Capitolo 1: La Chimica Analitica

Campione è il materiale che deve essere analizzato. Può essere prelevato dall’analista o consegnato «sul
campo» dall’analista e portato in laboratorio.
Analita è la specie della quale si vuole determinare la presenza (analisi qualitativa) o la concentrazione
(analisi quantitativa) nel campione in analisi.
Matrice è tutto ciò che è contenuto nel campione, tranne l’analita. L’analita può essere: Componente
principale: rappresenta oltre l'1% del campione. Componente minore: presente in quantità comprese tra
0,01% (100 ppm) e 1%. Componente in tracce: presente in quantità < 0,01% (100 ppm).
La chimica analitica è la disciplina scientifica che sviluppa e applica metodi, strumenti e strategie per
ottenere informazioni sulla composizione e natura della materia nello spazio e nel tempo. La chimica
analitica è in grado di rispondere essenzialmente a quattro domande sul campione: Cosa? Dove? Quanto?
In che forma, quale struttura?
La chimica analitica moderna si occupa della determinazione, identificazione e misura della
composizione chimica di campioni sconosciuti utilizzando tecniche strumentali esistenti, e lo sviluppo o
applicazione di nuove tecniche e strumenti. È una scienza quantitativa, il che significa che il risultato
desiderato è quasi sempre un numero accompagnato da una unità di misura e da una stima dell’errore
associato all’analisi.
Il Processo Analitico
Consiste nella preparazione del campione che è suddiviso in: Campionamento, Estrazione,
Purificazione, Concentrazione/Diluizione. Successivamente, si ha la Determinazione analitica
(calibrazione). Infine, Interpretazione, Quantificazione e Analisi statistica.
I passaggi comuni nell’analisi chimica In tutti i processi analitici è possibile individuare una serie di
passaggi comuni:
[Link] la domanda: tradurre domande generiche in domande specifiche che possano trovare risposta
mediante misurazioni chimiche. Ad es. identificare analita, campione e matrice.
[Link] le procedure analitiche: cercare nel letteratura chimica procedure più appropriate, oppure
idearne di nuove per effettuare le misurazioni richieste.
[Link]: scegliere una porzione rappresentativa del materiale oggetto dell’analisi, su cui eseguire le
misurazioni.
[Link] il campione: trasformare il campione che abbiamo scelto come rappresentativo in una forma
idonea per l’analisi chimica.
[Link] il campione: misurare l’analita in più aliquote identiche del campione, applicando il metodo
scelto. Si ottengono così misure ripetute della grandezza che vogliamo determinare.
[Link] i risultati: valutare mediante gli strumenti della statistica i risultati ottenuti, in modo da
ottenere la risposta «statisticamente» corretta alla domanda analitica.
[Link] i dati: produrre un resoconto scritto sui risultati ottenuti, che sia comprensibile a chi ci ha
posto il problema.

La qualità del risultato di un’analisi dipende dalla accuratezza di tutte le procedure sperimentali che a
partire dal materiale grezzo da analizzare portano al risultato finale: gli errori compiuti nei vari stadi della
procedura determinano l’errore complessivo del risultato.

L'obiettivo di una analisi chimica quantitativa è quello di fornire una misura affidabile della quantità di
analita contenuto in un campione. Ogni misura quantitativa è soggetta ad un errore sperimentale. Esiste
una incertezza nel risultato che non può mai essere completamente eliminata. Il compito del chimico
analitico è duplice: cercare di minimizzare gli errori; effettuare una stima dell’entità dell’errore. Una
Misura è l’informazione costituita da un numero, una incertezza ed una unità di misura, assegnata a
rappresentare un parametro in un determinato stato del sistema. Come ogni misura, il risultato di
un’analisi chimica quantitativa è soggetto ad un errore che deve essere valutato, poiché una misura ha
valore solo se è noto il suo errore. Un’analisi dovrebbe essere sempre ripetuta su più campioni del
materiale da analizzare (replicati). Questo permette di ottenere informazioni sull'errore presente e
migliorare l'affidabilità del risultato.

Tipi di errore
Errore casuale: (o indeterminato) Questo errore è sempre presente in una misura ed ha un valore
variabile per ogni replicato. Può essere studiato solo con un approccio statistico. È dovuto a limitazioni
intrinseche e non eliminabili nelle procedure di misura.
Errore sistematico: (o determinato) Questo errore non è sempre presente ed ha un valore costante per
ogni replicato. Deriva da cause definite che possono (in linea di principio) essere individuate ed
eventualmente eliminate.
Errori casuali e sistematici sono indipendenti fra di loro e possono presentarsi in tutte le possibili
combinazioni.
Errore grossolano: Questo errore si presenta occasionalmente in una serie di replicati. Ha un valore
imprevedibile e non può essere analizzato dettagliatamente. Deriva in genere da errori commessi
dall’operatore.

La distribuzione dei risultati fornisce informazioni su errore casuale ed errore grossolano. Il confronto del
risultato finale dell'analisi (solitamente la media dei replicati) con il valore vero permette di individuare
un errore sistematico.
Stima dell’errore

Effettuando un’analisi su una serie di replicati si possono quindi ottenere:

- Un valore “migliore” per il risultato dell’analisi. Il valore centrale di determinazioni una serie di
viene utilizzato come rappresentativo di tutto l’insieme dei dati ed è una stima migliore del valore
vero, rispetto alla singola determinazione.
- Un valore “migliore” per il risultato dell’analisi. Il valore centrale di determinazioni una serie di
viene utilizzato come rappresentativo di tutto l’insieme dei dati ed è una stima migliore del valore
vero, rispetto alla singola determinazione.
Misura della tendenza centrale: da una serie di replicati (n osservazioni di una variabile x), si può
calcolare un valore “migliore” per il risultato dell’analisi. Questo è rappresentato dalla media aritmetica
dei replicati.
x 1+ x 2 +…+ x n
x=
N
L’accuratezza di una misura indica la vicinanza del valore ottenuto (generalmente espresso attraverso la
media) al valore vero. Viene espressa attraverso l’errore della misura:
Errore assoluto
Errore Relativo
Errore percentuale
Errore relativo ed errore relativo percentuale sono preferibili perché indicano immediatamente l'entità
dell'errore. In base al suo valore, l'errore relativo può essere espresso anche in altre unità, es. parti per
mille (‰), parti per milione (ppm), parti per miliardo (ppb).
Errore sistematico

L’errore sistematico ha una causa definita che può (in linea di principio) essere individuata. Può essere
corretto eliminandone la causa (es. calibrando la strumentazione) o applicando una opportuna correzione
al risultato ottenuto. L'individuazione dell'errore sistematico richiede l'analisi di campioni a
concentrazione nota di analita:
- Analisi di materiali di riferimento certificati: Per tenere conto di tutti i fattori che influenzano il
risultato (es. un effetto matrice dovuto ad altre sostanze presenti nel campione) dovrebbero essere
impiegati campioni reali o almeno con caratteristiche simili.
- Analisi di campioni prodotti artificialmente: Questo approccio è applicabile solo per campioni con
composizione relativamente semplice, nota e riproducibile.
- Analisi di campioni fortificati: permette di verificare la concordanza fra concentrazione misurata ed
aggiunta effettuata. Se il campione da fortificare contiene già l'analita, si verifica invece se
l’incremento di concentrazione corrisponde all'aggiunta effettuata.
- Analisi parallele con un metodo di riferimento: Nel confronto del risultati con i valori attesi
bisogna tenere conto anche dell'errore casuale presente nelle misure. Si usano test statistici per
stabilire se una differenza fra i risultati è realmente dovuta a un errore sistematico.

Errore casuale

Quando si effettuano un numero n di osservazioni della variabile x, è necessario analizzare la dispersione

dei dati intorno al valore medio.
Deviazione Standard del Campione:
La precisione (o riproducibilità) di una misura esprime il grado di concordanza fra misure ripetute di uno
stesso campione, cioè la dispersione dei dati rispetto al loro valore medio.
Determinare la precisione di una misura (dispersione dei risultati ottenuti per i replicati). Viene espresso
attraverso grandezze di tipo statistico:
Deviazione standard relativa
Coefficiente di variazione
L'errore casuale viene determinato analizzando la distribuzione dei risultati ottenuti dai replicati del
campione: maggiore è il numero dei replicati analizzati, migliore è la stima dell'errore casuale dell'analisi.
La determinazione dell'errore casuale non richiede la conoscenza della concentrazione reale del campione
(potrebbe essere effettuata anche su campioni incogniti).
Precisione ed accuratezza sono indipendenti fra di loro, misure precise possono essere poco accurate e
viceversa.

Errore grossolano

Si presenta solo occasionalmente in una analisi e spesso origina un outlier. Deriva solitamente da un
errore umano ed è imprevedibile, sia come frequenza che come entità. Per stabilire se una misura è
effettivamente dovuta ad errore grossolano (e non deriva invece da un elevato errore casuale) è
necessario impiegare test statistici.

Statistica su piccoli insiemi di dati

L’analisi dei risultati di un esperimento dovrebbe basarsi sui valori reali delle grandezze misurate, ma
dovendo usare dati determinati sperimentalmente bisogna anche tenere conto della non rappresentatività
dei campioni. Si fa uso di tools statistici per analizzare i risultati sperimentali: intervallo di fiducia, Test
F, Test T e Test G.

Stima dell’errore dell’analisi

In statistica, la curva gaussiana è la funzione che riporta la frequenza relativa, o

probabilità, (y) delle varie deviazioni dalla media in funzione del valore della
deviazione. Una curva gaussiana è definita univocamente da due soli parametri, la
media della popolazione () e la deviazione standard della popolazione (). L’area
complessiva compresa sotto la curva è unitaria: la curva gaussiana descrive una
probabilità; quindi, la probabilità totale deve essere unitaria. Le proprietà
fondamentali della gaussiana sono: la media si trova nel punto centrale, corrispondente alla massima
frequenza; la curva è simmetrica rispetto alla media; la frequenza delle deviazioni decresce
esponenzialmente all’aumentare del loro valore.

Intervallo di fiducia

Un limitato set di misure non permetterà mai di determinare il valore vero µ di una grandezza, poiché
questo richiederebbe un numero infinito di misure. Utilizzando la statistica è però possibile stabilire, sulla
base dei dati sperimentali, un intervallo di valori (intervallo di fiducia o di confidenza) all’interno del
quale esiste in assenza di errori di tipo sistematico una certa probabilità di trovare la media µ della
popolazione. La definizione: intervallo di valori centrato attorno al valore della media sperimentale x,
all’interno del quale ci si aspetta di trovare con una certa probabilità (livello di fiducia) il valore della
media  della popolazione.
Probabilità di trovare  in questo intervallo: livello di fiducia. Probabilità di trovare  fuori da questo
intervallo: livello di significatività.
L’intervallo di confidenza è dato dalla formula:
dove il parametro numerico t (“t di Student”) dipende sia dal livello di fiducia che dal numero di dati
disponibili. I gradi di libertà per la ricerca del valore di t in tabella sono N-1.
Il livello di fiducia è un parametro fondamentale nel determinare l'ampiezza dell’intervallo di fiducia:
valori più elevati (ovvero maggiori probabilità di trovare µ nell'intervallo di fiducia) corrispondono ad
ampiezze maggiori.

Test di significatività

Il confronto fra dati sperimentali è alla base del metodo scientifico, ma deve essere effettuato tenendo
conto delle incertezza legate alla non rappresentatività dei campioni. Un test di significatività indica se,
ad un livello di fiducia stabilito, un andamento osservato sperimentalmente (es. una differenza fra due
misure) è reale o dovuto alla non rappresentatività del campione, e quindi è solo apparente. In termini
statistici, un test di significatività è una verifica di ipotesi, in quanto permette di stabilire la validità di una
"ipotesi nulla" H0 (es. le grandezze in esame sono uguali) rispetto ad una "ipotesi alternativa" Ha (es. le
grandezze sono differenti). Le conclusioni del test sono valide a livello statistico ed hanno una "certezza"
pari al livello di fiducia stabilito (possono quindi cambiare per un diverso livello di fiducia). Nei test si
assume che i dati seguano un distribuzione Gaussiana (anche questo può essere verificato con strumenti,
quali il test χ2che valuta l'aderenza dei dati ad una data distribuzione statistica). I test di significatività
possono essere a una coda o a due code: per il primo la direzione della differenza è importante, per il
secondo interessa solo l'esistenza di una differenza. I test di significatività vengono usati anche per
dimostrare una differenza fra due dati (es. per confermare l’efficacia di un trattamento farmacologico).
Per indicare la validità delle conclusioni del test si riporta spesso il loro livello di significatività (p),
corrispondente a 100% - LF.

Il test t permette di confrontare un risultato sperimentale (media di N misure) con un valore atteso. Il
valore critico è il parametro t di Student relativo al livello di fiducia stabilito e al numero di gradi di
libertà dell'insieme di dati (N – 1), mentre il parametro sperimentale è:

Il test F permette di confrontare le deviazioni standard (più correttamente, le varianze) di due serie di N 1
ed N2 misure. Il valore critico è il parametro F relativo al livello di fiducia stabilito e ai numeri di gradi di
libertà dei due insiemi di dati (N1 - 1 e N2 - 1), mentre il parametro sperimentale è:
Si assume s1 > s2 (quindi Fsper > 1). Il test verifica, pertanto, se s1 è realmente maggiore di s2 (è quindi un
test a una coda).

