dipende solo dalla coda poli(A), ma

anche da specifiche sequenze che ne regolano il tempo di
accorciamento a livello dellestremit 3-UTR:
-
se un mRNA deve avere unemivita lunga, la sua coda UTR

sar ricca di sequenze CCUCC, che legano proteine che
stabilizzano il messaggero
se deve avere vita breve, la coda UTR sar ricca di
sequenze AUUUA, che legano proteine destabilizzanti.
Se una coda AUUUA viene rimossa, la proteina di cui ne serve una

modica quantit viene prodotta in maniera superiore alla necessit:
-
la cellula pu diventare maligna.
Enrico Colombo
Controllo post-traduzionale.
La risposta immunitaria acquisita
Le modificazioni post-traduzionali di proteine sintetizzate possono

essere di varia natura. Tra i pi comuni processi vi sono:
A differenza dei meccanismi aspecifici della risposta innata, che

vedono cellule killer sempre pronte a degradare qualsiasi non self,
limmunit acquisita richiede un tempo di preparazione:
lacetilazione (aggiunta di CH3 - OH) come protezione della

degradazione
la fosforilazione su residui di serina, treonina e tirosina
laggiunta di gruppi lipidici.
La glicosilazione, che conferisce propriet funzionali e
recettoriali.
Alcune proteine, poi, appena sono sintetizzate possono andare

incontro al taglio proteolitico di alcune sue estremit e di parte delle
sequenze amminoacidiche:
-
il pre-pro collagene, ad esempio necessita del taglio delle

sequenze che gli impedivano di essere dannoso
nellapparato di Golgi per poter funzionare
altri enzimi o ormoni possono andare incontro a questo
destino.
La degradazione di alcuni peptidi in una proteina ne pu modificare la

conformazione, ma ottenere una proteina comunque funzionale,
talvolta anche dannosa.
La ricombinazione somatica dei geni delle immunoglobuline

Negli organismi vertebrati sono presenti degli efficaci meccanismi di
difesa contro agenti estranei agli organismi.
Vi sono generalmente due tipi di difesa:
-
immunit innata: una risposta aspecifica, mediata da TLR,

proteine recettori che si scagliano contro qualsiasi agente
ritenuto estraneo allorganismo.
Immunit acquisita: una risposta specifica e dotata di
memoria.
deve essere organizzato un attacco specifico contro il

patogeno in questione.
Le cellule che mediano la risposta acquisita sono cellule
capaci di memoria.
Esistono due tipi di risposte immunitarie acquisite:

-
immunit umorale: assicurata dagli anticorpi, proteine della

superfamiglia delle immunoglobuline. Mediata dai linfociti B
immunit cellulare (cellulo-mediata): assicurata da cellule
quali i linfociti T.
La risposta umorale mediata dai linfociti B, che quando vengono

attivati si differenziano in cellule che secernono anticorpi
(plasmacellule), i quali sono diretti verso agenti estranei alla cellula:
-
alcune volte gli anticorpi si legano a capsidi virali, particelle

proteiche, ecc e ne impediscono lingresso nella cellula
ospite.
Altre volte le Ig marcano dei patogeni per indicarne la
distruzione a macrofagi.
La risposta cellulo-mediata invece mediata dal linfociti T, che quando

sono attivati sono in grado di riconoscere una cellula infetta in maniera
specifica e ucciderla.
Le cellule B e T originano da una unica cellula staminale
ematopoietica, nel midollo osseo:
-
in seguito si differenziano maturando nel timo (linfociti T) o

nel midollo osseo (linfociti B)
Enrico Colombo
La selezione clonale per cellule B.
antigene il proprio organismo vengono subito inattivate o

distrutte.
Nel 1955, Jerne propose un processo per la selezione degli antigeni

che prevedeva che i linfociti producessero degli anticorpi, che vengono
poi selezionati a seconda del loro rapporto con lantigene.
Linfociti T. Attivazione e meccanismo dazione.
La teoria venne poi perfezionata ed accettata da Brunet, come teoria

