Lo sviluppo dei tumori dipende dalla perdita del controllo dei meccanismi di regolazione del ciclo cellulare

A destra e' rappresentato un diagramma con i quattro segmenti del ciclo cellulare. Passando dalla fase G1 alla fase S, la cellula e' obbligata a proseguire sino alla replicazione del DNA cromosomiale e raggiungere i punti di controllo (checkpoints) posizionati al punto di transizione tra la fase G2 e la fase M; questa transizione e' associata e controlla l'ingresso in mitosi. La corretta terminazione del ciclo cellulare richiede: i cromosomi devono essere duplicati (S), condensati (M), segregati e decondensati i centrioli devono essere duplicati (S), separati, e migrare alle estremita' opposte del nucleo la membrana nucleare deve essere disassemblata e riassemblata (M) il fuso mitotico si deve assemblare e rompere (M) la membrana cellulare deve invaginarsi per consentire la citochinesi Sulla sinistra e' rappresentato lo stesso diagramma del ciclo cellulare in cui sono stati evidenziati alcuni geni associati al controllo della transizione tra la fase G1 ed S oppure al controllo della transizione tra la fase G2 ed M. Ad esempio, la p53 agisce prima della replicazione del DNA identificando un eventuale danno al DNA e ritardando l'ingresso nella fase S sinche' il danno non e' stato riparato. I checkpoints del ciclo cellulare sono controllati da chinasi ciclini dipendenti (cyclin dependent kinases = CDK) complessi formati da due proteine - una ciclina (proteina strutturale) ed una chinasi (enzima). In eucarioti superiori, una serie di chinasi agiscono in successione (CDK4, CDK2, and CDC2) agendo assieme a cicline che agiscono in successione (cyclins D, E, A, and B) man mano che la cellula passa dalla fase G1 alla S, quindi alla G2 infine alla M. Una ciclina si associa ad una CDK per formare un complesso. Se per qualche ragione la cellula rileva un problema nella continuazione del ciclo cellulare, il processo di attivazione del complesso ciclina-CDK non si completa. Se non si verificano problemi, il processo di attivazione del complesso ciclina-CDK viene iniziato da una forforilazione che porta ad una attivazione di un fattore di trascrizione (E2F) per rimozione di un inibitore di E2F (Rb). Il fattore di trascrizione quindi accende la trascrizione di geni necessari per il prossimo passo del ciclo cellulare, inclusi quelli codificanti per la ciclina coinvolta nella transizione di fase successiva. La natura temporanea di questo tipo di controllo e' dovuta al fatto che la proteina ciclina viene completamente e rapidamente degradata dopo il passaggio del checkpoint. Sulla destra e' rappresentato il controllo associato alla fase di transizione tra la G1 e la S che coinvolge p53 (un gene soppressore del tumore) ed Rb (il prodotto di un gene associato al retinoblastoma - anch'esso un gene soppressore del tumore). Qualunque mutazione che rimuove o modifica un inibitore che agisce al checkpoint (come p53) o rimuove o modifica un inibitore della trascrizione che agisce a questo livello (come Rb) portera' alla perdita del controllo del ciclo cellulare, ad una crescita incontrollata e quindi al cancro. from Science 266:1821-1828, Cell Cycle Control and Cancer, by Hartwell and Kastan Ciclo Cellulare M --> G1--> S --> G2 --> M S, G2 e M hanno durata sempre uguale mentre la fase G1 (in media 10 ore) pu subire enormi variazioni da tessuto a tessuto (fino a migliaia di ore per i neuroni). Checkpoints