Il test di Grubbs (test G) permette di stabilire se un valore anomalo (un outlier) in una serie di N misure
è dovuto ad un errore grossolano. Il valore critico è il parametro G relativo al livello di fiducia stabilito
ed al numero di dati in oggetto, mentre il parametro sperimentale è:

Cifre significative

Poiché un singolo risultato non fornisce informazioni sull’incertezza, un’analisi viene normalmente
effettuata su di una serie di replicati (aliquote di uno stesso campione analizzate esattamente nello stesso
modo. Per definizione, il numero di cifre significative di un numero è il numero minimo di cifre richieste
per rappresentarlo in notazione scientifica senza comprometterne la precisione. L’ultima cifra
significativa di un numero (che può essere anche uno zero) deve allora essere la prima cifra incerta, alla
quale è quindi associato un errore il cui valore minimo è ±1. Tutte le cifre diverse da zero sono
significative, se gli zeri si trovano compresi tra due cifre diverse da zero sono anch’essi significativi.
Anche gli zeri terminali sono significativi.
In una somma o differenza tra dati il risultato deve avere il numero di decimali del dato che ne ha meno.
In una moltiplicazione o divisione tra dati il risultato deve avere un numero di cifre significative uguale
al dato che ne ha meno.

Capitolo 2: Titolazioni volumetriche

La quantità incognita di analita nel campione viene determinata misurando il volume di reagente
(titolante) a concentrazione nota che reagisce in maniera quantitativa con l’analita stesso.

Una reazione può essere utilizzata per eseguire una titolazione se presenta le seguenti caratteristiche:
avere una velocità di reazione elevata; avere una stechiometria di reazione nota (in particolare non si
devono presentare reazioni secondarie); essere quantitativa ossia avere una costante di equilibrio elevata;
avere una proprietà chimica o fisica che varia significativamente al punto di equivalenza.

Le titolazioni più comuni sono basate su: reazioni di precipitazione, reazioni acido-base, formazione di
complessi e reazioni di ossido-riduzione.

Alcune definizioni:
- Soluzione (o titolante) standard: reagente a concentrazione nota usato in un’analisi di titolazione.
- Titolato: volume noto della soluzione in analisi, contenente una quantità incognita di analita da
determinare.
- Standard primario: composto ad alto grado di purezza che serve a preparare soluzioni standard per
titolazioni volumetriche.
- Retro-titolazione o titolazione di ritorno: processo in cui una soluzione standard viene aggiunta in
eccesso alla soluzione di analita, e tale eccesso viene titolato con una seconda soluzione standard.
- Punto di equivalenza (o punto equivalente): è il punto teorico di una titolazione in cui la quantità di
reagente standard aggiunta è esattamente quella richiesta dalla reazione stechiometrica.
- Punto finale: è il punto reale di una titolazione in cui si osserva un cambiamento macroscopico delle
proprietà della soluzione (es. cambiamento di colore), che indica all'operatore che la titolazione è
terminata. Punto finale e punto equivalente spesso non coincidono.
- Errore di titolazione: è la differenza (espressa, a seconda dei casi, in volume, massa o quantità di
carica) tra punto di equivalenza e punto finale.
- Titolazione in bianco: titolazione effettuata in assenza di analita allo scopo di valutare la quantità di
titolante necessaria per visualizzare il punto finale, che andrà poi sottratta al volume utilizzato nella
titolazione vera e propria.

Curve di titolazione

La curva di titolazione riporta la variazione di una determinata proprietà chimico-fisica del sistema in
funzione del volume di titolante aggiunto. Queste curve di titolazione vengono in genere rappresentate
utilizzando una opportuna funzione-p (log della conc. di analita o titolante cambiato di segno).
Ascissa: volume di titolante aggiunto (a volte anche mmol di titolante aggiunto).
Ordinata: quantità di analita o di titolante presente nella soluzione, espressa in funzione p (es. pAg, pM,
pX) o variabile ad esso correlata (es. pH, Esistema).
Le curve di titolazione hanno tipicamente un andamento sigmoidale, nel quale si osserva una brusca
variazione della variabile in ordinata in corrispondenza del punto equivalente.
Titolazione diretta: il titolante viene aggiunto per piccoli volumi alla soluzione di analita fino al punto
finale.
I calcoli nell’analisi volumetrica servono a mettere in relazione le moli di titolante con le moli di analita.
Il primo presupposto è scrivere la reazione bilanciata tra analita e titolante. Al punto di equivalenza le
moli aggiunte di titolante e le moli iniziali di analita (titolato) stanno fra loro come i rispettivi coefficienti
stechiometrici (ν , ni).
Titolazione inversa o retrotitolazione: si aggiunge alla soluzione di analita un eccesso noto di un primo
titolante che reagisce con l’analita, successivamente si titola l’eccesso di titolante rimasto attraverso una
titolazione. Dalla differenza tra la quantità di primo titolante aggiunto e quello rimasto in eccesso non
reagito si determina la quantità di analita presente nel campione. Nei calcoli occorre sempre considerare
la stechiometria delle reazioni.
Le titolazioni volumetriche trovano applicazione nella determinazione di alcuni componenti maggiori o
minori di campioni ambientali, in particolare alcuni parametri di qualità delle acque.

Titolazioni argentometriche
Le titolazioni di precipitazione sono basate sulla formazione di sali insolubili. Le uniche titolazioni di
precipitazione utilizzate in pratica sono le titolazioni argentometriche, con precipitazione di sali di
argento, utilizzando come titolante il nitrato di argento (AgNO3 ). Nel corso della titolazione si osserva
una variazione di [Ag+], particolarmente rapida in prossimità del punto equivalente. Attraverso l’uso di
indicatori chimici o di un elettrodo sensibile ad Ag+, è possibile evidenziare il punto finale.
Il metodo permette di determinare i cloruri in soluzione, a concentrazioni dell’ordine dei mg/L. A causa
delle interferenze, il metodo non è adatto per l’analisi di campioni molto inquinati e con bassi livelli di
cloruri. pH compreso tra 6,5 e 9 (tampone carbonato o borato) A pH maggiore precipita l’idrossido di
argento: Ag(OH) A pH inferiore si protona il cromato.
Si ha un errore sistematico positivo: titolante in eccesso deve essere aggiunto per vedere la colorazione
rossa. L’errore si può valutare con una titolazione in bianco o standardizzando AGNO 3 con NaCl
standard, nelle stesse condizioni:
Alle normali concentrazioni, i comuni costituenti delle acque di profondità, di superficie e potabili non
danno interferenza. Causano interferenza:
- I composti che formano composti insolubili con l’argento: bromuro, ioduro, solfuro, cianuro, fosfato,
esacianoferrato(II) ed esacianoferrato(III);
- I composti che formano complessi con gli ioni argento: ammonio o tiosolfato;
- I composti che riducono lo ione cromato: ad esempio Fe(II), ioni solfiti.
Per campioni molto torbidi o colorati potrebbe essere difficile osservare il punto finale.

Titolazioni complessometriche
Le titolazioni di complessazione sono basate sulla formazione di complessi tra un catione metallico ed un
legante. Le titolazioni complessometriche più utilizzate si basano su agenti chelanti, come l’EDTA. Nel
corso della titolazione si osserva una variazione di [Mn+], particolarmente rapida in prossimità del punto
equivalente. Attraverso l’uso di indicatori chimici o di un elettrodo sensibile al Mn+, è possibile
evidenziare il punto finale. La durezza dipende dalla concentrazione globale di Ca 2+ , Mg2+. È un indice di
quanto l’acqua sia in grado di causare la precipitazione dei tensioattivi e il deposito di calcare. La durezza
conferisce all’acqua la capacità di neutralizzare la deposizione acida e di ridurre la solubilità di metalli
tossici.
L’acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), comunemente rappresentato come H 4Y, è il legante chelante
più utilizzato in chimica analitica. E’ commercialmente disponibile come acido libero (H 4Y) e come sale
disodico (Na2H2Y∙2H2O). Chimicamente l’EDTA è un acido debole esaprotico e può esistere in soluzione
in differenti forme in funzione del pH. L’EDTA forma complessi con stechiometria 1:1 con praticamente
tutti gli ioni metallici, a prescindere dalla loro carica (la carica effettiva del complesso varia quindi in
funzione della carica del catione). La maggior parte dei complessi metallo-EDTA (eccetto quelli con
metalli alcalini) è sufficientemente stabile per essere utilizzata a scopi analitici. L’elevata affinità
dell’EDTA per i cationi metallici lo rende utile in diverse applicazioni. CaNa 2EDTA viene utilizzato nella
terapia chelante contro l’avvelenamento da piombo e altri metalli pesanti. Sali di sodio, potassio o litio
EDTA vengono utilizzati come anticoagulanti nelle provette per la raccolta del sangue (chelando il Ca 2+
inibiscono il processo di coagulazione). EDTA o altri agenti chelanti sono utilizzati come coadiuvanti del
lavaggio per evitare l’interferenza di Ca2+ e Mg2+ sull’azione dei detergenti.
Le reazioni dell’EDTA dipendono fortemente dal pH. Poiché in una titolazione K’MY deve avere un
valore relativamente elevato (>106) per ogni metallo esiste un valore minimo di pH al di sotto del quale la
titolazione non è possibile. Il valore di pH minimo dipende dalla stabilità del complesso: maggiore è
KMY, minore è il pH al quale K’MY >106.

Indicatori metallocromici

Un indicatore metallocromico è un composto il cui colore varia quando si lega ad uno ione metallico. Gli
indicatori metallocromici si legano al metallo più debolmente dell’EDTA e i loro complessi sono labili,
ovvero si decompongono velocemente. Un tipico indicatore metallocromico è il Nero Eriocromo T
(NET). Fino al punto equivalente l’indicatore complessa l’eccesso di metallo, colorando la soluzione di
rosso. Dopo il punto equivalente l’indicatore viene completamente spostato dall’EDTA, per cui prevale la
forma libera blu.

Determinazione della durezza dell’acqua

La durezza viene usualmente determinata mediante titolazione complessometrica con EDTA a pH = 10,
utilizzando come indicatore un indicatore metallocromico per lo ione magnesio (es. NET). Infatti, fra i
più comuni cationi presenti nell’acqua, il magnesio è quello che forma i complessi con EDTA meno
stabili, e quindi viene titolato per ultimo: la sua complessazione da parte dell’EDTA, ed il conseguente
viraggio dell’indicatore, indica la titolazione di tutti i cationi multivalenti presenti nel campione (spesso
l’indicatore contiene una piccola quantità di complesso magnesio-EDTA, in modo da assicurare la
presenza di una sufficiente quantità di magnesio per ottenere un viraggio soddisfacente). È possibile
discriminare la durezza calcica dalla durezza magnesiaca precipitando il magnesio a pH > 12 e
procedendo alla normale titolazione con EDTA usando come indicatore la muresside. Sottraendo la
durezza calcica dalla durezza totale, si calcola la durezza magnesiaca. La durezza viene usualmente
espressa come contenuto equivalente di CaCO3.

Titolazioni acido base

Le titolazioni di neutralizzazione sono basate sulla reazione tra un acido ed una base, con formazione di
un sale ed acqua. Nel corso della titolazione si osserva una variazione di pH, particolarmente rapida in
prossimità del punto equivalente. Attraverso l’uso di indicatori chimici o di un elettrodo sensibile al pH, è
possibile evidenziare il punto finale. Le variazioni di pH nel corso delle titolazioni acido-base vengono
comunemente seguite secondo due modalità:
- Misurando continuamente la variazione di pH mediante un metodo potenziometrico basato sull’uso di
un elettrodo a vetro. Questo metodo consente di visualizzare la curva di titolazione ed è quindi
utilizzato, fra le altre cose, per selezionare l’indicatore più adatto per una titolazione
- Utilizzando un indicatore acido-base chimico, in questo modo è possibile osservare soltanto la
variazione di pH nell’intorno di un ben preciso intervallo. La scelta corretta dell’indicatore è
fondamentale per l’accuratezza dell’analisi.
Un indicatore acido-base è anch’esso un acido o una base debole, in cui le diverse forme protonate
hanno colori diversi. Ad esempio, la fenolftaleina esiste in due forme a diverso grado di protonazione:

Titolatori automatici
Titolazioni acido base (pt.2)

Le titolazioni di neutralizzazione sono basate sulla reazione tra un acido ed una base, con formazione di
un sale ed acqua. Nel corso della titolazione si osserva una variazione di pH, particolarmente rapida in
prossimità del punto equivalente. Attraverso l’uso di indicatori chimici o di un elettrodo sensibile al pH, è
possibile evidenziare il punto finale.

Determinazione dell’alcalinità dell’acqua

L'effetto serra, indotto dall'anidride carbonica di origine antropica, CO 2 , nell'atmosfera è un grave

problema ambientale globale. Un fattore chiave che controlla la concentrazione di CO2 atmosferica è il
suo assorbimento nell'oceano. La solubilità della CO2 nell’acqua oceanica è correlata a molti fattori come
la temperatura dell'acqua, la salinità, l'ossigeno disciolto e gli elementi nutritivi. Il sistema di carbonato
oceanico può essere rappresentato misurando almeno due parametri su quattro: carbonio inorganico
totale; alcalinità totale; fugacità della CO2 ; e pH dell'acqua di mare. L’alcalinità dell’acqua dipende dal
contatto dell’acqua con rocce e suolo, l’attività di alcune piante ed alcuni scarichi industriali o di acque
reflue. Viene misurata in quanto è un indice della capacità tamponante dell’acqua, cioè quanto sarà in
grado di contrastare l’abbassamento del pH in seguito all’aggiunta di inquinanti acidi (pioggia acida o
acque reflue). Per alcalinità di un campione di acqua naturale si intende la sua capacità di reagire con ioni
idrogeno, cioè di neutralizzare gli acidi. L’alcalinità totale è approssimativamente uguale alle moli di HCl
necessarie per portare 1 kg di acqua a pH 4,5 (indicatore metilarancio o verde bromocresolo). Il titolante
è una soluzione standardizzata di HCl 0,1 M (se si titola acqua di mare, al titolante si aggiunge anche
NaCl 0,6M) o di H2SO4 .
Con buona approssimazione: Alcalinità ≈ [OH- ] + 2[CO3 2- ] + [HCO3 - ]
Possono contribuire in minima parte anche altre basi, quali fosfati, silicati, ammoniaca, solfuri, fluoruri,
borati, composti organici (acido umico, acido acetico, acido propionico).
Il risultato si esprime in ppm (mg/L) di CaCO3.
Se la titolazione viene eseguita utilizzando l’indicatore fenolftaleina (pH di viraggio 8,3), si determina
l’alcalinità alla fenolftaleina, che esclude il contributo del carbonato acido.
L’alcalinità alla fenolftaleina e l’alcalinità totale possono essere determinate usando due indicatori in
sequenza. Tuttavia, la procedura di riferimento, che garantisce risultati più accurati, prevede la
costruzione della curva di titolazione completa mediante misura potenziometrica del pH.

