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ATTIVITA CELLULARE

Segnale

Attivazione di specifici pacchetti di geni

Esecuzione di uno dei programmi di attivit cellulare

Proliferazione

Differenziamento Arresto e Quiescenza Morte cellulare


Nabissi 2016

Nabissi 2016

MORTE CELLULARE
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MECCANISMI DI MORTE CELLULARE

NECROSI
Evento accidentale
Passivamente subito dalle cellule
Interessa gruppi di cellule
Dovuto a trauma, veleno, anossia, ecc
La lisi della cellula causa fenomeni di inammazione e di autoimmunit

APOPTOSI

Evento programmato
A8vamente realizzato dalle cellule
Interessa cellule singole
Realizzato di norma in condizioni siologiche
La frammentazione della cellula e le modicazioni di supercie favoriscono la fagocitosi

AUTOFAGIA
- PermeFe alle cellule in condizione di malnutrimento o prive di faFori di crescita di
sopravvivere. Se la mancanza di sImoli persiste le cellule si autodigeriscono e
muoiono.
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LA NECROSI
La necrosi, l evidenza strutturale della morte di gruppi di cellule di un tessuto o
di un organo. Nella zona di avvenuta necrosi le delimitazioni extracellulari
scompaiono ed il tessuto si trasforma in una massa amorfa, con conseguente
rilascio di sostante intracellulari negli spazi extracellulari. Questo fenomeno
comporta, spesso, attivazione di un processo infiammatorio in quanto le sostanze
rilasciate dalla cellula necrotica possono richiamare (chemiotassi) i leucociti o
attivare una risposta antigenica

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Necrosi
Le modicazioni ultrastruFurali della cellula, in cui si aKvato il processo di
morte per necrosi, possono essere suddivise come segue:
- Cariolisi (degradazione del DNA causata dallaKvit delle DNasi)
- Picnosi: (riduzione del nucleo)
- Cariolessi: (frammentazione del nucleo picnoIco, no alla sua scomparsa)
- Alterazioni della membrana plasmaIca, deplezione di ATP e della struFura dei
mitocondri, dilatazione del reIcolo endoplasmaIco (per aumento del Ca2+
intracellulare, perdita dellosmolarit cellulare

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CARATTERISTICHE

NECROSI

VOLUME CELLULARE

AUMENTO

NUCLEO

PICNOSI-CARIOLESSI-CARIOLISI

MEMBRANA CITOPLASMATICA

DANNEGGIATA

CONTENUTO CELLULARE

DIGESTIONE ENZIMATICA

INFIAMMAZIONE DELLE AREE


ADIACENTI

FREQUENTE

RUOLO FISIOLOGICO O
PATOLOGICO

SEMPRE PATOLOGICO

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Inoltre la cellula necrotica puo avere un aspetto piu trasparente


rispetto alla cellula normale (perdita del contenuto di glicogeno).
Un altro fenomeno presente nel processo necrotico consiste nella
calcificazione delle cellule, con riempimento della cellula morta con
fosfolipidi degradati (dette figure mieliniche), che vengono poi
degradate dai macrofagi, con formazione di saponi di calcio ed di un
sito infiammatorio.

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STEATONECROSI CON SAPONIFICAZIONE.


Saponi di calcio nelle zone di distruzione
lipidica

Figure mieliniche

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La necrosi del tessuto puo essere classificata come:


Necrosi coagulativa: denaturazione completa della cellula, tessuto duro e biancastro
in cui le proteine possono andare incontro ad un processo di denaturazione. La
necrosi coagulativa implica la conservazione della struttura della cellula per alcuni
giorni, come nel caso dellinfarto del miocardio dove il danno o laumento di acidosi
cellulare denatura le proteine ma anche gli enzimi degradativi .
Un tipo particolare di necrosi coagulativa la necrosi caseosa, che si incontra
spesso nel granuloma tubercolare. Deve il suo nome allaspetto macroscopico del
tessuto (bianco e simile al formaggio). Si distingue dalla normale necrosi coagulativa
perch in essa la normale architettura del tessuto appare completamente scomparsa.

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POLMONE TUBERCOLARE- NECROSI CASEOSA

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La necrosi coagulaIva implica la conservazione della struFura


della cellula per alcuni giorni, come nel caso dellinfarto del
miocardio dove il danno o laumento di acidosi cellulare
denatura le proteine ma anche gli enzimi degradaIvi

A) Miocardio normale, B) cellule del miocardio prive di nucleo


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Necrosi colliquativa: predomina la digestione enzimatica, il tessuto diventa


molle e liquefatto principalmente come conseguenza dellazione degli enzimi litici
rilasciati dai leucociti, richiamati nel sito necrotico (chemiotassi).