Tarda fase G1: valutazione di eventuale danno genetico S: valutazione di danno dovuto ad errori replicativi Fase G2: completamento della duplicazione del Dna e preparazione della fase M Fase M: controlla che la segregazione cromatinica si effettui correttamente Segnali Esterni I segnali esterni agiscono come fattori di competenza rendendo la cellula competente per la divisione e rendono la cellula capace di superare il punto di restrizione. Il TGFbeta un fattore di progressione negativo. IGF1 e IGF2 sono fattori di progressione. La cellula fuoriesce dalla fase G1 ed entra in fase G0 per: Assenza di mitogeni Presenza di segnali conflittuali ( se durano troppo va incontro ad apoptosi) Segnali differenziativi Cicline Le cicline sono proteine regolatorie ad elevato grado di conservazione che sono in grado di legarsi a particolari proteinchinasi intracellulari dette cdks(ciclin dipendent kinase) mediante regioni dette cyclin box. Il legame di una ciclina alla propria cdk determina lattivazione di questo complesso enzimatico in grado di fosforilare alcune proteine implicate nella progressione del ciclo. Le cicline sono divise in classi e sottoclassi (A-H); le pi importanti sono comprese tra A ed E. La loro sintesi e degradazione fase specifica (D aumenta in fase G1 e rimane costante per tutte le fasi, E prevalente in fase G1, A in fase S e G2, B in fase G2 ed M). CDKS Le cdks sono serin treonin chinasi, attive se legate alle rispettive cicline partners ( la D attiva cdk4 e cdk6, E attiva cdk2, A attiva cdk2 e cdc2, B attiva cdc2). Ciascun complesso attivato a sua volta attivatore del complesso ciclina-cdk successivo, garantendo la progressione del ciclo. Lattivit delle cdks pu essere modulata negativamente per fenomeni di fosforilazione in due residui specifici(Thr 14 e tyr 15) e positivamente ad opera di una fosfatasi, la cdc25. CAK (cdk activating kinase) provoca la fosforilazione di un residuo di treonina che generalmente in posizione 160. le cdk vengono inibite da cdk inhibitors che moderano le concentrazioni attive delle cdks. CDK Inibitors Le cdk inhibitors sono distinguibili in due grandi classi ed hanno modulazione negativa del ciclo cellulare : inibitori non selettivi: inattivano la funzione di una serie svariata di cdks. Comprende p21, p27, p57. Agiscono in tutte le fasi del ciclo rendendo il complesso ciclina-cdk inattivo. Legano cyc interagendo con entrambe le parti del complesso. inibitori selettivi: specifici per cdk4 e cdk6. Comprende p16, p15, p18 e p19. Agiscono solo in fase G1 legandosi a cdk4 o cdk6 prima che esse abbiano formato il complesso con le cicline. In questo modo ne impediscono il legame inattivandole. Legano solo cdk occupando una tasca importante per lattivit chinasica (lega ATP). TGFbeta Il TGFbeta ha azione inibitoria nei confronti del ciclo cellulare. A livello del punto di restrizione in tarda fase G1, induce la sintesi di un inibitore selettivo delle cdk, il p15. Questo in grado di legare il proprio complesso ciclina-cdk spiazzando un inibitore non selettivo p27, il quale, liberato, pu andare ad inattivare altri complessi , amplificando lazione di inibizione, con conseguente blocco della proliferazione cellulare. CDK Inibitors

Fase G1 Determina la durata di tutto il ciclo. Contiene il primo e pi importante punto di restrizione in cui agiscono cdkI sia selettivi che non selettivi. Il superamento di questo momento biologico dipende dalla concentrazione di mitogeni o da errori genetici ed avviene ad opera di una serie di eventi che vedono implicata anche la proteina pRb. La presenza di mitogeni allinizio della fase G1, induce allinterno della cellula la sintesi della ciclina D. I livelli aumentati di ciclina D permettono il legame con la cdk4; tale complesso viene fosforilato da CAK che lo attiva. Lazione di questo complesso si esplica fosforilando pRb la cui fosforilazione viene amplificata dal complesso Ecdk2 che si forma in una fase pi tarda del ciclo, sotto induzione del complesso D-cdk4. Ad opera dei due complessi cicline-cdk, pRb si ritrover iperfosforilato e rilascer i fattori di trascrizione che