Determinazione dell’azoto organico totale

L’azoto è un nutriente essenziale per tutti gli esseri viventi. Nel suolo, la maggior parte dell’azoto è
presente come azoto organico.
Metodo di Kjeldahl:
1. Digestione: il campione viene portato ad alta temperatura in presenza di H2SO4 concentrato +
catalizzatore (es. Cu2SO4 ) + ossidanti (es. MnO4- o H2O2 ); tutto l’N organico viene convertito in
NH4+.
2. Distillazione: la soluzione viene resa basica con NaOH, in modo da convertire NH4+ in NH3 , che
viene distillata e raccolta in un pallone contenente un eccesso noto di HCl NH 3 + HCl → NH4+ + Cl-
+ HCl Eccesso Residuo.
3. Retrotitolazione: l’eccesso di HCl viene titolato con NaOH.

Titolazioni redox

Le titolazioni redox sono basate su reazioni di ossidoriduzione. Nel corso della titolazione si osserva una
variazione del potenziale di sistema, particolarmente rapida in prossimità del punto equivalente.
Attraverso l’uso di indicatori chimici o di un elettrodo metallico, è possibile evidenziare il punto finale.
Indicatori visuali di ossidoriduzione: ferroina.

Ossigeno disciolto

Tutte le forme di vita aerobiche hanno bisogno di ossigeno per la respirazione cellulare. L’acqua a
temperatura moderata dovrebbe avere ossigeno disciolto (DO) ad una concentrazione almeno di 5 mg/L
(5ppm) per sostenere la vita. La concentrazione di DO è funzione della temperatura, pressione, salinità ed
attività biologica nel corpo acquatico. La solubilità dell’ossigeno in acqua dolce al livello del mare e a
25°C è 8.3 mg/L, mentre è 6.7 mg/L nell’acqua salata alle stesse condizioni.
La concentrazione dell’ossigeno disciolto nell’acqua dipende dal bilancio fra i processi che immettono
ossigeno nell’acqua e quelli che lo consumano. Siccome la solubilità dell’ossigeno nell’acqua è bassa
(pochi mg/L) e la diffusione dall’atmosfera relativamente lenta, un elevato consumo di ossigeno può
ridurre in modo significativo la sua concentrazione. L’assenza di ossigeno è letale per la vita animale e
causa la decomposizione anaerobica del materiale organico con produzione di NH 3 , H2S e CH4.
Titolazione iodometrica (metodo di Winkler)
Questo metodo permette di effettuare la determinazione dell'ossigeno disciolto in laboratorio
(ovviamente, è fondamentale che dopo il prelievo che il campione non assorba ossigeno dall'atmosfera).
Al momento del prelievo, l’ossigeno presente nel campione d’acqua viene fissato sotto forma di MnO 2

4𝑀𝑛2+ + 𝑂2 + 8𝑂𝐻− + 2𝐻2𝑂 → 4𝑀𝑛(𝑂𝐻)3

aggiungendo una soluzione alcalina contenente un eccesso di Mn(II) e di ione ioduro.

Una mole di O2 richiede 4 moli di Mn2+ per precipitare La soluzione può contenere anche sodio azide

2𝑁𝑂2− + 6𝑁3− + 4𝐻2𝑂 → 10𝑁2 + 8𝑂𝐻−

(azoturo di sodio, NaN3 ) per eliminare l’interferenza dei nitriti (NO2- ):

In laboratorio, il campione viene acidificato (con acido solforico o fosforico) iodio dalla reazione dello
ione ioduro con MnO2 si produce
2Mn(OH)3+ 6H+ + 2I− → 2Mn2+ + I2 + 6H2O
Lo iodio prodotto viene determinato mediante titolazione volumetrica con tiosolfato.
L’amilosio, un polimero dell’α-D-glucosio, interagisce con le molecole di iodio. Lo iodio molecolare
forma delle catene lineari di I6, che si inseriscono nella spirale polimerica elicoidale dell’amilosio. Il
complesso ha colore blu. Il legame è irreversibile in presenza di concentrazione elevata di iodio. La
soluzione di salda d’amido deve essere preparata di fresco, in quanto il glucosio, prodotto dell’idrolisi
dell’amilosio, è un agente riducente.
L’introduzione di inquinanti organici può far cadere rapidamente la concentrazione di DO nelle acque al
di sotto del livello critico. Gli inquinanti organici costituiscono un nutrimento per i microrganismi, che
crescono rapidamente consumando ossigeno.
I composti del carbonio sono convertiti in CO2 dalla respirazione dei microrganismi. C + O2 → CO2
Secondo la stechiometria di questa reazione, sono necessari 32 g di ossigeno per ossidare 12 g di
carbonio; quindi, 8 mg/L di ossigeno sono necessari per ossidare 3 mg/L di carbonio disciolto. Una
piccolo goccia di olio può consumare tutto l’ossigeno contenuto in 5 L di acqua. Se l’ossigeno viene
consumato, microrganismi e pesci muoiono e si instaura una decomposizione anaerobica, con produzione
di ammoniaca, solfuri, metano.

Determinazione della domanda chimica di ossigeno

La domanda chimica di ossigeno (Chemical Oxygen Demand, COD) indica la quantità complessiva di
sostanze ossidabili contenute nel campione attraverso la reazione con un eccesso di agente ossidante. Dal
consumo di agente ossidante si risale alla quantità di ossigeno teoricamente necessaria (alcune sostanze
presenti poterebbero in effetti non reagire con l’ossigeno) per effettuare lo stesso processo di ossidazione.
Ossidazione con bicromato di potassio. Il campione di acqua da analizzare viene riscaldato a riflusso
per 2 ore con un eccesso di bicromato di potassio in ambiente fortemente acido per H 2SO4. Le sostanze
organiche vengono ossidate dal bicromato secondo la reazione
Cr2O72− +14H+ + 6e − → 2Cr 3+ + 7H2O
Al termine della reazione l’eccesso di bicromato viene determinato per titolazione con Fe 2+. Nel caso il
numero di analisi da effettuare sia elevato, l'eccesso di bicromato può essere determinato anche in modo
automatico mediante tecniche spettrofotometriche.
6Fe 2+ + Cr2O72− +14H+ → 6Fe 3+ + 2Cr 3+ + 7H2O

Determinazione della domanda biochimica di ossigeno

Il test del BOD viene effettuato diluendo un campione dell'acqua da analizzare con acqua deionizzata
satura di O2, inoculando in esso una quantità fissata di microrganismi, sigillando il campione (per
impedire che altro O2 passi in soluzione) e quindi conservandolo al buio (per impedire che si sviluppino
processi fotosintetici che generino O2). Il campione è mantenuto al buio alla temperatura di 20 °C per
tutta la durata del test (solitamente 5 giorni) e al termine di questo periodo viene analizzato l'O 2 disciolto
residuo.

Capitolo 3: Analisi Strumentale, Calibrazione e Validazione

La maggior parte delle analisi chimiche viene effettuata mediante tecniche strumentali: spettrofotometria,
cromatografia, spettrofluorimetria, potenziometria, spettrometria di massa e spettroscopia atomica.
Le tecniche analitiche strumentali vengono usate in chimica analitica per quattro motivi:
- Bassi limiti di rivelabilità: molti analiti sono presenti in basse concentrazioni;
- Elevata selettività: spesso i campioni da analizzare hanno matrici complesse (es. campioni di origine
ambientale o biologica).
- Elevata produttività analitica: può essere necessario analizzare elevati numeri di campioni (es. in
analisi di screening).
- Errori ridotti: i risultati dell’analisi devono essere affidabili.
Le tecniche di analisi strumentali prevedono la misura di un segnale, il cui valore è idealmente legato
solo alla quantità di analita presente. La natura del segnale dipende dalla tecnica di analisi impiegata.
La conoscenza della relazione fra segnale e quantità di analita è fondamentale in una analisi quantitativa.
La curva di calibrazione (o curva di taratura) permette di ricavare sperimentalmente la dipendenza del
segnale dalla concentrazione di analita. Viene ottenuta analizzando standard a concentrazione nota di
analita. L’analita negli standard deve fornire la stessa risposta di quello nei campioni da analizzare;
quindi, deve essere nella stessa forma (es. per i metalli potrebbe essere importante lo stato di
ossidazione). L’analisi di bianchi privi di analita permette di evidenziare eventuali contributi al segnale
dovuti ad altri fattori (es. impurezze nei reagenti). La sottrazione del segnale del bianco dai segnali
misurati fornisce i segnali corretti, che dipendono solo dall'analita. I bianchi dovrebbero riprodurre
esattamente le condizioni dell'analisi, pertanto dovrebbero avere la stessa composizione dei campioni
(ma non contenere l'analita). Se bianchi con queste caratteristiche non sono disponibili si può usare un
bianco del solvente o un bianco dei reagenti (questi bianchi sono sempre adatti per gli standard, che
hanno composizione molto semplice).

Tipi di curva di calibrazione

La forma della curva di calibrazione dipende da fattori quali la tecnica di misura (es. segnale dipendente
in modo lineare o no dalla quantità di analita) ed il principio dell’analisi (es. misura dell'analita diretta o
indiretta mediante un processo di competizione).
La più semplice curva di calibrazione è la curva di calibrazione lineare, dove il segnale è proporzionale
alla concentrazione di analita. Le curve di calibrazione lineari sono preferite in quanto facili da gestire:
dipendono da due parametri; quindi, possono essere ottenute anche con due soli standard e possono
essere invertite facilmente per ottenere C a partire da S (es. nell'analisi di campioni incogniti).
Nelle analisi spettrofotometriche l'assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione di
analita.
Nella spettroscopia di assorbimento atomico le deviazioni dalla linearità rendono conveniente l'uso di
una equazione quadratica:
Nelle misure potenziometriche il segnale è proporzionale al logaritmo della concentrazione di analita
(legge di Nernst):
Per sfruttare i vantaggi delle equazioni lineari, alcune curve di calibrazione non lineari possono essere
linearizzate con opportune trasformazioni matematiche. Se le trasformazioni impiegate interessano la
concentrazione, le concentrazioni ricavate utilizzando le curve linearizzate non saranno quelle reali ma i
loro valori trasformati. Se possibile è preferibile operare sulle curve originali. L’analisi di una curva
linearizzata è più facile ma non sempre fornisce le migliori stime dei parametri della curva originale.

Analisi di regressione

Per ricavare una curva di calibrazione dalle misure sperimentali bisogna determinare i coefficienti della
equazione che lega segnale e concentrazione. Questa operazione è però ostacolata dall’errore casuale
presente in ogni misura. Un’analisi di regressione permette, nota l’equazione generale di una curva di
calibrazione (modello di regressione), di trovare i coefficienti della particolare curva che meglio si adatta
ai dati sperimentali. L'analisi di regressione si basa su un approccio statistico, pertanto la curva ottenuta è
quella che ha la maggiore probabilità di rappresentare la reale relazione fra segnale e concentrazione.
Parametri che si ottengono dalla regressione lineare:
- Pendenza dei parametri a e b: definiscono la posizione della retta di calibrazione.
- Errore (come deviazione standard) su pendenza (sa) e intercetta (sb): descrivono l'incertezza sulla
posizione della retta di calibrazione. L’incertezza può essere visualizzata graficamente mediante le
bande di fiducia. La banda di fiducia è l’equivalente bidimensionale dell’intervallo di fiducia di una
 misura. Minori sono gli errori sui coefficienti della curva e minore è il livello di fiducia, minore è
l'ampiezza della banda di fiducia.
- Coefficiente di determinazione (R2): descrive l’aderenza dei dati sperimentali alla retta di
calibrazione (maggiore è il valore di R2, migliore è la correlazione fra segnale e concentrazione). Il
valore di R2 è compreso fra 0 ed 1. Non esiste un valore minimo accettabile di R 2 (misure con errori
elevati daranno in genere bassi valori di R2). Per le normali analisi chimiche valori inferiori a 0,95 -
0,90 sono comunque raramente accettati.

Caratteristiche di un metodo analitico

Limite di rivelabilità (LOD) minima concentrazione rivelabile di analita, ovvero in grado di dare un
segnale distinguibile da quello del bianco.
A questi livelli di concentrazione non sono possibili misure affidabili; quindi, per concentrazioni pari al
LOD è solo possibile confermare la presenza dell'analita. In termini statistici, il LOD è la concentrazione
di analita che produce un segnale significativamente maggiore di quello del bianco ad un determinato
livello di fiducia. Per curve di calibrazione lineari, la concentrazione corrispondente al LOD è calcolabile
dalla pendenza della retta di calibrazione:

Limite di quantificazione (LOQ) minima concentrazione quantificabile di analita, ovvero in grado di

essere determinata con precisione ed accuratezza accettabili. Il LOQ è il più basso valore di
concentrazione utilizzabile in uno standard per la costruzione della curva di calibrazione. Il LOQ può
essere definito in modo simile al LOD ma usando coefficienti più elevati. Per curve di calibrazione
lineari:

Nelle tecniche che prevedono la misura del segnale in funzione del tempo (es. tecniche cromatografiche)
un segnale viene considerato significativo se è distinguibile dalle fluttuazioni casuali del segnale di
fondo. Per queste misure si parla anche di rapporto segnale/rumore (S/N), definito come il rapporto fra il
segnale dell'analita ed il "rumore" (la fluttuazione media del segnale di fondo). Un segnale viene
considerato significativo se ha S/N pari almeno a 2 o 3.