La necrosi

colliquativa caratteristica delle infezioni batteriche, dato che questi organismi


stimolano laccumulo di cellule infiammatorie. La completa digestione delle
cellule morte, con conseguente trasformazione del tessuto in una massa fluida e
viscosa, comprende spesso la formazione di pus.

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Necrosi colliquaBva
CaraFerisIca delle infezioni baFeriche, dato che quesI organismi sImolano
laccumulo di cellule inammatorie.
Completa digesIone delle cellule morte, con conseguente trasformazione del
tessuto in una massa uida e viscosa. Spesso conprende la formazione di pus.

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Un altro tipo particolare di necrosi la gangrena che si verifica in un arto


con interruzione completa dellirrorazione sanguigna e conseguente necrosi
coagulativa. Se si sovrappone uninfezione batterica con conseguente
colliquazione si definisce gangrena umida.
Necrosi grassa (steatonecrosi): indica la presenza di zone di distruzione
lipidica causate dal rilascio di lipasi

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Mediatori del processo di necrosi


Specie reaKve dellossigeno, ioni calcio, PARP (polyADPribose polymerase)

PARP una DNA-repair enzyme che puo diminuire fortemente le riserve di ATP
quando catalizza la riparazione del DNA, che avviene durante un danno.

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Proteasi calcio-aKvate non lisosomiali (Calpaine) e catepsine mediano il processo di


necrosi.

Calpaine si aKvano quando la concentrazione di calcio elevata.


Le Catepsine vengono liberate nel citoplasma dopo che le calpaine aKvate compromento
lintegrit delle membrane lisosomiali.
I lisosomi contengono piu di 80 Ipi diversi di enzimi idroliIci, incluso le catepsine. RilasciaI
nel citoplasma quesI enzimi degradano le struFure cellulari, interferendo con il normale
metabolismo, e la morte inevitabile.

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DETERMINAZIONE DEL PROCESSO NECROTICO

Marcatura con PI (ioduro di propidio)

Analisi eleFroforeIca del DNA

AKvazione enzimi degradaIvi


mediante Western Blot analisi

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LA NECROSI INDUCE
INFIAMMAZIONE

LA NECROSI PUO
INDURRE FENOMENI DI
AUTOIMMUNITA
DAMPS: damage-associated
molecular paFerns

APOPTOSI:suicidio cellulare

una modalit di morte cellulare aKva, Ipica delle cellule di


organismi pluricellulari e viene anche descriFa come una forma
di suicidio altruista, in quanto spesso la cellula si sacrica
per il bene dellintero organismo. Le modalit della morte per
apoptosi sono nalizzate a evitare linstaurarsi di fenomeni di
INFIAMMAZIONE e di AUTOIMMUNIT, ed il faFo che non
dia luogo a fenomeni di inammazione fa s che la morte
cellulare non sia avverIta dallorganismo (morte indolore)
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PERCH SI PARLA DI PROGRAMMA APOPTOTICO?


Perch lapoptosi un processo cellulare innescato da induttori specifici, in
quanto richiede la trascrizione di specifici geni. Lapoptosi fisiologica avviene
naturalmente nellorganismo, per favorire leliminazione di cellule che hanno
terminato la loro funzione, in cellule danneggiate o in condizioni dadattamento
cellulare