indurranno lattivazione di alcuni geni che sintetizzano proteine implicate nel passaggio alla fase S del ciclo. pRb in grado di legare in particolare il fattore di trascrizione E2F attraverso un particolare sito di legame accanto al quale si trova un sito per il prodotto del protoncogene c-abl che viene rilasciato anchesso dopo la sua fosforilazione. E2F lega in tandem DP attivando listone deacetilasi se Rb ipofosfoilato o listone acetilasi se iperfosforilato. E2F 1, 2, 3a sono attivatori della trascrizione, 3b, 4 e 5 sono repressori della trascrizione. Rb fa parte delle proteine pocket insieme a p107(viene progressivamente sintetizzata cos consente alla cellula di proseguire il ciclo di duplicazione) e p130(deve essere degradata per consentire alla cellula di entrare nel ciclo) che hanno sito di legame per vins, tf e complesso ciclina-cdk. Fase S Una volta innescata procede fino a quando tutto il materiale genetico non viene duplicato. Deve essere in grado di garantire la sintesi di una copia esatta di tutto il patrimonio genetico cellulare in un tempo breve(8 ore) e deve compiere questo processo senza errori , superando i possibili problemi di terminazione del DNA di nuova sintesi (GC-telomeri e telomerasi). caratterizzata dal complesso A-cdk2 o A-cdc2, p53(attiva i meccanismi di riparazione in caso di errori). Se c un errore p53 fosforilato da ATM e non riconosciuto da mdm2 che altrimenti ne induce ubiquitinazione. Mdm2 risulta sequestrato nel nucleolo ad opera della proteina p14arf. Fase G2 Costituisce un breve GAP(2 ore) che segue la sintesi del DNA e precede la mitosi. sotto stretto controllo di un fattore noto come MPF (metaphase/mitosis promoting factor) costituito dalla ciclina B e cdc2. Lattivit chinasica di MPF regolata da processi di fosforilazione (week1) e defosforilazione (cdc25). Il bersaglio diretto di MPF rimane oggi oscuro ma forse fa parte della famiglia delle Map kinasi. MPF nella forma attiva catalizza una serie di reazioni di fosforilazione che danno inizio alla divisione mitotica. Fase M revede la condensazione e la separazione dei cromosomi associata alla migrazione ai poli del fuso mitotico. Un licensing factor garantisce che la duplicazione del DNA avvenga una sola volta prima della separazione cromosomica. Questo fattore espresso a livello nucleare solo in fase S, ma permane a livello citoplasmatico in fase G2. I processi di destrutturazione e ristrutturazione della membrana in fase M consentono il rientro di questo fattore nel nucleo ove eserciter la sua azione nelle prossime duplicazioni delle cellule figlie. Vi sono vari mitogeni quali citochine e fattori di crescita che influenzano il reclutamento in G1 di cellule quiescenti. Essi, stimolando soprattutto lespressione di cicline D, determinano la progressione lungo questa fase fino al punto di restrizione(fattori di competenza). I fattori di progressione sono implicati nel superamento del punto di restrizione in fase G1 e del passaggio alle fasi successive del ciclo( MAPK, JAK). Il prodotto del protoncogene myc agisce in forma di eterodimero insieme a max, si lega in maniera specifica su delle sequenze geniche dette I-BOX(caggtg) determinando aumento o diminuzione dellattivit proliferativa. Il prodotto di myc agisce da regolatore fisiologico (se c un eccesso di fitogeni modula leccessivo stato di proliferazione sttiva, se invece c carenza di fitogeni, esercita unattivit di stimolo della crescita cellulare, in condizioni normali). Se c una