Intervallo di linearità: intervallo di concentrazioni dove esiste una relazione lineare fra segnale e
concentrazione. La validità della relazione lineare può essere giudicata dai parametri della retta ottenuta
dalla analisi di regressione, es. intercetta e R2. I valori minimi da raggiugere dipendono dall'importanza
dell’analita. Per un componente principale la linearità potrebbe essere considerata soddisfacente per R 2 >
0,995 e se l'intercetta è inferiore al 2% del segnale alla massima concentrazione di analita. Per una
impurezza potrebbero invece bastare R2 > 0,98 e una intercetta inferiore al 10% del segnale massimo.

Intervallo dinamico: intervallo di concentrazioni entro il quale è possibile determinare la concentrazione

di analita (è una generalizzazione dell'intervallo di linearità nel caso di metodi con curve di calibrazione
non lineari). I limiti degli intervalli dinamici vengono spesso indicati come limite superiore di
quantificazione (ULOQ) e limite inferiore di quantificazione (LLOQ). L'ampiezza dell'intervallo
dinamico dipende dalla tecnica analitica e può variare da 1 - 2 a 5 - 6 ordini di grandezza. Intervalli
ristretti sono comunque accettabili se i campioni da analizzare sono compresi in un piccolo intervallo di
concentrazioni.

Preparazione degli standard

Gli standard (tipicamente 5 - 10) sono scelti in base all’intervallo di lavoro del metodo e ai campioni da
analizzare (devono essere compresi nell’intervallo di concentrazione degli standard). Standard con
distribuzione lineare si possono preparare mediante diluizioni parallele di una soluzione madre
concentrata di analita. Le variazioni di volume (es. dovute ad aggiunte di reagenti o diluizioni) vanno
considerate nel calcolo delle concentrazioni finali.

Metodi di Calibrazione

Le più comuni procedure di calibrazione sono: calibrazione esterna, calibrazione con aggiunta standard,
calibrazione interna. I metodi di calibrazione possono essere usati per qualsiasi curva di calibrazione.

Calibrazione esterna

Calibrazione esterna (o calibrazione con standard esterno): la curva di calibrazione viene ottenuta
analizzando standard preparati indipendentemente dai campioni. La concentrazione dei campioni
incogniti viene determinata mediante interpolazione dei loro segnali sulla curva di calibrazione. È il
principale metodo di calibrazione usato in analisi quantitativa: è semplice, rapido e di uso generale.
- Semplice: bianco, standard e campioni sono trattati nello stesso modo (il metodo è quindi facilmente
automatizzabile).
- Rapido: una curva di calibrazione permette di analizzare un numero elevato di campioni.
- Uso generale: può essere utilizzato per ogni tipo di curva di calibrazione.
Procedura per la calibrazione esterna
Misura dei segnali del bianco (Sb), degli standard (S1, S2…) e del campione (S). Sottrazione del segnale
del bianco ai segnali di standard e campione per ottenere i segnali corretti (S 1’, S2’ … S’). Costruzione
della curva di calibrazione usando i segnali corretti degli standard e le loro concentrazioni di analita.
Calcolo della concentrazione del campione dalla interpolazione del suo segnale corretto sulla retta di
calibrazione effettuata graficamente oppure usando l’equazione della retta:

L'errore sul risultato di un'analisi deriva sia dall'errore sulla misura vera e propria che da quello legato
alla incertezza sulla posizione della retta di calibrazione.
La limitazione principale della calibrazione esterna è l’impossibilità di essere usata in presenza di effetto
matrice (rappresentata da tutti i componenti del campione escluso l'analita). Con questo termine si indica
l’effetto della matrice del campione sul segnale dell'analita. In presenza di effetto matrice, standard e
campioni a uguale concentrazione producono differenti segnali falsando i risultati ottenuti con una
calibrazione esterna. Tutti i metodi di calibrazione assumono che una data concentrazione di analita
produca sempre lo stesso segnale.

Calibrazione con aggiunta standard

La curva di calibrazione viene ottenuta aggiungendo al campione incognito concentrazioni note di analita
e riportando il segnale in funzione dell’aggiunta effettuata. La concentrazione del campione viene
determinata individuando l’origine della curva di calibrazione mediante estrapolazione. Questo metodo
permette di compensare l'effetto matrice poiché il segnale dell'analita aggiunto viene misurato nella
matrice del campione. Per utilizzare questo metodo devono essere soddisfatte alcune condizioni:
- L’analita aggiunto e quello già presente nel campione devono avere le stesse caratteristiche in modo
da subire le stesse interferenze.
- Il segnale aspecifico deve essere eliminato mediante un bianco.
- L’applicazione del metodo è più semplice quando esiste una relazione lineare fra segnale e
concentrazione.
L’uso della calibrazione con aggiunta standard è limitato alle situazioni in cui è presente un effetto
matrice. Questo tipo di calibrazione richiede infatti molto tempo e comporta un elevato consumo di
reagenti (deve essere costruita una curva di calibrazione per ogni campione).
Il metodo delle aggiunte sequenziali è particolarmente adatto alla calibrazione con aggiunta standard
(riduce la quantità di campione richiesta perché tutta l’analisi viene effettuata su una singola aliquota).

Procedura per calibrazione con aggiunta standard

Misura dei segnali del bianco (Sb), del campione non addizionato di analita (S0) e dei campioni
addizionati di analita (S1, S2 …). Sottrazione del segnale del bianco ai segnali del campione non
addizionato di analita e dei campioni addizionati di analita per ottenere i segnali corretti (S 0’, S1’, S2’…).
Costruzione della curva di calibrazione usando i segnali corretti del campione non addizionato di analita
e dei campioni addizionati di analita e le concentrazioni aggiunte di analita. Calcolo della concentrazione
del campione dalla estrapolazione della retta di calibrazione effettuata graficamente oppure usando
l’equazione della retta:

Calibrazione interna
Prevede l’impiego di uno standard interno (una seconda specie determinabile separatamente
dall’analita) aggiunto in quantità fissa a standard e campioni incogniti.
La curva di calibrazione riporta i rapporti fra i segnali dell’analita e dello standard interno in funzione
della concentrazione di analita e le concentrazioni dei campioni incogniti vengono determinate mediante
interpolazione dei loro rapporti fra i segnali sulla curva di calibrazione.
Permette di correggere alcuni tipi di errori che possono presentarsi durante l'analisi:
- Recupero non completo: durante le procedure di trattamento del campione prima dell'analisi (es.
dissoluzione, estrazione, purificazione) si verificano spesso perdite di analita.
- Fluttuazioni nella risposta strumentale.
- Quantità di campione non riproducibile.
Lo standard interno dovrebbe avere caratteristiche chimico-fisiche simili a quelle dell’analita (deve avere
lo stesso comportamento durante l’analisi). Deve inoltre essere aggiunto prima possibile durante la
procedura di analisi. Possono essere corretti solo gli errori che si verificano dopo l'aggiunta dello
standard interno. Molecole marcate con isotopi stabili rari o radioattivi (es. 13C, 14C, 2H o 3H per molecole
organiche) sono standard interni ideali (hanno le stesse caratteristiche chimico-fisiche dell’analita ma
possono essere misurate separatamente mediante spettrometria di massa o tecniche radiochimiche).

Procedura per calibrazione interna

Misura dei segnali di analita e SI del bianco (Sb , Sb(SI)), degli standard (S1, S1(SI) …) e del campione (S,
S(SI)). Sottrazione dei segnali del bianco ai segnali di analita e SI di standard e campione per ottenere i
segnali corretti (S1’, S1(SI)’ … S’, S(SI)'). Costruzione della curva di calibrazione usando i rapporti fra i
segnali corretti di analita e SI degli standard e le concentrazioni di analita. Calcolo della concentrazione
del campione dalla interpolazione del rapporto fra i suoi segnali corretti di analita e SI sulla retta di
calibrazione effettuata graficamente oppure usando l’equazione della retta:
Standard e campione contengono la stessa concentrazione di SI, quindi i segnali S SI dovrebbero essere
simili. La curva di calibrazione permette di verificare la proporzionalità fra il rapporto fra i segnali e la
concentrazione di analita nell’intervallo di lavoro.

Validazione
La validazione di un metodo analitico permette di stabilire le sue prestazioni riferite all'analisi di un
determinato tipo di campione. La conoscenza delle prestazioni di un metodo è indispensabile per
confrontare metodi diversi o valutare se un metodo è adatto per una certa applicazione. Alcuni parametri
utilizzati per descrivere le prestazioni di un metodo analitico sono:
- Accuratezza e precisione: affidabilità del risultato.
- Intervallo di linearità ed intervallo dinamico: intervallo di concentrazioni di analita misurabili.
- Robustezza: possibilità di ottenere risultati corretti anche se variano le condizioni sperimentali.
- Limite di rivelabilità (LOD) e limite di quantificazione (LOQ): minima concentrazione di analita
rivelabile o misurabile.
- Selettività: capacità di determinare correttamente l’analita anche in presenza di altre sostanze.

Le procedure per la validazione di un metodo analitico sono indicate nelle linee guida emesse da varie
istituzioni (es. IUPAC). Per riprodurre tutte le fasi dell'analisi incluso il trattamento del campione la
validazione andrebbe effettuata su campioni a concentrazione nota simili ai campioni reali (es. su
materiali standard di riferimento). Se questi non sono disponibili, la validazione può essere effettuata
(anche se con alcune limitazioni) anche in altri modi (es. analisi di campioni fortificati). Questi approcci
sono descritti nelle procedure per la valutazione dell'errore sistematico. Le procedure di controllo interno
di qualità (o controllo di qualità intralaboratorio) garantiscono nel tempo l'affidabilità delle analisi. Il
controllo di qualità è definito come “…lo studio degli errori che rientrano nella responsabilità del
laboratorio (cioè fra il ricevimento del campione e l’invio del risultato) e delle procedure necessarie per
riconoscerli e minimizzarli.” Le linee guida per l'impostazione delle procedure di controllo di qualità
sono stabilite da normative internazionali, in particolare le norme UNI EN ISO 9001:2015. Esistono
anche procedure di controllo esterno di qualità (o controllo di qualità interlaboratorio) che coinvolgono
più laboratori e che hanno finalità più generali (es. valutazione della qualità dei laboratori o
comparazione di differenti metodi di analisi).

Controllo di qualità

Le procedure di controllo di qualità impiegano carte di controllo per confrontare i risultati dei campioni
di controllo con i valori attesi. I valori usati per costruire le carte di controllo (una per ogni campione di
controllo) si ottengono analizzando 20 - 30 replicati in giorni consecutivi e in condizioni di provata
affidabilità del metodo (si ottiene così la distribuzione statistica dei risultati in condizioni ottimali). Se i
campioni di controllo sono analizzati in replicato, si considerano le deviazioni standard delle medie dei
replicati:
La carta di controllo evidenzia alterazioni della precisione e della accuratezza dell’analisi attraverso le
variazioni nella distribuzione dei risultati dei campioni di controllo. I risultati delle analisi periodiche dei
campioni di controllo vengono riportati sulla carta. Se l’analisi procede correttamente i valori ottenuti
rientrano entro i limiti di allarme (il metodo è sotto controllo). Un metodo analitico sotto controllo non
presenta errori sistematici significativi ed ha un errore casuale paragonabile a quello ottenuto durante la
costruzione della carta di controllo. Altri andamenti suggeriscono variazioni della distribuzione dei
risultati dei campioni di controllo rispetto a quella originale. In tal caso il metodo analitico è detto fuori
controllo ed è necessario interrompere le analisi per identificare la causa di queste variazioni. Gli
andamenti osservati permettono anche di fare ipotesi sulla natura del problema, facilitando la sua
individuazione.
- Un valore all’esterno dei limiti di intervento errore dell’operatore
- Valori consecutivi inferiori (o superiori) alla media: errata preparazione di reagenti o soluzioni
standard, contaminazione dei reagenti, errori nella calibrazione dello strumento.
- Valori consecutivi crescenti: evaporazione delle soluzioni standard, alterazione progressiva di
reagenti o standard, alterazione progressiva delle prestazioni dello strumento.
- Valori consecutivi decrescenti: alterazione progressiva di reagenti o standard, alterazione progressiva
delle prestazioni dello strumento.