della selezione clonale, che prevede che:
Come le cellule B, anche i linfociti T possono essere attivate da un

processo di selezione clonale:
1. ogni cellula B produce un tipo di anticorpo: i linfociti B

originano da cellule non differenziate, ma appena si
differenziano, grazie a riarrangiamenti del DNA, possono
produrre anticorpi differenti.
2. Le cellule B producono anticorpi in assenza di antigene: le
cellule B producono anticorpi e li espongono con la porzione
recettoriale sulla loro membrana. Vengono prodotti prima della
stimolazione di un dato ag, e sono pronti a legarsi ad esso.
3. La produzione di antucorpi segue la selezione delle cellule
B da parte degli ag: il legame di una cellula B con il
determinato antigene ne stimola la proliferazione che da vita a
due popolazioni di cellule clonali:
a. Plasmacellule: estremamente differenziate, che
producono notevole quantit di anticorpi.
b. Cellule B memoria: alcune cellule che sono poco
differenziate ma mantengono la memoria del dato clone.
4. La memoria immunologica produce immunit a lungo
termine: le cellule B memoria possono rispondere rapidamente
a una successiva comparsa del dato antigene. Se stimolate
nuovamente dallantigene, producono una risposta immune
secondaria, che dura solo poche ore, a differenza dei giorni
necessari per la prima
5. La tolleranza immunologica previene anticorpi contro s
stessi: I geni che codificano per anticorpi sono combinati a
caso per ottenere la variabilit quindi esiste una possibilit di
sintetizzare degli autoanticorpi. Per la necessaria tolleranza
immunologica verso il self le cellule che riconoscono come
possiedono sulla loro membrana il recettore delle cellule T,

che permette loro di interagire con un dato antigene. Ogni
cellula T possiede un solo TCR.
Le cellule T sono attivate da frammenti di antigeni che sono
presentati da cellule presentanti lantigene (APC) che
possono essere mostrati in differenti modalit:
Sulla superficie di cellule infettate da virus il linfocita T
pu riconoscere particelle del capside
In altri casi lAPC un macrofago o una cellula
dendritica che ha degradato enzimaticamente
lantigene e lo presenta sulla sua membrana in piccoli
pezzi.
Lantigene presentato dalle APC viene poi riconosciuto dalle
cellule T, che attivano la risposta.
A risposta terminata alcune cellule T clonali vengono
mantenute come cellule T memoria, mentre altre vengono
degradate o muoiono per apoptosi.
Contrariamente alle cellule B, le cellule T interagiscono direttamente

con altre cellule (macrofagi, altre cellule T, cellule B, ecc), inducendo
linattivazione o la morte della cellula bersaglio come risultato finale:
-
i mediatori chimici di queste risposte sono le citochine, una

classe di proteine molto attive che funzionano a
concentrazioni basse:
sono prodotte da vari tipi di cellule e comprendono gli
interferoni (IFN), le interleuchine (IL) e i fattori necrotici
tumorali TNF.
Enrico Colombo
Queste citochine si legano alle cellule bersaglio,
modificandone lattivit, inducendo produzione di altre
citochine o la proliferazione cellulare.
Una classe particolare, le chemiochine, inducono la
migrazione dei linfociti nelle zone infiammate.
Esistono differenti tipi di cellule T, le cui classi pi importanti sono:
-
linfociti T citotossici: sono cellule che controllano la

presenza di anomalie nelle cellule del corpo. Inducono
apoptosi nelle cellule bersaglio, secernendo perforine e
granzimi (questi attivano le caspasi, segnali apoptotici).
Identificate dal CD8.
Linfociti T helper: riconosciuti da CD4, sono attivate da APC
professionali (macrofagi, cellule dendritiche, ecc) regolano
lattivazione delle cellule B o di altre cellule T secernendo
interleuchine.
Linfociti T regler: complesso CD4+ CD25. Sopprimono
lattivit di altre cellule immunitarie, soprattutto per evirare
fenomeni autoimmuni.
La struttura modulare degli anticorpi.