sovra produzione di proteina MAD essa compete con mix per il legame a max per cui pu indurre la repressione di segnali mitogenici o la produzione di proteine ad azione negativa sullattivit proliferativa cellulare. Quando mix(prodotto di myc) associato a max o a miz-1, leterodimero attivo agisce andando a modulare componenti del ciclo: cdk4 e ciclina D2: i loro livelli di sintesi possono essere incrementati la degradazione di p21 e p27: pu essere indotta sia da myc-max, sia da myc-miz1 anche tramite laumento delle proteine legate al processo di degradazione tramite ubiquitinazione delle proteine stesse. da un lato questi eterodimeri lavorano inducendo cdk cicline e dallaltro bloccano le componenti di controllo negativo del ciclo come p21-27. La proteina cul-1 una componente dellenzima E3 del processo di ubiquitinazione. La componente Fbox dellE3 la componente di riconoscimento specifico, quindi tramite questa , E3, riconosce e lega la proteina , lega ubiquitina e ne consente la degradazione. Quindi, quando leterodimero mic-max determina laumento di E3, aumenta lattivit dellubiquitino ligasi e quindi la capacit degradative nei confronti di proteine specifiche( p21 e p27). Tutti questi effetti causano laumento della progressione della cellula lungo il ciclo cellulare e passaggio alla fase S. Tutti gli stimoli mitogenici convergono sul terminale Ciclina D e determinano il rilascio dei fattori di trascrizione. Altri fattori come TGFbeta o RB rallentano il ciclo e ne determinano un arresto. Ciclo Cellulare e Cancro Tutti i prodotti di oncogeni attivati favoriscono la progressione lungo il ciclo cellulare; il contrario fanno gli oncosoppressori. I geni antiapoptotici vengono attivati nella trasformazione neoplastica ed i proapoptotici vengono inibiti durante il processo cancerogenetico. Oncogeni e Ciclo Cellulare I prodotti di protoncogeni sono fatscontrata loverespressione di alcune cicline in particolare quelle della classe D(D1,2,E) che quindi si comportano come veri e propri onctori di crescita(sis), recettori di membrana per questi stessi fattori(Her2/Neu), secondi messaggeri come ras, src, raf e fattori di trascrizione nucleari(jun, fos, myc). In alcuni tumori solidi umani(carcinoma mammario e testicolare) ed in alcune forme leucemiche stata riogeni. Nel carcinoma mammario stata riscontrata loverespressione della fosfatasi cdc25. Oncosoppressori e Ciclo Cellulare p53 alterato in oltre il 70% dei tumori umani. La proteina p53 sintetizzata in seguito a danno genetico. Laumento delle sue concentrazioni aumenta le concentrazioni di p21, che, inibendo le cdk, permette larresto del ciclo cellulare per consentire lattivazione, sempre da parte di p53, dei meccanismi di riparazione del DNA o linduzione di apoptosi. Linattivazione di p53 pu dipendere dalla proteina mdm2, da essa stessa indotta, che in grado di legare p53 ed inattivarla, controllando cos le sue concentrazioni. Unoverespressione di mdm2 determinerebbe uninibizione massiva di p53 e quindi una deregolazione del ciclo, favorendo attivit proliferativa senza controllo. Pu essere inibita dal legame con proteine di virus oncogeni(E1B, E6, Tag) con conseguenze altrettanto cancerogenetiche. Rb alterato in diversi tumori umani, la sua mutazione pu essere associata anche a mutazioni di due cdk:p15 e p16. Anche pRb pu essere inattivata dal legame con proteine virali e la sua perdita stimola lapoptosi. Apoptosi e Ciclo Cellulare (vedi oncogeni ed oncosoppressori) Punti di restrizione: tutte le fasi del ciclo cellulare prevedono la presenza di punti di restrizione (controllo). Lunico conosciuto il check point in fase G1 regolato da p53 ma anche da pRb e TNF beta. Sono stati identificati particolari fattori proteici di regolazione dei punti di restrizione : MAD per il check point in fase S, RAD9, RAD17, RAD24 per il check point in fase G2(solo in drosophila e c. elegans). P53 contribuisce anche alla regolazione del check point in fase G2 e probabilmente in fase M. La lunghezza dei telomeri potrebbe essere inoltre un fattore limitante la progressione del ciclo.