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SVILUPPO EMBRIONALE/FETALE E METAMORFOSI


NORMALE TURN-OVER TISSUTALE: epitelio intestinale, i neutrofili dopo il
termine dellinfiammazione, linfociti al termine di una risposta immunitaria.
ONTOGENESI E OMEOSTASI DEL SISTEMA IMMUNITARIO:
Leliminazione di linfociti auto-reattivi potenzialmente pericolosi, prima e
dopo la loro formazione e maturazione.
ATROFIA ORMONE-DIPENDENTE: Linvoluzione ormone-dipendente
nelladulto, come la distruzione delle cellule dellendometrio durante il ciclo
mestruale, atresia dei follicoli ovarici nella menopausa, regressione della
mammella dopo svezzamento, atrofia prostatica dopo castrazione.
DEPRIVAZIONE DI FATTORI DI CRESCITA o INDUCENTI: Leliminazione
cellulare in popolazioni cellulari proliferanti.
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APOPTOSI
TOSSINE, FARMACI
RADIAZIONI
INFEZIONI VIRALI
CITOTOSSICIT CELLULO-MEDIATA: la morte cellulare indoFa dai linfociI
citotossici, un meccanismi di difesa contro linfociI infeFaI da virus o contro cellule
tumorali.
Per apoptosi patologica sintende la morte cellulare indoFa da una serie di sImoli
dannosi, ad esempio il danno cellulare in parIcolari malaKe virali, come lepaIte
virale in cui leliminazione delle cellule largamente dipendente dallapoptosi,
latroa patologica negli organi parenchimali dopo ostruzione dei doK (pancreas,
reni) e la morte cellulare nelle neoplasie.

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Quindi lapoptosi si puodefinire un programma intracellulare


strettamente regolato, in cui le cellule destinate a morire
attivano enzimi che degradano il DNA, le proteine nucleari e
citoplasmatiche. La membrana citoplasmatica rimane intatta
ma la struttura della cellula si altera a tal punto da essere
bersaglio di cellule fagocitarie .

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Immagini di cellule in apoptosi

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CARATTERISTICHE

NECROSI

APOPTOSI

VOLUME CELLULARE

AUMENTO

RIDOTTO

NUCLEO

PICNOSI-CARIOLESSICARIOLISI

FRAMMENTAZIONE

MEMBRANA
CITOPLASMATICA

DANNEGGIATA

INTATTA

CONTENUTO
CELLULARE

DIGESTIONE
ENZIMATICA

INTATTO, PUO ESSERE


SECRETO IN CORPI
APOPTOTICI

INFIAMMAZIONE
DELLE AREE
ADIACENTI

FREQUENTE

NO

RUOLO FISIOLOGICO O
PATOLOGICO

SEMPRE PATOLOGICO

SPESSO FISIOLOGICO,
MEZZO PER
ELIMINARE LE
CELLULE

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CARATTERISTICHE BIOCHIMICHE DELLAPOPTOSI


Le cellule apoptoIche mostrano delle caraFerisIche biochimiche che sono alla
base delle modicazioni struFutali descriFe.

CLIVAGGIO DELLE PROTEINE
La degradazione delle proteine coinvolge le CASPASI, proteasi cisteina-dipendenI,
che sono presenI, come proenzimi, nella cellula in condizione siologica e devono
essere aKvaI per indurre apoptosi. Le caspasi oltre che distruggere altre proteine
aKvano Dnasi che degradano il DNA.

AUMENTO DELLA CONCENTRAZIONE DI Ca2+ INTRACELLLULARE
Le modicazioni biochimiche della membrana plasmaIca inducono variazioni
osmoIche ed della concentrazione eleFroliIca nella cellula apoptoIca. Tali
variazioni inducono entrata di Ca2+ dallambiente extracellulare e rilascio di Ca2+
dai deposiI intracellulari (reIcolo endoplasmaIco liscio, mitocondri). Laumento
di Ca2+ alla base dellaKvazione di diversi enzimi con aKvit degradaIvi verso
proteine e DNA.
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MECCANISMI di a8vazione dellAPOPTOSI


LAPOPTOSI E INDOTTA DA STIMOLI ESTERNI E/O INTERNI, IN GRADO DI
ATTIVARE DUE VIE (PATHWAYS) IN PARTE DISTINTE CHE VENGONO IDENTIFICATI
COME:
PATHWAY INTRINSECO, controllato dalla permeabilizzazione della membrana
mitocondriale
PATHWAY ESTRINSECO, nel quale receFori di morte sImolano la cascata
di evenI apoptoIci.
I mediatori di entrambi i pathways sono LE CASPASI, infaK il processo
apoptoIco consiste in una fase iniziatrice (durante la quale vengono aKvate
le caspasi iniziatrici) e in una fase eeFrice in cui il secondo gruppo di caspasi
(eeFrici) agiscono per indurre la morte cellulare.
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CASPASI

C = cisteina nel centro reaKvo; ASP = riconoscono un residuo di acido asparIco


nellambito di una sequenza di 4 aminoacidi; ASI = sono enzimi proteoliIci
Le caspasi sono presenI nel citoplasma in forma di zimogeni e vengono aKvate
successivamente allaKvazione dei pathways apoptoIci.
Le caspasi iniziatrici (2, 8, 9, 10) sono aKvate dagli adaFatori; a loro volta
aKvano le caspasi eeFrici (3, 6, 7). (La caspasi 1, 4, 5 sono coinvolte nella
maturazione di citochine).
LaKvazione consiste nel taglio proteoliIco, con formazione di due frammenI; i 2
frammenI brevi e i 2 frammenI lunghi di due caspasi uguali formano un tetramero
(forma aKva) .