Lorganismo umano produce milioni di molecole anticorpali differenti,
capaci di legarsi praticamente a qualunque sostanza estranea si
inserisca nel corpo.
Nonostante la grande diversit e complessit del sistema immunitario,
una specifica Ig pu interagire solamente con uno o pochi antigeni.
Gli anticorpi sono proteine globulari chiamate immunoglobuline,
costituite da differenti catene unite da ponti disolfuro, a livello delle
cisteine:
-
catene pesanti.
catene leggere.
Vi sono 5 tipi di Ig: A, D, E, G, M:L
ogni tipologia di Ig sintetizzata in tempi differenti di

esposizione alla sostanza estranea.
Hanno differente funzione biologica.
Ogni tipo di Ig ha una catena pesante
Ogni Ig ha due tipi di catene leggere.
Una molcola di IgG composta, formando una Y, da:

-
due catene pesanti identiche

due catene leggere identiche.
Vi sono due tipi di catene leggere presenti in tutti gli anticorpi:

-
kappa: met di ogni catena ha una sequenza identica in tutte

le Ig, laltra met differisce.
lambda: avviene la medesima cosa che in kappa.
Anche le catene pesanti possiedono:

-
parte costante (C)

parte variabile (V).
Le catene leggere sono composte:

-
met da una parte variabile, situata allestremo dellFc, VL.

met da una parte costante CL.
Le catene pesanti sono formate:

-
nel quarto distale da catene variabili VH.

per i tre quarti prossimali da 3 catene costanti CH1, CH2, CH3.
Ogni porzione costante di una catena si lega tramite ponti disolfuro con
lomologo della catena pesante o leggera che ha a fianco.
I siti di legame per lantigene sono situati alla fine di ogni braccio della
molecola a forma di Y e sono identici da entrambe i lati:
-
sono costituiti dalla porzione variabile della catena pesante

unita con quella della catena leggera
lassemblaggio delle differenti porzioni variabili causa la
enorme variabilit delle Ig.
Enrico Colombo
-
La porzione terminale delle due catene variabili (pesanti e

leggere) presenta delle porzioni ipervariabili, che giocano il
ruolo chiave nel riconoscimento di Ag.
Il sito di legame per un particolare antigene si chiama
epitopo.
Le porzioni costanti delle catene pesanti, giocano un ruolo

determinante nella determinazione della classe di Ig, che ne determina
la specifica funzione.
Vengono tagliati gli estremi dellanello mediante due proteine

associate al V(D)J ricombinasi, dette RAG1 e RAG2:
I Vk e Jk scelti vengono uniti tra loro ed entrano a fare
parte del trascritto mRNA
I geni che facevano parte dellanello formano una
catena di DNA circolare che viene allontanata dal
cromosoma.
Nel processo di splicing, dallmRNA vengono allontanati gli
introni, che si frappongono in maniera consistente tra VJ e C.
Viene poi tradotta la catena dellIgG corrispondente.
Base genetica per le sequenze condivise e differenti nelle Ig.

Lipotesi prevalente in materia di formazione delle Ig quella del
riarrangiamento del DNA.
Da quando vengono allontanate le sequenze dellanello, la cellula che

ha subito questa trasformazione in grado di produrre un solo
clone di Ig.
Si scopr che nellembrione le sequenze che codificavano per sequeze