I fattori cui lalterazione stata associata al processo di trasformazione neoplasica sono: fattori di crescita fattori di trasduzione del segnale fattori di trascrizione(ras, rab, myc) cicline (overespresse in alcuni tumori umani come ad esempio ciclina D ed E) inibitori delle cicline sia selettivi che non selettivi i cui geni possono essere meleti(p16 e p21) oncosoppressori pRb e p53 Se si effettua unanalisi citofluorometrica si nota come, in una massa tumorale, vi sia una distribuzione anomala delle cellule trasformate durante le diverse tappe del ciclo: il picco in fase S molto pi elevato rispetto alla condizione fisiologica, a dimostrazione di una intensa attivit proliferativa il picco in fase G1 si riduce fortemente ad indicare che i punti di restrizione sono alterati nel tessuto normale prima del picco G1 presente un pre-picco che indica le cellule che sono in apoptosi, questo pre-picco scompare nella maggior parte dei tumori, ad indicare come il processo di morte cellulare programmata venga deregolato. A disregulation of the cell cycle components may lead to tumor formation. As mentioned above, some genes like the cell cycle inhibitors, RB, p53 etc., when they mutate, may cause the cell to multiply uncontrollably, forming a tumor. Although the duration of cell cycle in tumor cells is equal to or longer than that of normal cell cycle, the proportion of cells that are in active cell division (versus quiescent cells in G0 phase) in tumors is much higher than that in normal tissue. Thus there is a net increase in cell number as the number of cells that die by apoptosis or senescence remains the same. The cells which are actively undergoing cell cycle are targeted in cancer therapy as the DNA is relatively exposed during cell division and hence susceptible to damage by drugs or radiation. This fact is made use of in cancer treatment; by a process known as debulking, a significant mass of the tumor is removed which pushes a significant number of the remaining tumor cells from G0 to G1 phase (due to increased availability of nutrients, oxygen, growth factors etc.). Radiation or chemotherapy following the debulking procedure kills these cells which have newly entered the cell cycle.[10] The fastest cycling mammalian cells in culture, crypt cells in the intestinal epithelium, have a cycle time as short as 9 to 10 hours. Stem cells in resting mouse skin may have a cycle time of more than 200 hours. Most of this difference is due to the varying length of G1, the most variable phase of the cycle. M and S do not vary much. In general, cells are most radiosensitive in late M and G2 phases and most resistant in late S. For cells with a longer cell cycle time and a significantly long G1 phase, there is a second peak of resistance late in G1 The pattern of resistance and sensitivity correlates with the level of sulfhydryl compounds in the cell. Sulfhydryls are natural radioprotectors and tend to be at their highest levels in S and at their lowest near mitosis. An important function of many checkpoints is to assess DNA damage, which is detected by sensor mechanisms. When damage is found, the checkpoint uses a signal mechanism either to stall the cell cycle until repairs are made or, if repairs cannot be made, to target the cell for

destruction via apoptosis (effector mechanism). All the checkpoints that assess DNA damage appear to utilize the same sensor-signal-effector mechanism. The cell cycle according to Temple and Raff, 1986,[1] was meant to function as a clock; but, if this were the case, it would be expected that the stages of the cell cycle must function according to some sort of internal clock, which would determine how long a phase should take. However, the cell cycle is now depicted like the falling dominoes: The preceding phase has to "fall" before the next phase can take place. The cell cycle checkpoints are, therefore, made up of composites of protein kinases and adaptor proteins that all play salient roles in the maintenance of the integrity of the division. The DNA damage checkpoint is always active. Nonetheless, most human cells, for example, are terminally differentiated and must exit the cell cycle. There is a phase late in G1 phase called the restriction point (RP, or the restriction checkpoint); cells that should cease division exit