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ROTTURA DEL DNA


Il DNA viene tagliato in mulIpli di 180-200 bp da endonucleasi Mg2+ e Ca2+ dipendenI
RICOGNIZIONE FAGOCITARIA
Le cellule apoptoIche esprimono fosfaAdilserina sulla parte esterna della membrana
(evidenziabile colorando le cellule con annexina V).
Queste modicazioni a livello di membrana possono essere riconosciute dai macrofagi che
fagocitano cos le cellule apoptoIche.
A- DNA cellule integre
B- DNA di cellule in apoptosi
C- DNA di cellule in necrosi

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Apoptosis and Necrosis


analysis

Annexin + PI Facs Analysis

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APOPTOSI ESTRINSECA

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Via ApoptoIca Estrinseca


La via estrinseca o pathway dei receFori di morte aKvata dalla famiglia dei
receSori del TNF (tumor necrosis factor), la quale composta da receFori che
inoltre hanno un ruolo fondamentale nel mantenere lomeostasi cellulare e nel
riconoscimento immunitario. LaKvazione di questa via si ha quando un ligando di
morte si lega al dominio extracellulare del suo receFore con conseguente
aKvazione delle caspasi iniziatrici.
La famiglia di tali receFori composta da diversi membri, i quali sono
dierentemente espressi nelle varie popolazioni cellulari. QuesI receFori sono:
- TNFR1 ( receFore del TNF)
-CD95 (denominato anche Apo1 o Fas)
-TRAIL-R1, -TRAIL-R2, NGFR

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TNF; tumor necrosis factor o FasL; ligando del receFore


Fas) si associa alla porzione extracellulare del receFore, il
Il receFore trimerizza e la Porzione intracellulare,
caraFerizzata da un dominio DD (Death Domain), dirige
la formazione di un complesso Proteico denominato DISC
(death-inducing signaling complex) mediante il
reclutamento di una specica proteina adaFatrici FADD
(Fas-associated death domain, per il Fas) o TRADD (TNFR-
associated death domain) per il TNFR. Questa proteina
trasporta un dominio DED (death eector domain) che
permeFe di reclutare le pro-caspasi 8 e laKvano
(induzione per prossimit). La caspasi-8 aKvata agisce
aKvando la pro-caspasi 3 che agisce sui substraI sensibili.

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In alcuni Ipi cellulari le caspasi 8 non sono parIcolarmente ecaci nel clivaggio della caspasi 3 e
quindi agiscono sulla proteina BID che troncata dalla caspasi 8, in forma corta (t-BID) trasloca nella
membrana mitocondriale dove si lega ed aKva BAX e BAD. Questa aKvazione permeFe la
traslocazione di BAX nello strato esterno della membrana mitocondriale, causando
loligomerizzazione di BAX e BAD con conseguente rilascio di citocromo c ed inibizione delle IAP
(inhibitor of apoptosis pathways) stabilendo un legame fra via estrinseca e via intrinseca.

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INIBITORI DELLAPOPTOSI (cFLIP)


Unaltra proteina che regola
negaIvamente lapoptosi
interferendo con laKvazione delle
caspasi la proteina FLICE (cFLIP o
usurpina), che conIene un dominio
DED mancante del
sito cataliIco aKvo e dei residui
aminoacidici che formano il paccheFo
di proteine
necessarie (DISC) per aKvare la procaspasi 8.

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LINIBIZIONE DEL SEGNALE


APOPTOTICO PUO INDURRE
PROLIFERAZIONE
CELLULARE

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APOPTOSI
INDOTTA DAI
LINFOCITI
CITOTOSSICI

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SUBSTRATI DELLE CASPASI EFFETTRICI

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Substrati sensibili

CAD (deossiribonucleasi caspasi-sensibile): presente nel citosol in forma


inattiva e mediante distacco dellinibitore causato dalla caspasi 3, la CAD
migra nel nucleo degradando i nucleosomi, frammentando il DNA in
frammenti di circa 180 bp.