V e C erano molto separate sul Dna, ma erano molto vicine nelle
cellule mieloidi che secernevano anticorpi.
Per le catene pesanti il riarrangiamento avviene con simili modalit,

ma sono 3 i frammenti genici che compongono VH: V, D, J.
Ad esempio, si possono considerare le sequenze del DNA umano in

cui sono comprese le catene leggere k:
-
una sequenza di geni Vk differenti e ripetuti sono separati da

un singolo gene Ck posto ad una certa distanza.
Si scopr che le catene leggere V sono pi corte della
sequenza necessaria per la sintesi di una catena leggera k
completa.
Vi una certa regione che codifica per i 13
amminoacidi rimanenti ad una certa distanza da Vk,
chiamata segmento J.
Il segmento J formato da 5 distinti segmenti Jk
disposti in tandem.
Lintero gene completo Vk formato dallunione di uno
specifico gene Vk con una cassetta Jk, mediante un
complesso proteico chiamato V(D)J ricombinasi, che piega
il DNA in un anello in modo da appaiare il gene Vk scelto
casualmente con il gene Jk scelto casualmente.
Con la formazione di catene pesanti e catene leggere e una variazione

enzimatica, unita allo splicing alternativo si possono ottenere circa
200000'000 di combinazioni.
Ulteriori variazioni possono per giungere a livello delle mutazioni
ipersomatiche, che avvengono parecchio tempo dopo la formazione
del DNA riarrangiato:
-
il tasso di mutazione di circa 100 000 volte pi alto in quel

luogo rispetto al resto del genoma
ci avviene a opera di specifici enzimi, come la terminaldeosossi-nucleotidil-transferasi (TDT), che aggiunge nei
punti di rottura dei nucleotidi in modo casuale, comportando
delle mutazioni di piccola entit.
Queste mutazioni possono avere effetti di sensibile
miglioramento nel riconoscimento dellantigene.
Enrico Colombo
Differenziamento cellulare
Gli stadi del differenziamento
Il differenziamento cellulare un processo che avviene quando la

cellula uovo viene fecondata dal gamete maschile ed avvengono le
condizioni per la crescita del nuovo individuo.
La fusione dei due pronuclei da vita allo zigote, che formato da
poche cellule indifferenziate e totipotenti.
Lo stadio successivo quello di blastula, in cui le cellule iniziano ad
assumere una forma differente, ma sono ancora multi potenti.
Il differenziamento dei tre foglietti embrionali primitivi avviene a livello
della gastrula, in cui si possono individuare:
-
endoderma
ectoderma
mesoderma: il mesoderma ancora composto da cellule
indifferenziate che potranno poi sviluppare linee
notevolmente differenti.
Al termine dellembiogenesi, ll neonato avr una notevole quantit di

tessuti diffrenziati, che si calcolano intorno ai 210 differenti.
Il mesoderma da origine a notevoli tessuti differenti:

-
epatociti, da cui derivano anche le cellule della tiroide

trachea
polmoni
vescica
pancreas esocrino
Lectoderma forma:
-
tessuto nervoso
osseo
cartilagine
gonadi
reni
muscoli
corticale del surrene
cuore, cellule endoteliali
cellule sanguigne
ecc
i morfogeni.
Hans Spemann si mise a cercare nella cellula uovo dei fattori
citoplasmatici che influenzassero lo sviluppo.
Prese due uova di salamandra e le divise in maniera differente:
-
Il foglietto embrionale endodermico da origine a:

-
cellule ghiandolari
cellule specializzate come quelle della retina, dei denti, della
tuba uditiva.
Midollare del surrene
una cellula uovo venne divisa in due met comprendenti

uguale quantit di citoplasma > si ottenevano due individui
normali
laltra venne divisa lasciando solamente il nucleo in una e
nellaltra il nucleo con la gran parte del citoplasma. >> si
ottennero un individuo normale e uno anormale.
Spemann fu il primo ad elaborare la teoria del trasferimento del