the cell cycle and enter G0. Cells that continually divide in the adult human include hematopoietic stem cells and gut epithelial cells. Therefore, the re-entrant into the cell cycle is possible only by overcoming the RP. This is achieved by growth factor-induced expression of cyclin D proteins. These then overcome the G0 barrier and are able to enter the cell cycle. The main checkpoints that control the cell division cycle in eukaryotes include: [edit] G1 (Restriction) Checkpoint Main article: restriction point The first checkpoint is located at the end of the cell cycle's G1 phase, just before entry into S phase, making the key decision of whether the cell should divide, delay division, or enter a resting stage. Many cells stop at this stage and enter a resting state called G0. Liver cells, for instance, enter mitosis only around once or twice a year.[citation needed] The G1 checkpoint is where eukaryotes typically arrest the cell cycle if environmental conditions make cell division impossible or if the cell passes into G0 for an extended period. In animal cells, the G1 phase checkpoint is called the restriction point, and in yeast cells it is called the Start point. The restriction point is controlled mainly by action of the CKI- p16 (CDK inhibitor p16). This protein inhibits the CDK4/6 and ensures that it can no longer interact with cyclin D1 to cause the cell cycle progression. In growth-induced or oncogenic-induced cyclin D expression, this checkpoint is overcome because the increased expression of cyclin D allows its interaction with CDK4/6 by competing for binding. Once active CDK4/6-CYCLIN D complexes form, they phosphorylate the tumour suppressor retinoblastoma (Rb), which relieves the inhibition of the transcription factor E2F. E2F is then able to cause expression of cyclin E, which then interacts with CDK2 to allow for G1-S phase transition. This brings the cell to the end of the first checkpoint, signaling the G0-G1-S-phase transition. In simpler terms, the CDK inhibitor p16 inhibits another CDK from binding to its cyclin (D). When growth is induced, the expression of this cyclin is so high that they do bind. The new CDK/cyclin complex now phosphorylates retinoblastoma (a tumour suppressor). Un-phosphorylated retinoblastoma inhibits a transcription factor. This factor then brings about the G1-S phase transition. [edit] G2 Checkpoint The second checkpoint is located at the end of G2 phase, triggering the start of the M phase (mitosis). In order for this checkpoint to be passed, the cell has to check a number of factors to ensure the cell is ready for mitosis. If this checkpoint is passed, the cell initiates the many molecular processes that signal the beginning of mitosis. The CDKs associated with this checkpoint are activated by phosphorylation of the CDK by the action of a "Maturation promoting factor" (Mitosis Promoting Factor, MPF). The molecular nature of this checkpoint involves an activating phosphatase, known as Cdc25, which under favourable conditions removes the inhibitory phosphates present within the MPF

complex. However, DNA is frequently damaged prior to mitosis, and, to prevent transmission of this damage to daughter cells, the cell cycle is arrested via inactivation of the Cdc25 phosphatase. This is done by the ATM kinase protein which phosphorylates Cdc25 which leads to its ubiquitinylation and destruction. [edit] Metaphase Checkpoint Main article: Spindle checkpoint The mitotic spindle checkpoint occurs at the point in metaphase where all the chromosomes have/should aligned at the mitotic plate and be under bipolar tension. The tension created by this bipolar attachment is what is sensed, which initiates the anaphase entry. To do this, the sensing mechanism ensures that the anaphase-promoting complex (APC/C) is no longer inhibited, which is now free to degrade cyclin B, which harbours a D-box (destruction box), and to break down securin.[2] The latter is a protein whose function is to inhibit separase, which in turns cuts the cohesins, the protein composite responsible for cohesion of sister chromatids.[3] Once this inhibitory protein is degraded via ubiquitination and subsequent proteolysis, separase then causes sister chromatid separation.[4] After the cell has split into its two daughter cells, the cell enters G1.