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PARP-1 (poli-ADP-ribosio polimerasi) che inaKvata dalla caspasi 3 , non puo piu
svolgere la funzione di enzima responsabile della riparazione del DNA e dinibitore delle
endonucleasi.

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Casp-3 e degradazione delle proteine del citoscheletro

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VIA INTRINSECA
La via intrinseca attivata da stress cellulari (deprivazione di fattori di crescita,
ipossia, danno al DNA) o agenti antitumorali. Nelle cellule normali, il danno al DNA
puo indurre due possibili reazioni; la riparazione e/o la tolleranza del danno,
oppure la stimolazione della cascata di segnali che inducono la morte della cellula
danneggiata. Nella trasformazione neoplastica queste reazioni sono
normalmente alterate.
Le principali lesioni letali al DNA sono le rotture del doppio filamento (double strand
breaks; DSB), le quali sono riconosciute da proteine (chinasi) con capacit di
riparazione. Una di queste proteine ATM (ataxia telangiectasia mutated) attivata
dopo lesione del DNA indotta da radiazioni ionizzanti. ATM induce la fosforilazione
di diversi substrati coinvolti con il blocco del ciclo cellulare e nellinduzione
dellapoptosi (p53, CHK1, CHK2, p21). In base al danno o alla capacit di
riparazione p53 puo indurre la trascrizione di geni pro-apoptotici (Bax, PUMA)
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La via mitocondriale

LaKvazione della via mitocondriale si aKva mediante una


permeabilizzazione della membrana mitocondriale interna con
conseguente dissipazione del gradiente di protoni che
responsabile del potenziale transmembrana mitocondriale. La
permeabilizzazione coinvolge anche la membrana mitocondriale
esterna con conseguente perdita di proteine solubili, normalmente
connate negli spazio intermembranali dei mitocondri.

QUALE MECCANISMO INDUCE LA PERMEABILIZZAZIONE?


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La formazione di pori di transizione di membrana a livello mitocondriale coinvolge


proteine pro-apoptoIche della famiglia Bcl-2 (es. Bax, tBid )
La permeabilizzazione della membrana interna avviene come conseguenza della
formazione di pori non specici (indoK da sImoli apoptoIci).
Canali anionici voltaggio-dipendenI (VCAD), che sono le proteine maggiormente
presenI nella membrana mitocondriale esterna. In condizione normale quesI
canali sono permeabili a proteine con un peso molecolare no a 5kD.
La formazione dei pori di transizione di membrana nasce dalla fusione dei VCAD con i
pori aspecici (modello 2), soFo il controllo delle proteine della famiglia Bcl-2.

QUALUNQUE SIA IL MODELLO, LA PERMEABILIZZAZIONE DELLE


MEMBRANE MITOCONDRIALI INDUCONO LA FUORIUSCITA DEL
CITOCROMO C NEL CITOPLASMA.
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intermembrane space (IMS)


proteins that directly bind
XIAP and antagonize its ability
to inhibit caspases

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Via intrinseca

Lo sImolo che induce la via intrinseca induce la permeabilizzazione


della membrana mitocondriale esterna e rilascio del citocromo c
che si lega al faFore Apaf-1 (apoptoIc protese-acIvaIng factor-1)
inducendo oligomerizzazione e cambiandone la sua conformazione.
Questo cambiamento comporta lesposizione del DOMINIO DI
RECLUTAMENTO DELLE CASPASI (ARD), in presenza di ATP.
Apaf-1, cosiin grado di reclutare ed aKvare la pro-caspasi 9
formando un complesso chiamato APOPTOSOMA, il quale aKva la
pro-caspasi 9, che a sua volta aKva le caspasi eeFrici (3, 6, 7) con
conseguente inizio dei fenomeni apoptoIci (frammentazione del
DNA, disgregazione del citoscheletro, ecc..).