Nucleo, e ne ottenne una formidabile prova di validit:
Enrico Colombo
-
i nuclei erano trasferibili da una cellula somatica ad uno

zigote senza alcun problema, ma importante era il citoplasma
per lo sviluppo effettivo dellindividuo
gett le basi della clonazione.
Nelle cellule uovo di Drosophila melanogaster, si scopr che

determinati mRNA prodotti ancora prima della fecondazione si
situavano in posizioni specifiche:
-
il gene bicoid aveva il suo trascritto posizionato nella parte

anteriore delluovo
il gene oskar si situava nella parte posteriore.
Questa differente disposizione degli
mRNA materni nel citoplasma
delluovo viene detta gradiente
morfogenetico, poich vede la
disposizione ordinata di determinati
morfogeni.
Un morfogene un gene che
specifica per la forma di un organi
nellindividuo in fase di sviluppo.
Nella Drosophila si individuarono tre
morfogeni, che si disponevano a
gradienti:
-
bicoid: specificava per la regione cefalica

nanos: specificava per la regione caudale
Toll: determinava lo sviluppo ventrale non legando un altro
fattore Dorsal.
In relazione allo sviluppo della drosophila si scopr che esistono dei

geni del differenziamento:
-
si attivano a cascata tra loro, per permettere di codificare per

fattori di crescita specifici al momento giusto.
I morfogeni si esprimono con una sequenza specifica, perch

deve esserci una specifica gerarchia nellespressione di
geni che regolano lo sviluppo embrionale.
Tre tipi di geni del differenziamento per la Drosophila.

Il moscerino della frutta si scopr che aveva uno sviluppo controllato da
tre tipologie di geni:
-
geni materni: sono mRNA presenti nella cellula uovo,

espressi durante loogenesi. Esprimono la polarit di sviluppo
e lorganizzazione spaziale.
Geni di segmentazione: regolano lo sviluppo dei vari
segmenti (la drosophila un animale segmentato, luomo
no). Sono espressi dopo la fecondazione in seguito
allattivazione dei geni materni.
Geni omeotici: sono geni che specificano lidentit, la forma
e la funzione dei segmenti corporei. Si esprimono nella
gastrula in seguito allattivazione dai geni di segmentazione
(nella drosophila) o dei geni materni (nelluomo).
Queste tipologie di geni che codificano per proteine di sviluppo hanno

anche la capacit, una volta prodotti, di indurre il bloccaggio,
leliminazione o linattivazione dei geni della tappa precedente.
La specificit di questi geni attiva una cascata di fattori di
trascrizione che codificano per le proteine necessarie allo sviluppo
della parte del corpo individuata dal morfogeno.
Nelluomo, dopo i geni materni, sono utilizzati i geni omeotici, che
sono disposti su 4 cromosomi con funzioni simili a quelli della
Drosophila:
-
sono direzionati in senso cranio-caudale. Infatti lo sviluppo

della maggior parte dei mammiferi ha un indice cefalico.
Se messi in fila i 4 string del DNA che possiedono i
morfogeni, questi
iniziano al 3 con i morfogeni cefalici
Proseguono con quelli toracici
Enrico Colombo
Al 5 vi sono quelli caudali.
Il differenziamento nelluomo e il mantenimento dello stato

differenziato
Mantenimento dello stadio differenziato

Il mantenimento dello stadio differenziato ad opera di ormoni o altri
stimoli pu seguire diverse modalit:
Durante lo sviluppo dellindividuo umano si esprime nel giusto ordine

una cascata di fattori di trascrizione a gradiente, che sono
espressione dei morfogeni.
Il differenziamento un processo che si attua per la maggiore durante

lo sviluppo embrionale, ma prosegue nelladulto attraverso il
mantenimento dello stato differenziato:
cellule permanenti: alcuni tessuti non si rinnovano mai pi,

hanno cellule eterne (nervoso, muscolare, cellule del
cristallino)
tessuti che si rinnovano per duplicazione semplice:
epatociti, cellule endoteliali. Possiedono gi nel loro
citoplasma le cellule differenziate.
Tessuti rinnovati da cellule staminali: epiteli, midollo
osseo, ecc Devono subire determinati segnali che gli
impongono una specializzazione e un differenziamento.
Negli adulti il mantenimento dello stato differenziato ancora regolato

dallespressione di geni che codificano per fattori di differenziamento:
-
attivati da fattori di crescita e ormoni

la cellula ha specifici recettori che, in presenza di questi
segnali, inducono la trascrizione dei geni caratteristici del
tessuto.
endocrina: gli stimoli giungono attraverso il flusso

sanguigno, con ormoni che si legano a specifici recettori sulle
cellule
paracrina: il mantenimento della specializzazione pu
essere indotto dalle cellule vicine attraverso vari meccanismi
autocrina: la cellula stessa produce segnali che auto
impongono il mantenimento dello stato differenziato.