Capitolo 4: Tecniche di Analisi Spettroscopiche

Nella spettrofotometria si ha una dipendenza lineare fra assorbanza e concentrazione (legge di Lambert-
Beer). Le tecniche spettrofotometriche sono le più comuni tecniche analitiche strumentali impiegate in
laboratorio. La spettroscopia atomica è la tecnica analitica di riferimento per la determinazione dei
metalli. Fluorescenza e chemiluminescenza sono due comuni processi di emissione.
la radiazione elettromagnetica è una forma di energia che si propaga attraverso lo spazio o un mezzo
trasparente alla radiazione. Può essere indifferentemente descritta come un'onda o come una particella.
Nel modello ondulatorio campi elettrici e magnetici oscillanti che si propagano alla velocità della luce
(c). La radiazione è descritta da parametri quali la lunghezza d’onda e la frequenza. Questo modello è
in grado di spiegare fenomeni quali riflessione, rifrazione, interferenza, diffrazione. Nel modello
corpuscolare particelle discrete (fotoni) che si muovono alla velocità della luce. Ogni fotone possiede
una energia (E) data da: E=hv.
Questo modello spiega i fenomeni di assorbimento ed emissione di radiazione da parte della materia.
Per una radiazione energia e frequenza sono fisse mentre la lunghezza d'onda varia con l'indice di
rifrazione del mezzo. La radiazione elettromagnetica copre un intervallo virtualmente illimitato di energie
(spettro elettromagnetico), convenzionalmente suddiviso in base ai processi che si verificano quando la
radiazione interagisce con la materia.
Le radiazioni nel campo dell'ultravioletto (λ = 200 – 400 nm) e del visibile (λ = 400 – 800 nm) sono le
più usate in analisi quantitativa, mentre altre zone dello spettro sono più spesso impiegate per analisi
qualitative.
Assorbimento di radiazione

L'assorbimento di una radiazione elettromagnetica da parte di un atomo o una molecola causa il

passaggio dallo stato fondamentale (lo stato a minima energia nel quale la specie si trova normalmente)
ad uno stato eccitato. L'energia della radiazione è pari alla differenza di energia fra gli stati coinvolti;
quindi, l'assorbimento avviene solo a determinate lunghezze d'onda, caratteristiche della specie in esame.
Esistono anche tecniche analitiche basate su altri processi (es. rifrazione). Queste tecniche sono spesso
poco sensibili e poco selettive (es. la rifrazione dipende dalla densità di una soluzione), quindi adatte solo
per campioni con composizione semplice e relativamente concentrati. Vengono assorbite soltanto le
radiazioni con energia pari alla differenza di energia fra lo stato fondamentale e lo stato eccitato prodotto.
La capacità di una specie di assorbire radiazioni di diverse lunghezze d’onda è descritta dallo spettro di
assorbimento. La sua conoscenza è fondamentale per individuare le condizioni ottimali per qualsiasi
analisi spettroscopica. L'intensità dell'assorbimento dipende anche dalla concentrazione della specie in
esame (nel caso di soluzioni) e da altre variabili (es. solvente, lunghezza d'onda, cammino ottico).
Se l'assorbimento si verifica nel visibile una sostanza è colorata e la zona spettrale dove si verifica
l'assorbimento può essere approssimativamente dedotta dal suo colore (vengono assorbite
prevalentemente le radiazioni con un colore complementare a quello osservato).
Le caratteristiche di uno spettro di assorbimento dipendono dagli stati energetici della specie in esame.
Gli atomi hanno un numero limitato di stati energetici (l'unica forma di energia è quella elettronica) e
danno spettri di assorbimento a righe. Le righe di assorbimento degli spettri atomici sono molto strette
(0,01 nm o meno), il che crea problemi nelle tecniche quantitative basate su misure di assorbimento. La
complessità dello spettro dipende anche dall'elemento in esame (es. i metalli alcalini hanno spettri di
assorbimento semplici, ma gli elementi di transizione hanno spettri a righe molto complessi).
Le molecole hanno una struttura degli stati energetici più complessa poiché l'energia deriva da
componenti diverse (elettronica, vibrazionale e rotazionale). Gli spettri di assorbimento molecolari sono
spettri a bande estesi su ampi intervalli di lunghezze d'onda. L'energia di uno stato è comunque dovuta in
prevalenza alla componente elettronica (l'importanza dei contributi all'energia complessiva è E elettr. > Evibr.
>> Erot.). Ogni banda di assorbimento è la somma di molte transizioni singole, ognuna con diverse
variazioni simultanee di energia elettronica, vibrazionale e rotazionale.
Le singole transizioni in uno spettro di assorbimento molecolare non sono in genere osservabili tranne
che in condizioni particolari (es. in solventi che interagiscono poco con la molecola o meglio ancora in
fase gassosa). L'assenza di caratteristiche distintive negli spettri UV-Vis in soluzione è una delle ragioni
per le quali questa tecnica spettroscopica viene usata in prevalenza per analisi quantitativa.
I composti organici di maggior interesse sono quelli con legami insaturi e sistemi aromatici. Le
transizioni π → π* nei gruppi insaturi producono bande di assorbimento nell'UV-Vis, spesso con intensità
molto elevate. Anche le molecole organiche sature assorbono, ma le loro transizioni (σ→ σ*)causano
assorbimenti sotto 180 nm, difficilmente osservabili perché in questa zona spettrale assorbono anche i gas
atmosferici.

Spettroscopia molecolare in assorbimento

La quantità di radiazione assorbita da un campione (es. una soluzione) viene descritta mediante
trasmittanza e assorbanza. La trasmittanza (T) è la frazione di luce incidente che attraversa il campione:
Poiché 0 ≤ P ≤ P0 la trasmittanza è compresa fra 0 ed 1. Talvolta viene usata la trasmittanza percentuale
(T% = T × 100%). La trasmittanza non è correlata linearmente con la concentrazione di analita; quindi,
questa grandezza non viene usata nelle analisi quantitative.
L'assorbanza (A) è definita a partire dalla trasmittanza secondo la relazione seguente:
è compresa fra 0 e ∞. La relazione fra trasmittanza e concentrazione di analita è lineare; pertanto,
l'assorbanza viene preferita nelle analisi quantitative.

Per una misura spettrofotometrica corretta è fondamentale l'uso di un bianco. In una cella per misure
spettrofotometriche si verifica sempre (anche in assenza di assorbimento) una riduzione della intensità
della radiazione trasmessa; pertanto, l'assorbanza deve essere misurata usando il bianco (es. una cella
contenente il solvente) come riferimento. Questo fenomeno è dovuto prevalentemente a riflessioni alle
interfasi fra aria, cella e soluzione. Se trascurato può portare a errori significativi (la riduzione
dell'intensità della radiazione che attraversa una cella è tipicamente del 5 – 10%). In una misura
spettrofotometrica l'assorbanza viene misurata utilizzando questa relazione:
Assorbanza e concentrazione sono legate dalla legge di Lambert-Beer, che contiene anche il cammino
ottico (lo spessore della soluzione attraversata dal fascio di radiazione).
Questa notazione si usa se la concentrazione è in mol/ L e allora ε è definita assorbanza specifica
molare. Siccome A è adimensionale e b è di solito in centimetri, le dimensioni di ε sono L/mol cm. Per
altre unità di concentrazione si definisce una assorbanza specifica (a), le cui dimensioni dipendono dalle
unità di concentrazione usate (es. a è in L g-1 cm-1 se la concentrazione è in g L-1).
La legge di Lambert-Beer descrive la curva di calibrazione di un metodo di analisi spettrofotometrico.
La conoscenza della assorbività specifica molare (o di una grandezza equivalente) è fondamentale in
una analisi spettrofotometrica. Anche se assorbività specifiche sono riportate è sempre preferibile
determinarle sperimentalmente al momento della analisi. Le informazioni per la scelta della lunghezza
d’onda sono ottenibili dallo spettro di assorbimento misurato nelle adatte condizioni sperimentali.
Una miscela di due specie con assorbimenti sovrapposti può essere analizzata sfruttando l’additività delle
assorbanze. Misure separate di assorbanza effettuate a due lunghezze d’onda scelte in modo che le
assorbanze specifiche molari delle specie siano molto differenti tra di loro permettono di ricavare la
composizione della miscela. La procedura può essere generalizzata ad una miscela di n componenti
effettuando misure ad un numero di lunghezze d'onda almeno pari al numero delle specie da determinare.

Un ossimetro viene usato in analisi clinica per misurare lo stato di ossigenazione del sangue. Le varie
forme di emoglobina (emoglobina libera, ossiemoglobina, carbossiemoglobina, ecc.) vengono
determinate con misure a diverse lunghezze d'onda sfruttando i diversi spettri di assorbimento. Lo stato di
ossigenazione del sangue viene definito attraverso parametri quali la frazione di ossiemoglobina (FO 2Hb
%):

In una misura spettrofotometrica l'errore è minimo in un intervallo intermedio di valori di assorbanza

(entità dell'errore e intervallo di assorbanze ottimali per la misura dipendono comunque dallo strumento
usato). Un intervallo di valori di assorbanza adeguato potrebbe essere da 0,1 – 0,2 a 1,5 – 2,0. Per
assorbanze basse è difficile valutare la reale differenza fra le radiazioni trasmesse dal campione e dal
bianco. Per assorbanze elevate è difficile misurare accuratamente la radiazione trasmessa dal campione.

Le deviazioni osservate sperimentalmente dalla legge di Lambert-Beer riguardano sempre la relazione fra
assorbanza e concentrazione:
- Deviazioni reali si verificano se non sono valide le assunzioni alla base della legge di Lambert-Beer,
si verificano se l’assorbanza specifica molare varia con la concentrazione a causa delle interazioni fra
le molecole dell’analita (più intense a concentrazioni elevate). La concentrazione alla quale si
verificano le deviazioni dipende dalla forza delle interazioni fra le molecole di analita (per alcuni
analiti l'effetto è evidente già a 10-4 – 10-5 M). Un fenomeno simile può verificarsi anche al variare
della concentrazione di un elettrolita (le concentrazioni richieste sono in genere abbastanza elevate).
Non si possono impedire le interazioni intermolecolari, pertanto si cerca di evitare questo fenomeno
operando in soluzioni diluite. Non è possibile prevedere la direzione della deviazione (le interazioni
intermolecolari possono sia aumentare che diminuire la capacità di assorbimento dell'analita).

- Deviazioni chimiche si verificano in presenza di variazioni nella composizione della soluzione legate
alla presenza di equilibri. Si verificano quando l'analita è coinvolto in equilibri influenzati dalla
concentrazione e che producono specie con differente assorbimento. Le deviazioni sono dovute allo
spostamento dell'equilibrio al variare della concentrazione (le singole specie seguono ancora la legge
di Lambert-Beer). Possono causare questa deviazione equilibri quali, es., acido-base, complessazione
e dimerizzazione. Non è possibile prevedere la direzione della deviazione (dipende dallo spettro di
assorbimento delle specie e dalla lunghezza d'onda di misura). Questo fenomeno può in linea di
principio essere evitato (se il sistema lo permette) effettuando le misure in un punto isosbestico.

- Deviazioni strumentali si verificano a causa di limitazioni della strumentazione, non contemplate

dalla legge di Lambert-Beer. La legge di Lambert-Beer è rigorosamente valida per radiazioni
monocromatiche ma sul campione viene sempre inviato un intervallo di lunghezze d’onda. Se in
questo intervallo l’assorbanza dell’analita è costante ciò non rappresenta un problema, in caso
contrario si hanno deviazioni negative dalla legge di Lambert-Beer. Questo fenomeno può essere
ridotto agendo a livello strumentale e/o sul metodo di analisi: Riducendo l’ampiezza dell’intervallo
di lunghezze d’onda (gli strumenti a monocromatore sono spesso migliori di quelli con filtri);
Effettuando la misura a una lunghezza d’onda dove l’assorbanza è costante (un massimo dello spettro
di assorbimento).
Natura degli spettri di assorbimento

Le analisi spettrofotometriche nell’UV/Visibile sono essenzialmente analisi di tipo quantitativo (gli

spettri UV/Vis non hanno in genere sufficienti caratteristiche per permettere di effettuare analisi
qualitative accurate). Questa tecnica viene quindi spesso utilizzata a supporto di altre tecniche analitiche
più specifiche (ad esempio, con uno spettro UV/Vis è possibile confermare la presenza di gruppi
insaturi). Per effettuare una identificazione possono però essere utilizzati reagenti specifici per la specie
da determinare, che formano soltanto in sua presenza composti con un assorbimento caratteristico. Le
sostanze in grado di dare un assorbimento nell’UV/Visibile rilevante a fini analitici sono: composti
organici (insaturi o aromatici), ioni metallici (ioni del blocco d) e complessi di ioni metallici del blocco
d.
Dal punto di vista della spettroscopia UV/Visibile, gli unici composti organici rilevanti a fini analitici
sono quelli con doppi/tripli legami o sistemi aromatici. Infatti, le transizioni elettroniche delle molecole
sature (caratterizzate da legami singoli) avvengono ad energie troppo alte (sotto 180 nm), e queste
lunghezze d’onda vengono assorbite dal gas atmosferici (azoto ed ossigeno). I gruppi insaturi nelle
molecole organiche responsabili dell’assorbimento UV/Visibile vengono definiti cromofori, e le
transizioni responsabili dell’assorbimento osservato sono transizioni p → p*. L’importanza dal punto di
vista analitico di queste transizioni è legata sia alla loro energia (esse cadono normalmente nel vicino
ultravioletto e, in certi casi, nel visibile) che alla loro intensità (le assorbanze specifiche molari sono in
genere alte e quindi i metodi analitici hanno una elevata sensibilità).
Un secondo tipo di transizioni rilevanti dal punto di vista analitico è quello che si verifica in composti
organici saturi contenenti eteroatomi con elettroni di non legame (ossigeno, azoto, zolfo, alogeni).
Questi composti possono dare luogo a transizioni n → s* (o n → p* nel caso vi siano anche sistemi
insaturi), che cadono generalmente nell’UV e sono caratterizzate da assorbività specifiche molari
relativamente basse (100 – 1000).
Gli ioni dei metalli di transizione presentano assorbimento nell’UV-Vis in almeno alcuni dei loro stati di
ossidazione (in particolare quelli con configurazioni d1 – d 9 ) a causa di transizioni che avvengono
all’interno degli orbitali 3d e 4d (transizioni d → d). Le bande di assorbimento risultanti sono comunque
deboli: sono sufficienti per determinare il colore di sali solidi e soluzioni relativamente concentrate, ma
non abbastanza per avere applicazioni analitiche.
I metalli del blocco d si determinano in modo più efficace attraverso la formazione di complessi con
leganti organici, caratterizzati dalla presenza di bande di assorbimento dovute a transizioni di
trasferimento di carica (questo tipo di transizioni è comunque presente anche in altre classi di molecole
non contenenti ioni metallici, ad esempio nel complesso fra lo iodio e l’amido utilizzato come indicatore
nelle titolazioni iodometriche). I vantaggi di tali transizioni in assorbimento sono:
- assorbimento nel visibile
- assorbività specifiche molari elevate
- l’assorbimento si verifica solo nel complesso (è possibile usare un eccesso di reagente per garantire la
complessazione completa del metallo senza avere interferenze da parte del reagente nella misura di
assorbimento)

Le analisi spettrofotometriche nell’UV-Vis sono in prevalenza utilizzate per analisi di tipo quantitativo.
- Facilità e convenienza le procedure di analisi sono in genere semplici e la strumentazione base è
relativamente economica.
- Ampia applicabilità la maggioranza delle sostanze assorbe nell’UV-Vis (se ciò non si verifica
possono essere sfruttate reazioni chimiche che producono specie assorbenti).
- Buona accuratezza e riproducibilità l’accuratezza è tipicamente dell’1 - 5% ma può essere
migliorata.
- Discreta sensibilità per sostanze con assorbività specifiche molari relativamente elevate (es. 10000
M-1 cm-1) i limiti di rivelabilità sono di 10-5-10-6 M.