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MODULATORI DELLAPOPTOSI

Localizzandosi sulla membrana esterna del mitocondrio, favoriscono (se proapoptoIci) o rendono meno facile (se anI-apoptoIci) la formazione di megacanali
e la conseguente fuoriuscita di molecole pro-apoptoIche
Sono struFuralmente simili tra loro (domini BH1-4 + dominio transmembrana)
AnI-apoptoIci: Bcl-2, BclXL,
Pro-apotoIci: Bad, Bax, Bak, Bid
SImoli endogeni ed esogeni agiscono sulla propensione allapoptosi della cellula
alterando la loro quanIt, localizzazione e stato di aKvit

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La famiglia Bcl-2
Il gene Bcl-2 (B-cell leukemia/lymphoma 2) fu idenIcato nelle cellule B del
linfoma follicolare e la sua over-espressione antagonizza linduzione
dellapoptosi mediata da diversi sImoli, compresi quelli da chemioterapici. La
sua over-espressione in diversi Ipi di tumore contribuisce alla crescita cellulare
ed in combinazione con lover-espressione di altri oncogeni (c-myc), alla
trasformazione neoplasIca.
Diversi membri della famiglia Bcl-2 sono staI idenIcaI e caraFerizzaI per la
loro funzione pro-apoptoIca e quindi potenziali oncosoppressori (Bax, Bak, Bim,
Bid.), o funzione anI-apoptoIca e quindi potenziali oncogeni (Bcl-2, Bcl-XL, ..).
Inoltre il genoma di alcuni virus patogeni (Epstein-Barr, sarcoma di Kaposi virus)
codicano per proteine simili a Bcl-2.

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Le proteine anI-apoptoIche Bcl-2 contengono quaFro domini conservaI


BH (1-4), omologhi a Bcl-2, mentre i membri pro-apoptoIci possono essere
suddivisi in quelli con tre domini omologhi (Bax, Bak) o con solo il dominio BH3
conservato (Bid, Bim, Bad).

Inoltre molI di quesI membri contengono regioni carbossi-terminali che hanno
anit per le membrane, in parIcolare quella esterna dei mitocondri.

In assenza di segnali di morte, molI membri pro-apoptoIci sono localizzaI nel
citosol o nel citoscheletro e solo dopo segnali di morte assumono una
modicazione conformazionale che li rende capaci di migrare verso le membrane
mitocondriali.

Le interazioni fra membri pro ed anI-apoptoIci modula la redistribuzione del
citocromo c nel mitocondrio.
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a) Le proteine pro-apoptoIche possono essere suddivise in eeSori (causano depolarizzazione) o solo


BH3 (sensibilizzatori, trasmeFono il segnale apoptoIco agli eeFori).
b) Modello indireSo: BAX e BAD sono legaI ed inibiI da Bcl-2 quando sono nello stato
cosItuIvamente aKvo e il legame di BH3 a Bcl-2 suciente per liberare Bad/BAX. Modello
direSo: Bad/Bax sono aKvaI da BH3 e Bcl-2 previene la depolarizzazione della membrana
mitocondriale sequestrando BH3 o inibendo Bad/Bax aKvaI.
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VIA INTRINSECA
Fattori stimolanti lapoptosi

Le altre proteine pro-apoptotiche, (come BID), cooperano con BAX e BAD


nellindurre il rilascio di citocromo c.
Inoltre il dimeri Bax-Bid induce il rilascio di AIF (Apoptosis Inducing Factor)
e Smac/DIABLO che blocca i fattori IAP (proteine inibitrici lapoptosi).
AIF collabora nellindurre il rilascio di citocromo c, ma ha anche la capacit
di traslocare nel nucleo ed indurre la condensazione della cromatina e
lapoptosi mediante una via caspasi indipendente (attivazione di
endonucleasi).

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Inibitori dellapoptosi
(IAP family)

Le proteine IAP (Inhibitor of Apoptosis Protein) sono proteine altamente


conservate e sono caraFerizzate da almeno un dominio BIR (baculovirus
inhibitor of apoptosis repeat).

Questo dominio presente in diverse proteine fra cui cIAP1, cIAP2, XIAP e
Survivina.

La maggior parte delle proteine IAP son altamente espresse nei tessuI
embrionali e quasi assenI nelle cellule dierenziate, mentre la loro espressione
aumenta nelle cellule tumorali.