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Enrico Colombo

Biologia molecolare e cellulare

Biologia molecolare e cellulare 1

CORSO DI BIOLOGIA MOLECOLARE E

Prof.ssa Marina Colombi

Biologia molecolare e cellulare 2

I procarioti sono cellule estremamente semplici, per quanto riguarda

Per essere vivente si intende un qualsiasi sistema molecolare in grado

Ciascun vivente pu raggiungere questo obbiettivo solamente perch

La vita permessa da complessi meccanismi che avvengono a livello

protisti: sono cellule eucariotiche che permangono nello stadio

Levoluzione ha portato gli individui pluricellulari a suddividersi in tre

Lorigine della vita sulla terra.

vapore acqueo (H2O)

Inoltre, la forte presenza di radiazioni UV permetteva la produzione di:

Formazione di molecole organiche.

presenza di enormi fonti energetiche: cerano innumerevoli

Lesperimento che prov la probabilit della formazione di molecole

1920, da Oparin e Haldane

Lesperienza di Miller e Ury, consisteva nel simulare, allinterno di

misero vapore acqueo, metano, ammoniaca e idrogeno.

Il risultato fu sorprendente: si trovarono degli amminoacidi, piccoli acidi

Biologia molecolare e cellulare 3

Questa dimostrazione permette di formulare la teoria dellorigine della

le prime molecole organiche si sono formate in piccole lagune

Dal brodo primordiale si rese possibile la formazione di macromolecole

si univano i monomeri con leliminazione di una molecola

Nascita dei viventi.

ebbero origine i procarioti che vivevano facendo respirazione

Gli eucarioti comparvero circa 2 miliardi di anni orsono, secondo la

questi iniziano la produzione di ossigeno molecolare

Biologia molecolare e cellulare 4

In queste modalit si ha la nascita della vita, che dallacqua, si sposta

racchiude il progetto biologico di ciascun individuo.

Il dogma centrale della biologia, in cui racchiuso il progetto biologico

il DNA pu duplicare s stesso (replicazione) o codificare per

Il corretto funzionamento di uno di questi meccanismi pu causare

La vita garantita dal DNA, che codifica per le proteine, le quali

Gli acidi nucleici

Uno zucchero pentoso (a cinque atomi di C).

Biologia molecolare e cellulare 5

altrettanto chiaro, oggi, che la

Le pirimidine sono due nel DNA:

Sia nel DNA che nellRNA il

NellRNA la pirimidina timina sostituita dalluracile, che differisce per

Il legame tra il desossiribosio e lo

I nucleotidi sono delle strutture formate da uno zucchero pentoso a cui

si vedr che sulla lunga

pirimidine: ad anello singolo.

Sono presenti anche pi gruppi fosfato, legati tra loro da legami

Ovviamente, il prefisso desossi- si inserisce qualora lo zucchero che

Biologia molecolare e cellulare 6

La struttura della molecola di DNA.

il carbonio in 3 di uno zucchero

Questo tipo di legame permette di individuare una certa polarit nella

sment la teoria del tetra nucleotide, che prevedeva che i

Era dunque presupposto, che la molecola era composta da coppie di

Biologia molecolare e cellulare 7

Il modello di Watson e Crick

la molecola composta da due catene di nucleotidi.

Lo scheletro formato dalle molecole zucchero fosfato

Limportanza del modello di Watson e Crick

la sequenza di basi azotate codificava per amminoacidi

Per quanto riguarda la regolazione dellespressione genica e altre