Una delle maggiori limitazioni delle tecniche spettrofotometriche è la scarsa selettività, che le rende
inadatte all'analisi diretta di miscele complesse.
Questa limitazione può essere superata in vari modi.
- Uso di reattivi specifici Un reattivo specifico per la specie di interesse può essere impiegato per
convertirla in una più facilmente determinabile (es. con un assorbimento più intenso o in una zona
dello spettro meno soggetta a interferenze).
- Accoppiamento con una tecnica separativa La spettrofotometria UV-Vis viene usata come tecnica
di rivelazione nelle analisi cromatografiche (es. HPLC) poiché in questo caso la misura viene
effettuata dopo la separazione del campione nei singoli costituenti.

Strumentazione per spettrofotometria

Gli strumenti per misure di assorbimento nell'UV-Vis (fotometri e spettrofotometri) consistono in

quattro componenti principali: Sorgente di radiazione, Selettore di lunghezza d'onda, Contenitore del
campione e Rivelatore.

Sorgenti di radiazione

Vengono utilizzate sorgenti a spettro continuo accoppiate a sistemi per selezionare la lunghezza d'onda
più adatta all'analisi. Molti strumenti usano due sorgenti combinate per coprire tutto lo spettro UV-
visibile. Per alcune applicazioni (es. spettroscopia atomica) sono utilizzate anche sorgenti con spettro a
righe. Le lampade a tungsteno e a deuterio sono usate in coppia perché permettono di coprire tutto lo
spettro UV-visibile.

Selettori di lunghezze d’onda

Un filtro lascia passare solo un certo intervallo di lunghezze d’onda (per effettuare misure a diverse
lunghezze d'onda è quindi necessario avere più filtri). Si usano di solito filtri ad interferenza,
caratterizzati da bande passanti strette e quindi particolarmente adatti per misure di assorbanza. Il
selettore di lunghezza d'onda si trova in genere prima del campione per evitare che esso venga investito
da tutta la radiazione emessa dalla sorgente. Uno spettrofotometro con filtri è meno versatile ma questo
tipo di strumenti è comunque diffuso in alcuni ambiti (es. analisi chimico-cliniche). Un monocromatore
permette di variare in modo continuo la lunghezza d’onda selezionata. I più comuni monocromatori sono
a reticolo (in genere a riflessione) e, come i filtri ad interferenza, selezionano una lunghezza d'onda
sfruttando un processo di interferenza.

Contenitori per il campione

Le celle (cuvette) per spettrofotometria hanno due facce ottiche contrapposte ed un cammino ottico noto
(per le misure più comuni si usano celle da 1,000 cm). La scelta del materiale della cella è legata al tipo
di campione (es. acquoso o in solvente organico) ed alla lunghezza d'onda impiegata (es. visibile oppure
UV). Il quarzo (e in parte il vetro) sono utilizzabili in tutto il campo UV-Vis e con ogni tipo di
campione. I materiali plastici (es. polistirene) possono essere utilizzati solo nel visibile (alcune plastiche
arrivano fino a 250 - 280 nm) e non resistono a molti solventi organici. Sono però economici e usati se
servono materiali monouso (es. per analisi chimico-cliniche).
Le micropiastre (o piastre microtiter) permettono di effettuare misure su numeri elevati di campioni
(tipicamente 96 o 384). Questo tipo di formato è diffuso in campo chimico-clinico, dove i campioni da
analizzare sono numerosi e potenzialmente infetti (le comuni micropiastre sono in materiale plastico e
quindi monouso). Le misure in micropiastra sono meno affidabili di quelle in celle spettrofotometriche
convenzionali. Il cammino ottico dipende dal volume del campione, quindi la misura è influenzata da
errori di dispensazione. Il menisco superiore (oppure eventuali bolle sulla superficie della soluzione)
possono distorcere il fascio di radiazione e alterare il risultato della misura.

Rivelatori

Il rivelatore converte la radiazione trasmessa dalla cella in un segnale elettrico legato alla sua intensità. In
spettrofotometria le intensità delle radiazioni da misurare sono relativamente elevate e non sono necessari
rivelatori molto sensibili (la maggior parte degli strumenti utilizza semplici fotodiodi). Nelle misure di
emissione la situazione è diversa (le emissioni sono in genere deboli) e quindi si utilizzano rivelatori
molto sensibili (es. tubi fotomoltiplicatori). I fotoni incidenti determinano la formazione di coppie
elettrone + buca, che si traducono in una corrente elettrica misurabile.

Spettrofotometro a singolo raggio

Spettrofotometro a doppio raggio nel tempo

Spettrofotometro a doppio raggio nello spazio

Spettrofotometro con rivelatore a matrice di diodi

Spettrofotometro per micropiastre

Gli spettrofotometri portatili per uso sul campo hanno prestazioni inferiori rispetto agli strumenti da
laboratorio ma permettono comunque misure sufficientemente accurate (es. nelle analisi ambientali).
Emissione di radiazione

Un’emissione di radiazione si verifica quando uno stato eccitato, per sua natura instabile, decade allo
stato fondamentale o a uno stato eccitato a minore energia. L'emissione di radiazione (luminescenza) è
solo uno dei possibili processi di disattivazione di uno stato eccitato; quindi, avviene solo se compete
efficacemente con gli altri processi di disattivazione (es. dissipazione dell'energia sotto forma di calore).
Come per l'assorbimento, anche la radiazione emessa ha energia pari alla differenza di energia fra i livelli
energetici coinvolti ed è quindi caratteristica della specie in esame. Vengono emesse soltanto le radiazioni
con energia pari alla differenza di energia fra lo stato eccitato di partenza e lo stato di arrivo.
I processi di emissione sono classificati in base a come viene ottenuto lo stato eccitato.
- Fotoluminescenza Assorbimento di radiazione (es. fluorescenza, fosforescenza).
- Luminescenza chimica Reazione chimica (es. chemiluminescenza, bioluminescenza).
- Emissione termica Riscaldamento (es. emissione in fiamma). Le temperature richieste per questo
processo sono molto elevate (spesso oltre 1000°C) e causano la decomposizione della maggior parte
delle specie molecolari. Questo tipo di eccitazione viene usato solo in spettroscopia atomica.
Come per l'assorbimento, anche le caratteristiche dello spettro di emissione dipendono dagli stati
energetici della specie in esame. Gli atomi hanno spettri di emissione a righe. In spettroscopia atomica
la lunghezza d'onda dell'emissione può essere usata per identificare le specie presenti in un campione
(ogni atomo emette righe caratteristiche e facilmente riconoscibili).
Le molecole presentano spettri di emissione a bande. In genere l'emissione proviene dallo stato eccitato
a minore energia, indipendentemente da quale stato sia stato inizialmente prodotto fornendo energia al
sistema. Questo fenomeno è legato alla esistenza di veloci processi di decadimento non radiativo,
attraverso i quali gli stati eccitati a maggiore energia decadono a quelli ad energia inferiore senza
emissione di radiazione.
Nel caso della fotoluminescenza, la natura dello stato emittente determina due diversi processi di
emissione. Fluorescenza (emissione originata dallo stato di singoletto eccitato S1). Fosforescenza
(emissione originata dallo stato di tripletto eccitato T1).
La natura dello stato eccitato influenza non solo l'energia della emissione (la fluorescenza è a energia
maggiore) ma anche la velocità del processo di emissione: la fluorescenza (transizione S1 → S0 ) è un
processo molto veloce (tipicamente avviene in pochi ns), mentre la fosforescenza (transizione T 1 → S0 )
avviene in tempi più lunghi (µs o ms).
A causa dei processi di decadimento non radiativo e di altri fattori (es. legati alla differente interazione
con l'ambiente degli stati eccitato e fondamentale) la radiazione emessa ha sempre una energia inferiore
(ovvero una maggiore lunghezza d'onda) rispetto a quella di eccitazione. Lo spostamento di Stokes
rappresenta la differenza di energia fra le radiazioni coinvolte nei processi di assorbimento e di emissione
dovuti alla stessa transizione elettronica e dipende dalla struttura della molecola (molecole con elevata
rigidità strutturale tendono ad avere spostamenti di Stokes inferiori). In molti casi, siccome i livelli
energetici coinvolti sono gli stessi, gli spettri di emissione (almeno quelli di fluorescenza) sono
approssimativamente speculari rispetto a quelli di assorbimento.

Spettroscopia molecolare in fluorescenza

A causa delle intensità di emissione relativamente elevate, la fluorescenza è il processo di

fotoluminescenza più usato in chimica analitica. La fosforescenza ha applicazioni analitiche molto più
limitate poiché l'emissione è debole e in molti casi si verifica solo in particolari condizioni (es. allo stato
solido o in soluzioni congelate). La capacità di una specie di emettere è definita attraverso la resa
quantica di fluorescenza (ΦF ).

Il valore di ΦF varia da 0 (specie non fluorescente) a 1 (specie intensamente fluorescenti). Per la

fosforescenza esiste un parametro equivalente (ΦP), generalmente molto inferiore all'unità.
Poiché l'emissione si verifica solo se la fluorescenza compete efficacemente con gli altri processi di
disattivazione dello stato eccitato, le specie caratterizzate da una elevata emissione di fluorescenza sono
relativamente poche. La fluorescenza si osserva più facilmente in molecole insature, con una bassa
energia delle transizioni π → π* (es. ad elevata aromaticità) e con una elevata rigidità strutturale.
Anche l'ambiente è importante: solventi ad elevata viscosità, basse temperature, adsorbimento su una
superfice sono fattori che in genere favoriscono i processi di emissione.
Da punto di vista spettrale una specie fluorescente è caratterizzata da due tipi di spettro (spettro di
emissione e spettro di eccitazione). Lo Spettro di eccitazione rappresenta l'efficienza con la quale le
diverse radiazioni inviate sul sistema originano la fluorescenza (in genere ha andamento simile allo
spettro di assorbimento). Lo Spettro di emissione rappresenta la distribuzione spettrale della fluorescenza
emessa dalla molecola.
Nella fluorescenza non esiste una relazione lineare fra segnale e concentrazione. L’intensità di
fluorescenza dipende dalla radiazione di eccitazione assorbita (che fornisce l'energia necessaria al
processo di eccitazione) e dalla resa quantica di fluorescenza della specie secondo la:
Il coefficiente k dipende (fra le altre cose) dalla frazione di emissione effettivamente misurata (solo una
frazione di quella effettivamente emessa) e varia con strumento e condizioni di misura. Pertanto, una
misura di fluorescenza dipende dallo strumento (la curva di calibrazione è quindi specifica per ogni
strumento).
La curva di calibrazione può comunque essere approssimata a una retta se l'assorbanza della soluzione
è bassa (in genere si assume una dipendenza lineare per A < 0,05).
Per concentrazioni elevate entrano in gioco altri fattori (es. variazioni nella distribuzione dell'emissione
nello spessore della cella, autoassorbimento) che possono portare alla diminuzione del segnale di
fluorescenza con un ulteriore aumento della concentrazione.
Le tecniche di analisi quantitativa basate sulla fluorescenza permettono di ottenere limiti di rivelabilità
inferiori rispetto alle tecniche di assorbimento, anche se (dato il minore numero di specie determinabili)
il loro campo di applicazione è più limitato. Queste tecniche sono comunque usate anche per specie non
fluorescenti, es. sfruttando reazioni chimiche che portano a prodotti fluorescenti.
Gli strumenti per misure di fluorescenza (fluorimetri o spettrofluorimetri) condividono varie
componenti con altri strumenti per spettroscopia ottica:
- Sorgente di radiazione: Vengono generalmente usate sorgenti a spettro continuo di potenza elevata.
L'intensità della fluorescenza dipende dalla potenza della radiazione di eccitazione; quindi, è
vantaggioso usare sorgenti intense (in particolare con elevata emissione nell'UV, dove assorbe la
 maggior parte delle sostanze organiche). Lo spettro presenta un continuo associato a temperature
molto elevate (la lampada copre tutto il campo UV-Vis e viene quindi usata come sorgente unica).

- Selettori di lunghezze d’onda: Gli spettrofluorimetri possiedono due selettori di lunghezza d’onda
(uno per la radiazione di eccitazione ed uno per quella emessa) posti ad angolo retto per evitare che la
radiazione di eccitazione interferisca nella misura. Con alcuni formati analitici (es. piastre
micropiastre) questa disposizione non è possibile e si devono usare geometrie differenti (es. fasci
leggermente divergenti) o altri sistemi per separare la radiazione di eccitazione da quella emessa.
Anche gli strumenti per fluorescenza possono usare filtri o monocromatori per la selezione delle
lunghezza d'onda.