Le IAP si legano e rendono inaKve le caspasi, ma possono svolgere un ruolo
inibitorio del processo apoptoIco anche legandosi alle proteine pro-apoptoIche
Smac/DIABLO (proteine che promuovono laKvazione delle caspasi, riducendo
linibizione delle caspasi IAP-mediata).
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Il citocromo c si lega ad APAF-1 monomero e ne induce la eptamerizzazione, formando


lapoptosoma. Livelli siologici di ATP o tRNA bloccano il legame del citocromo c ad APAF-1
Citocromo c richiede una molecola di Fe, fornita dalla spazio intermembranale, per potersi
legare ad APAF-1.
La fosforilazione della caspasi-9 da parte delle chinasi cicline dipendenN (CDK)-B [ciclo
cellulare] e ERK 1/2 [proliferazione], inibiscono la caspasi 9, mediante un meccanismo
ancora sconosciuto.
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APOPTOSI DOVUTA A DANNO DEL DNA


La duplicazione cellulare accuratamente regolata da un complesso di proteine che sono le
cicline e le chinasi ciclina dipendenI (CDKs).

Per evitare la replicazione di DNA danneggiato durante la fase S o la sua segregazione
durante la fase M, lintegrit del DNA monitorata da una serie di vie di trasduzione del
segnale che possono inibire la progressione del ciclo cellulare mediante inibitori che
interagiscono con i complessi C/CDK, permeFendo la riparazione del DNA.

QuesI controlli avvengono in due fasi del ciclo (G1 e G2).

Il controllo del DNA nella fase G1 coinvolge due chinasi (ATR e ATM) che fosforilano
p53 aKvandolo o distaccando il suo inibitore MDM2.

Il faFore trascrizionale p53 aKva la trascrizione di geni (p21) il cui prodoFo inibisce la
sintesi di cicline e la fosfoforilazione di Rb.

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Regolazione trascrizionale dei Bcl-2

Un ulImo meccanismo che regola lespressione e la funzione di Bcl-2 la


sua regolazione trascrizionale. p53 si lega al promotore del gene Bax
mentre down-regola lespressione di Bcl-2.

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Caspasi e HSP

Hsp70 e Hsp27 agiscono sequestrando APAF-1 e Cit. C, prevenendo la


maturazione della casp-9 e di conseguenza inibendo lapoptosi. LeeSo
inibitorio agisce anche a livello della cas-3
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NF-kB ed Apoptosi
Per quanto riguarda il ruolo del faFore trascrizionale NF-kB
nellambito del processo apoptoIco, ben descriFo come NF-kB
inibisca lapoptosi mediante aKvazione di faFori anI-apoptoIci
della famiglia Bcl-2 (in parIcolare il gene Bcl-xL) o del gene FLIP
(faFore inibitore dellapoptosi). Comunque in altre situazioni
siologiche NF-kB induce la morte cellulare mediante aumento
dellespressione di p53 o aKvando lespressione dei geni per Fas o
FasL. In sintesi il ruolo di NF-kB nel processo apoptoNco sembra sia
regolato dalla condizione siologica e dal Npo di popolazione
cellulare.

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AUTOFAGIA
Autofagia (autodigesIone) si
riferisce a pathways cellulari che
coinvolgono il trasporto di
porzioni citoplasmaIche ai
lisosomi.
1) vesicle nucleaIon
(formazione di membrane
(fagofori).

2) Allungamento delle vescicole
e completamento (crescita e
chiusura).

3) Fusione dellautofagosoma
con il lisosoma.

4) Lisi delle membrana dell
autofagosoma e degradazione
del suo contenuto

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Autofagia aumenta :

1. Per turnover delle proteine e
organelli citoplasmaIci
2. Generazione intracellulare di
nutrienI ed energia (es. durante il
digiuno, riduzione di faFori di
crescita, aumento della domanda
bioenergeIca)

3. Temperatura, concentrazione di O2,
densit cellulare
REGOLATORI CHIAVE DELLAUTOFAGIA:

TOR kinase complex,

Class III PI3K
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Lalterazione nei dierenI sTeps


dellautofagia ha diverse conseguenze:

reduced o-rate: risulta in una
d e g r a d a z i o n e l i s o s o m i a l e
compromessa, con accumulo di
autofagosomi.


decreased on-rate : nei dife8
(mutazioni, delezioni) di geni ATG si
ha riduzione di vacuoli autofagici e
accumulo di proteine aggregate e
danni agli organuli intracellulari.

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Fluorescence microscopy (Acidotropic dyes)


Lysotracker Red
Weakly basic amines selecIvely accumulate
in cellular compartments with low internal
pH and can be used to invesIgate
the biosynthesis of lysosomes.

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Invecchiamento cellulare
Linvecchiamento un processo determinato
esclusivamente da FATTORI GENETICI (teoria
geneIca)
Linvecchiamento dipende da evenI casuali
che colpiscono gli organismi vivenI nel corso
della loro esistenza (Teoria StocasIca)
faSori esogeni + faSori endogeni
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LE CARATTERISTICHE DELLINVECCHIAMENTO

Le caraSerisBche sono:
1. Instabilit genomica
2. Logoramento dei telomeri
3. Alterazioni epigeneIche
4. Perdita di proteostasi
5. De-regolazione
dellassorbimento di nutrienI
6. Disfunzioni mitocondriali
7. Senescenza cellulare
8. Esaurimento cellule staminali
9. Alterazione della
comunicazione intercellulare

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Instabilit genomica
Accumulo di danni geneIci durante la vita:
1. Mutazioni punIformi
2. Traslocazioni geniche
3. Perdita o guadagno di cromosomi
4. Dis-regolazione genica causata da
integrazione virale o trasposoni
DDR: DNA Damage Response meccanismi in grado di
controllare e riparare i danni
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Alterazioni epigeneIche
I cambiamenI epigeneIche coinvolgono alterazioni nella meIlazione del
DNA, modicazioni post-traduzionali degli istoni e rimodellamento della
cromaIna.
H4K16: istone aceIlasi
H4K20: trimeIlazione
H3K9: meIlazione
SIR2: deaceIlasi
Sono geni, consideraB markers epigeneBci, associaB allinvecchiamento

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Logoramento dei telomeri

I telomeri sono legaN ad un complesso mulNproteico denominato Shelterin e il


logoramento dei telomeri associato a perdita della funzionalit di questo complesso
proteico. In modelli sperimentali (loss of FuncBon) si ha un rapido declino della
rigenerazione Bssutale ed un acceleramento dei processi dinvecchiamento
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Perdita di Proteostasi

Perdita dei meccanismi di controllo della qualit, stabilit e funzionalit.


QuesN sistemi funzionano in modo coordinato per ristabilire la struZura delle
proteine appaiate in modo non correZo, rimuovere e degradare quelle
danneggiate
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Disfunzioni mitocondriali

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De-regolazione dellassorbimento di nutrienI


Lasse somatotropico, comprende il GH,
prodoFo dalliposi anteriore e il
mediatore secondario IGF-1 (prodoFo
da molI Ipi celluari).
IGF-1 signaling fortemente correlato
con linvecchiamento, in parIcolare
aFraverso FOXO e mTOR.

Polimorsmi o mutazioni che riducono
il sistema IGF sono correlaI con la
l o n g e v i t ( p a t h w a y s t r o c i e
bioenergeIci).

La restrizione calorica correlata
allinvecchiamento normale e alla
longevit.

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Senescenza cellulare
La senescenza cellulare denita
come larresto stabile del ciclo
cellulare accoppiata a cambiamenI
fenoIpici.
L a s e n e s c e n z a c a u s a t a
dallaccorciamento dei telomeri e
da fenomeni indipendenI dai
telomeri.
Danni al DNA e de-repressione del
l o c u s I N K 4 / A R F a v v e n g o n o
p r o g r e s s i v a m e n t e e
c r o n o l o g i c a l m e n t e c o n
linvecchiamento
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Senescenza cellulare
Le cellule in senescenza in un tessuto sono circa un 20%
(analisi del DNA danneggiato e della beta-galaFosidasi
(SABG))
Quindi la senescenza cellulare non un conceFo
generalizzato di tuK i tessuI di un organismo
L e c e l l u l e i n s e n e s c e n z a s o n o s o g g e F e a
immunosorveglianza e fagocitate.
La senescenza, previene la propagazione di cellule
danneggiate e sImola il sistema immunitario.
Quindi la senescenza una risposta compensatoria che
contribuisce a proteggere i tessuI da cellule danneggiate e
cellule tumorali
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Delezione di INK4/ARF

BubR1 progeroid mouse

BubR1 progeroid mouse lacking p16Ink4a

SABG staining
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Meccanismi aFraverso cui la rimozione delle cellule in senescenza dai tessuI invecchiaI puo
inuire sulla funzionalit Issutale.
Le cellule invecchiate mantengono comunque caraFerisIche e danni anche in assenza di
cellule in senescenza, dimostrando che i tessuB non possono regredire a condizioni preinvecchiamento.
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Metodi per analizzare laMvit della SA-gal


Cytochemical assay uses the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3- indoyl -Dgalactopyranoside (X-gal), which yields an insoluble blue compound when cleaved by
-galactosidase.

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