- Contenitori per il campione Le celle per misure di fluorescenza hanno quattro facce ottiche (i
modelli comuni hanno un cammino ottico di 1 cm e possono essere usati anche per misure
spettrofotometriche). Contenitori per il campione Le celle per misure di fluorescenza hanno quattro
facce ottiche (i modelli comuni hanno un cammino ottico di 1 cm e possono essere usati anche per
misure spettrofotometriche).

- Rivelatori Le intensità delle radiazioni misurate in uno spettrofluorimetro sono in genere

relativamente basse e per questo motivo vengono impiegati rivelatori ad elevata sensibilità (es. tubi
fotomoltiplicatori).
Capitolo 5: Spettroscopia Atomica

Generalità

I metalli di interesse ambientale sono prevalentemente nella prima serie di transizione e nel blocco p.
Molti di essi sono di ampio uso industriale, quindi potenzialmente soggetti a dispersione nell’ambiente.
Piombo, cadmio e mercurio sono particolarmente rilevanti perché hanno elevati fattori di
bioconcentrazione e non possiedono (a differenza di altri) alcuna funzione biologica nota. L’APAT (2002)
ha definito metalli prioritari per il comparto acquatico: nichel, piombo, cadmio, mercurio.
Conservazione dei campioni di acqua per l’analisi dei metalli.
- Generalmente sono preferibili contenitori di polietilene rispetto a quelli di vetro, perché ci sono meno
rischi di contaminazione.
- I campioni acquosi devono essere acidificati (es. aggiunta di acido cloridrico o acido nitrico) per
evitare la precipitazione dei metalli.
- Per evitare contaminazioni occorre lavare accuratamente i contenitori con acidi.

L'analisi dei metalli prevede nella maggioranza dei casi uno stadio di preparazione del campione
precedente l'analisi vera e propria. Tale procedura di preparazione può avere varie funzioni:
- Degradazione e solubilizzazione della matrice del campione per rilasciare i metalli contenuti.
- Portare i metalli in un solvente adatto alla loro analisi.
- Concentrare i metalli presenti a livelli molto bassi.
- Separare i metalli (singolarmente o in gruppi) dalle specie che potrebbero interferire nell’analisi.
- Separare differenti forme chimiche e/o fisiche di un metallo per permetterne l’analisi indipendente.

Procedure di preparazione del campione per la successiva determinazione dei metalli:

Campioni acquosi relativamente puliti: estrazione dei metalli dal campione acquoso, possibilmente
concentrando gli analiti nell’estratto.
Campioni solidi (es. suolo, sedimento, rifiuto, tessuto vegetale o animale) o campioni acquosi molto
sporchi: digestione del campione per decomporre il materiale organico e solubilizzare il materiale
inorganico.
  Determinazione quali-quantitativa dei metalli nell’estratto.

Procedure di decomposizione dei campioni:

solo campioni solidi vanno incontro a fusione e incenerimento a secco. I campioni liquidi, in caso di
metallo disciolto, vengono prima filtrati e poi digeriti, altrimenti se si ha metallo totale si va
direttamente a digestione. Per campioni solidi o liquidi le procedure sono: Digestione con acido,
Digestione con acido assistita da microonde in recipiente aperto, Digestione con acido assistita da
microonde in recipiente chiuso.

Digestione con Acido

La digestione con acido (wet digestion) prevede il trattamento a caldo del campione con un acido o una
miscela di acidi (inorganici e/o ossidanti) fino alla sua dissoluzione. La scelta del reagente da impiegare
dipende dalla natura della matrice del campione e dal metallo da determinare. La massima temperatura
raggiungibile (operando a pressione atmosferica) è legata alla temperatura di ebollizione del reagente.
Grazie all'elevato potere ossidante, HNO3 e HClO4 sono gli acidi preferiti per la digestione di campioni
biologici. La dissoluzione di silicati rappresenta la più comune applicazione della digestione con HF.
Date le elevate temperature di ebollizione degli acidi impiegati, i trattamenti di digestione con acido
avvengono generalmente in recipienti di vetro aperti di dimensioni relativamente piccole ed il
riscaldamento viene attuato mediante riscaldatori termostatati che permettono la digestione simultanea di
più campioni (in genere a 6, 12 o 24 posizioni). Si possono condurre anche in recipiente chiuso, dotato di
valvola per il controllo della pressione interna.

Digestione assistita da microonde

Una procedura di digestione più moderna è la digestione assistita da microonde, dove per il
riscaldamento del campione viene utilizzato un riscaldatore a microonde. Questa tecnologia di
riscaldamento è più efficiente rispetto a quelle convenzionali, grazie alla maggiore efficienza ed
uniformità di trasferimento del calore. Un ulteriore vantaggio è la possibilità di utilizzare contenitori di
plastica (es. Teflon) che minimizzano il rischio di contaminazione del campione in quanto le microonde
riscaldano direttamente il campione piuttosto che il contenitore stesso. I sistemi per digestione assistita da
microonde in recipiente chiuso impiegano contenitori in materiale plastico ermetici è possibile operare a
pressioni di lavoro più elevate di quella atmosferica, e quindi aumentare la temperatura di ebollizione dei
reagenti impiegati. I reagenti utilizzati nella digestione assistita da microonde sono gli stessi impiegati
nella digestione con acido. In funzione dei metalli da determinare e della natura della matrice possono
essere utilizzati acidi singoli o miscele di acidi, eventualmente addizionati di ulteriori agenti ossidanti (es.
H2O2 ) o catalizzatori (es. V2O5 ).

Tecniche di spettroscopia atomica

Nella maggior parte delle tecniche di analisi elementare il campione è trasformato in atomi (atomizzato)
con vari metodi. Per la determinazione di metalli in concentrazioni comprese fra il mg/L ed il μg/L
vengono generalmente impiegate tecniche di spettroscopia atomica. Le principali sono:
- Spettroscopia atomica di assorbimento in fiamma Flame Atomic Absorption Spectroscopy (F-AAS);
- Spettroscopia atomica di assorbimento in fornetto di grafite Graphite Furnace Atomic Absorption
Spectroscopy (GF-AAS);
- Spettrometria atomica di emissione con sorgente a plasma ad accoppiamento induttivo Inductively
Coupled Plasma - Optical Emission Spectrometry (ICP-OES);
- Spettrometria di massa atomica con sorgente a plasma ad accoppiamento induttivo Inductively
Coupled Plasma - Mass Spectrometry (ICP-MS).

Spettri di assorbimento atomici

Se un atomo ha livelli di energia potenziale E0 , E1 , E2 ecc., ed i fotoni hanno una frequenza hν0,1 = E1 –
E0 , oppure hν0,2 = E2 – E0 , ecc., un suo elettrone può essere eccitato dal livello fondamentale E 0 al livello
eccitato E1 o E2 , rispettivamente. Il processo in cui il fotone promuove l'eccitazione dell'elettrone si
chiama assorbimento.
La particella eccitata si diseccita normalmente per decadimento termico, trasferendo l'eccesso di energia
attraverso collisioni con altre particelle: in tal caso il decadimento è un processo non radiativo.
Gli atomi sono caratterizzati da spettri di assorbimento a righe, determinati dalle transizioni elettroniche
dal livello elettronico fondamentale ad uno o più livelli elettronici eccitati. In condizioni normali, le righe
di assorbimento atomico sono estremamente strette (0,1 – 0,01 nm) e richiedono strumentazione
specifica.

Spettroscopia di assorbimento atomico

Assorbimento atomico: aspetti quantitativi: A= x*b*N

x è il coefficiente spettrale di assorbimento atomico; b è lo spessore dello strato assorbente (cammino
ottico); N il numero totale di atomi liberi.
La quantità di luce assorbita è proporzionale al numero degli atomi dell'analita nel cammino ottico.

Strumentazione

- Lampada a catodo cavo: La lampada a catodo cavo (Hollow cathode lamp, HCL) risponde alla
necessità di avere emissione alla stessa lunghezza d’onda dell’assorbimento dell’elemento da
analizzare. Sono disponibili per più di 70 elementi. Esistono anche lampade multielemento.

- Atomizzatori: La temperatura dell’atomizzatore influenza in modo complesso il processo di

atomizzazione, e può essere necessario ottimizzare i parametri della sorgente di atomizzazione
separatamente per l'analisi di ogni elemento. L’aumento della temperatura aumenta:
1. efficienza di atomizzazione. In linea di principio, questo determina un incremento della
sensibilità indipendentemente dalla tecnica di rivelazione utilizzata.
2. frazione di atomi eccitati. Questo è vantaggioso per le misure di emissione atomica, ma non per le
misure di assorbimento, possono rivelare soltanto gli atomi allo stato fondamentale.
3. frazione di atomi ionizzati. Nelle spettroscopie atomiche che impiegano atomizzatori a fiamma
gli ioni non vengono analizzati; quindi, una maggiore ionizzazione dell'analita riduce la
sensibilità.

- Atomizzatori a fiamma: Un bruciatore a premiscelamento a flusso laminare permette di ottenere

una fiamma stabile e con un cammino ottico relativamente lungo (5 - 10 cm). Uno dei parametri
principali che caratterizzano una fiamma è la sua temperatura, legata alla natura del combustibile e
dell’ossidante impiegati. Il carattere ossidante o riducente di una fiamma (legato alle proporzioni di
combustibile ed ossidante) è un altro parametro importante: le fiamme ossidanti (quindi con una
maggiore quantità di comburente) hanno temperature più elevate perché la combustione è più
completa ma nella fiamma si possono formare ossidi di metalli refrattari.
- Atomizzatore elettrotermico: Nell’atomizzatore elettrotermico (o fornetto di grafite)
l’atomizzazione viene ottenuta grazie al riscaldamento prodotto per passaggio di una corrente
elettrica. Questo sistema di atomizzazione viene usato per misure di assorbimento o di fluorescenza.
A differenza delle fiamme, l'atomizzatore elettrotermico è un sistema di atomizzazione discontinuo. Il
campione può essere liquido (1 - 100 L) oppure solido. Vantaggi: elevata sensibilità; possibilità di
definire il profilo di riscaldamento.

- Monocromatore: seleziona la lunghezza d’onda utilizzata per la misurazione.

- Rivelatore: misura la luce assorbita dagli atomi liberi.

Focus: vantaggi e svantaggi atomizzatore a fiamma ed elettrotermico

Atomizzatore a fiamma
Costo e versatilità: I sistemi di atomizzazione a fiamma sono relativamente poco costosi e possono essere
impiegati - almeno in linea di principio - in quasi tutte le forme di spettrometria atomica.
Gestione del segnale: Il funzionamento continuo dell'atomizzatore a fiamma permette di avere segnali
costanti, facilmente misurabili e con elevata riproducibilità.
Interferenze di fondo: La fiamma presenta, sia in assorbimento che in emissione, un segnale di fondo
dovuto ai prodotti della combustione. Questi prodotti originano spesso spettri a bande, quindi le
interferenze si estendono in un ampio intervallo di lunghezze d'onda.
Formazione di specie molecolari: Se come comburente vengono usati aria o ossigeno alcuni analiti
possono formare ossidi molecolari.
Efficienza di atomizzazione: Gli atomizzatori a fiamma sono intrinsecamente poco efficienti, anche a
causa del breve tempo di residenza dell'analita nella fiamma.
Atomizzatore elettrotermico
Elevata sensibilità. L’atomizzazione avviene pressoché istantaneamente ed in un volume ristretto,
permettendo di ottenere una elevata densità di specie atomiche anche con campioni molto piccoli
(dell'ordine del microlitro o meno).
Procedura ottimizzata. La possibilità di ottimizzare il profilo di riscaldamento per un dato campione
aumenta l’efficienza di atomizzazione e riduce l’effetto matrice. Entro certi limiti campioni solidi,
semisolidi e sospensioni possono essere analizzati direttamente.
Ridotte interferenze. Poiché nel sistema non avviene una combustione, l'atomizzazione avviene in un
ambiente chimicamente inerte e non si hanno interferenze dovute ai prodotti di combustione.
Funzionamento discontinuo. Il tempo a disposizione per la misura è limitato e il segnale non può essere
mediato nel tempo: gli atomizzatori elettrotermici garantiscono elevate sensibilità ma spesso precisione
ed accuratezza sono minori di quelle ottenibili con atomizzatori a fiamma o a plasma.
Tempi lunghi di analisi. Per ogni campione è richiesto un completo ciclo di riscaldamento.

F-AAS E GF-AAS

La spettroscopia di assorbimento atomico (AAS) che impiega come sorgenti di atomizzazione sia la
fiamma (F-AAS) che il fornetto di grafite (GF-AAS) è stata fino a tempi recenti la tecnica di
spettroscopia atomica più utilizzata in campo ambientale.

Spettri di emissione atomica

Se un atomo viene portato ad uno stato eccitato dall’energia fornita dall’atomizzatore, un suo elettrone
viene eccitato ad un livello eccitato E1 o E2 e può tornare ad uno stato a più bassa energia emettendo un
fotone.
Il processo in cui l’elettrone torna allo stato a più bassa energia con emissione di un fotone si chiama
emissione. In tutte le tecniche di emissione il segnale in uscita dal fotomoltiplicatore è direttamente
proporzionale alla concentrazione di analita: IE= k C
IE intensità della radiazione luminosa; C concentrazione dell’analita; k costante.

Strumentazione Atomizzatore -> Monocromatore -> Rivelatore

Atomizzatore a plasma

Negli atomizzatori a plasma il campione viene atomizzato attraverso un nebulizzatore in un plasma di gas
inerte ionizzato (argon) ad altissima temperatura (5000 - 10000°C). A queste temperature una frazione
significativa degli atomi viene ottenuta in forma ionica o allo stato eccitato. Il tipo più utilizzato di
atomizzatore a plasma è l'atomizzatore a plasma ad accoppiamento induttivo (ICP), dove il plasma
viene riscaldato da un generatore a radiofrequenza.
Vantaggi:
Alta temperatura. L’alta temperatura garantisce una elevata efficienza di atomizzazione e la completa
distruzione della matrice. Una frazione notevole di analita viene ottenuta sotto forma di ioni ed atomi allo
stato eccitato, permettendo l'impiego di questo atomizzatore in spettroscopia di emissione atomica e in
accoppiamento alla spettrometria di massa.
Ridotte interferenze. Analogamente agli atomizzatori elettrotermici, l'atomizzazione avviene in un
ambiente chimicamente inerte ed i segnali di fondo sono ridotti.
Elevata riproducibilità e bassi limiti di rivelazione.
Svantaggi:
Costo. Gli atomizzatori a plasma hanno elevati costi di acquisto e di gestione.
Incompatibilità con solventi organici. Poiché i solventi organici non vengono bruciati, essi tendono a
formare depositi carboniosi all'interno dell'atomizzatore.

ICP-OES

Nella spettrometria atomica di emissione con sorgente al plasma l'atomizzatore a plasma viene
accoppiato con un sistema in grado di analizzare la radiazione emessa dalle specie atomiche eccitate che
si formano nell'atomizzatore. Per questo tipo di misure vengono in genere utilizzate le sorgenti al plasma
ad accoppiamento induttivo (strumenti ICP-OES). Poiché l'atomizzatore a plasma è in grado di eccitare
simultaneamente praticamente tutti gli elementi di interesse ambientale, gli strumenti ICP-OES
possiedono in genere rivelatori progettati per effettuare analisi multielemento.

Spettrometria di massa

Le principali applicazioni della spettrometria di massa riguardano i composti organici, ma questa tecnica
può essere utilizzata anche nell’analisi elementare, principalmente (ma non solo) per la determinazione
dei metalli.
Analisi di composti organici. Le principali applicazioni della spettrometria di massa all’analisi di
composti organici si basano sull’accoppiamento con tecniche separative (gascromatografia GC-MS o
cromatografia liquida LC-MS).
Analisi elementare Le principali applicazioni della spettrometria di massa all’analisi elementare si
basano sull’accoppiamento con la sorgente a plasma ad accoppiamento induttivo (tecniche ICP-MS).

Capitolo 6: Tecniche Cromatografiche

ESTRAZIONE CON SOLVENTE

L’estrazione è il trasferimento fisico di un soluto da una fase all’altra. Un’estrazione, in chimica

analitica, si effettua quando bisogna:
- Isolare l’analita di interesse.
- Concentrare l’analita di interesse.
- Separare l’analita di interesse da specie che possono interferire con l’analisi.

L’estrazione si basa sull’utilizzo di liquidi immiscibili tra loro, cioè liquidi che rimangono in fasi separate
anche quando miscelate in qualsiasi rapporto. I solventi organici a bassa polarità sono immiscibili con
l’acqua. Il caso più comune è l’estrazione di una soluzione acquosa con un solvente organico. I solventi
organici più utilizzati sono: Etere dietilico, Toluene ed Esano (Meno densi dell’acqua permettono di
formare una fase separata che galleggia sopra quella acquosa), Cloroformio, Diclorometano, Tetracloruro
di carbonio (più densi dell’acqua permettono di formare una fase separata su cui galleggia quella
acquosa).
La ripartizione avviene in base al concetto «il simile scioglie il simile». Supponiamo che il soluto S si
ripartisca tra le fasi 1 e 2, S sarà più solubile nella fase con polarità più simile alla sua. Il coefficiente di
ripartizione (K) è la costante di equilibrio per la reazione: S (in fase 1) ↔ S (in fase 2)

Dove AS rappresenta l’attività del soluto in fase 1 o 2.

PRINCIPI DELLA CROMATOGRAFIA

La cromatografia opera secondo lo stesso principio dell’estrazione ma in questo caso una fase viene
mantenuta fissa mentre l’altra passa attraverso di esse. Le tecniche analitiche cromatografiche sono
tecniche separative utilizzate per analizzare miscele complesse di sostanze. Possono venire effettuate in
differenti formati (su carta, su strato sottile, in colonna, ecc.) con finalità che vanno dal frazionamento dei
prodotti ottenuti da una sintesi chimica alla analisi quali-quantitativa di campioni complessi. Di per sé
una tecnica cromatografica permette solo la separazione degli analiti. Solo combinata con un sistema di
rivelazione e quantificazione degli analiti separati diventa una tecnica di analisi quantitativa. Tutte le
tecniche cromatografiche prevedono l’impiego di una fase stazionaria e una fase mobile in movimento
attraverso la fase stazionaria:
- La fase mobile in cromatografia è il solvente che si muove attraverso la colonna o sulla superficie
piana e può essere un liquido, un gas o un fluido supercritico.
- La fase stazionaria è quella che rimane ferma, ad esempio, dentro la colonna ed è solitamente un
liquido viscoso chimicamente legato alla superficie interna di un tubo capillare o sulla superficie di
particelle solide impaccate nella colonna.
Supponiamo di avere una soluzione contenente due soluti A e B. Facciamo fluire tale soluzione
all’interno di una colonna impaccata con particelle solide e riempita di solvente. A e B scendono
attraverso la colonna tramite l’aggiunta di altro solvente. Se il soluto A è adsorbito dalle particelle solide
con più forza del soluto B allora il soluto A scende attraverso la colonna più lentamente del soluto B. Il
soluto B uscirà quindi prima dalla colonna e la miscela iniziale è stata separata nei suoi componenti per
cromatografia.
Le tecniche cromatografiche sono classificabili per formato, natura della fase mobile e meccanismo di
ritenzione degli analiti.
- Formato si divide in:
1. Cromatografia planare: la fase stazionaria è una superficie piana, es. carta o una lastra di vetro o
altri materiali rivestita dalla fase stazionaria.
2. Cromatografia su colonna: la fase stazionaria è contenuta in una colonna (può riempirla o solo
rivestirne la superficie interna).
- Natura della fase mobile:
1. Cromatografia liquida: la fase mobile è un liquido.
2. Gascromatografia: la fase mobile è un gas.
3. Cromatografia fluida supercritica: la fase mobile è un fluido supercritico (uno stato con proprietà
intermedie tra un liquido e un gas).
- Meccanismo di ritenzione:
1. Adsorbimento.
2. Ripartizione.
3. Scambio ionico.
4. Esclusione dimensionale.
5. Affinità.
In alcuni casi diversi meccanismi di ritenzione possono operare contemporaneamente.

La cromatografia è stata inventata dal botanico russo Michail Semënovič Cvet all’inizio del XX secolo
come tecnica per la separazione di pigmenti fogliari. Per separare i pigmenti presenti nella clorofilla
depositò un estratto di foglie verdi in etere di petrolio in testa ad una colonna di vetro impaccata con
carbonato di calcio ed eluì con altro etere, separando i vari pigmenti in bande colorate. Il termine
cromatografia deriva dal greco kromatos (colore) e graphia (da graphos, scrivere) e significa
letteralmente “scrittura con il colore”.
La separazione degli analiti dipende dalla loro interazione con la fase stazionaria. I componenti della
miscela sono trascinati dalla fase mobile e contemporaneamente interagiscono con la fase stazionaria. La
loro velocità di migrazione dipende dall'affinità relativa per le due fasi: tanto più la sostanza è affine alla
fase stazionaria (e quindi tanto più tempo trascorre legata ad essa) tanto più lento sarà il suo movimento.
Sostanze con differenti affinità verranno quindi separate durante il processo cromatografico.
In una cromatografia in colonna, la separazione degli analiti determina la formazione di bande.
La diversa affinità degli analiti per la fase mobile e la fase stazionaria è legata alle caratteristiche
chimico-fisiche dell'analita e alle proprietà delle due fasi ed è definita dalla loro costante di
distribuzione KD. Tanto più è elevato KD, tanto maggiore è la frazione di analita presente nella fase
stazionaria e tanto più bassa è la sua velocità di migrazione.
La formazione di bande che migrano a diversa velocità può essere simulata in un modello nel quale la
fase stazionaria e la fase mobile della colonna sono suddivise in sezioni discrete. A mano a mano che la
fase mobile scorre lungo la colonna, per ogni sezione le concentrazioni degli analiti nelle due fasi
vengono ricalcolate in base alle loro costanti di distribuzione.

CROMATOGRAMMA

Le tecniche cromatografiche strumentali impiegano sistemi cromatografici dove gli analiti separati
vengono identificati all’uscita mediante un rivelatore. Il cromatogramma (il risultato dell'analisi) è il
grafico del segnale ottenuto dal rivelatore in funzione del tempo trascorso dall'iniezione degli analiti in
colonna (tempo di ritenzione, tr ). Quindi il tr per ciascun componente è il tempo trascorso tra l’iniezione
della miscela in colonna e il momento in cui quel componente giunge al rivelatore. Il volume di
ritenzione, Vr , è il volume della fase mobile necessario ad eluire un particolare soluto dalla colonna. Il
cromatogramma contiene tutte le informazioni relative al risultato della separazione cromatografica e può
essere utilizzato per effettuare analisi sia qualitative che quantitative. In un cromatogramma si assume
che il segnale misurato sia direttamente proporzionale alla concentrazione di analita. Ad ogni analita
rivelato è associato un picco cromatografico, che nel caso ideale ha una forma assimilabile ad una
Gaussiana, a cui sono associate una serie di informazioni relative all'analisi quali-quantitativa ed alle
caratteristiche del sistema cromatografico. L'area del picco è proporzionale alla quantità di analita ed è
quindi utilizzata per le analisi quantitative (in condizioni di elevata riproducibilità dei risultati e
simmetria dei picchi anche l’altezza può essere usata a scopi quantitativi). La larghezza del picco indica
l'efficienza del sistema cromatografico ed è legata alle caratteristiche della colonna (di solito si
considerano la larghezza alla base, Wb, o quella a metà altezza, Wh). Il tempo di ritenzione dipende dalle
interazioni dell'analita con la fase stazionaria e fornisce informazioni di tipo qualitativo.
In un cromatogramma, oltre ai picchi relativi agli analiti trattenuti dalla fase stazionaria, è normalmente
presente anche un primo picco dovuto alle sostanze non trattenute dalla colonna. Tale picco identifica il
tempo morto (tM), cioè il tempo impiegato dalla fase mobile per percorrere la colonna e dipende pertanto
solo dalla velocità di flusso della fase mobile. Il tempo di ritenzione corretto, t’r , per un soluto
trattenuto è pari al suo tempo di ritenzione tr meno tM. t’r = tr – tm
Per due componenti 1 e 2 la ritenzione relativa, a (fattore di separazione) è il rapporto dei loro tempi di
ritenzione corretti:
Maggiore è la ritenzione relativa, maggiore è la separazione tra i due componenti. Per ciascun picco del
cromatogramma, il fattore di ritenzione, k, è il tempo richiesto per eluire il picco meno il tempo tm
richiesto alla fase mobile per attraversare la colonna definito come multipli di t m
Infatti, se il soluto trascorre tutto il suo tempo nella fase mobile e un tempo nullo in fase stazionaria,
sarebbe eluito nel tempo tm e k=0. Se invece il soluto trascorresse lo stesso tempo in fase mobile e
stazionaria allora: tr=2tm e k=1 Se il soluto trascorre in fase stazionaria il triplo del tempo che trascorre
nella fase mobile, allora in ogni istante nella fase stazionaria vi sarà il triplo delle moli di soluto presenti
nella fase mobile. Si può quindi dire che:

Il fattore di ritenzione viene utilizzato per esprimere la capacità di una colonna di trattenere un analita in
alternativa al tempo di ritenzione assoluto (il fattore di ritenzione non dipende, es., dalla velocità del
flusso, mentre il tempo di ritenzione varia). In questo modo si mette in relazione il tempo di ritenzione
con il coefficiente di ripartizione e i volumi della fase mobile e della fase stazionaria. Possiamo esprimere
la ritenzione relativa come:

Cioè la ritenzione relativa di due soluti è proporzionale al rapporto dei loro coefficienti di ripartizione.

TEORIA DELLA SEPARAZIONE CROMATOGRAFICA

L'obiettivo di una analisi cromatografica è quello di separare gli analiti in una misura sufficiente per
poterli identificare e quantificare. La separazione dei picchi cromatografici degli analiti viene definita
quantitativamente attraverso la risoluzione (R) del cromatogramma relativa ad una data coppia di analiti.
La risoluzione R è legata sia alla differenza fra i tempi di ritenzione che alla larghezza dei picchi
cromatografici. Convenzionalmente per una separazione quantitativa di due analiti si richiede una
risoluzione di almeno 1,5 (in tali condizioni il picco cromatografico relativo ad un analita contiene circa
lo 0,3% dell'altro analita).
Una banda di soluto si allarga mentre si muove attraverso una colonna cromatografica. Una delle
principali cause dell’allargamento di banda è la diffusione ossia lo spostamento netto di un soluto da una
regione ad alta concentrazione ad una a bassa concentrazione a causa del movimento spontaneo delle
molecole.
Poiché la risoluzione dipende da due parametri distinti (WA/B e ΔtR ) ed indipendenti fra di loro, allo scopo
di migliorare la risoluzione è possibile agire sull'uno o sull'altro.
- Aumentare la separazione dei picchi cromatografici agendo sulla selettività della separazione
cromatografica (ovvero sui valori di tR ).
- Diminuire la larghezza dei picchi cromatografici migliorando l'efficienza del sistema cromatografico.
La differenza fra i tempi di ritenzione è legata alla selettività della separazione dei due analiti, definita
attraverso il fattore di selettività αB/A.
Nella definizione di selettività per convenzione B è l'analita con il tempo di ritenzione maggiore, quindi
αB/A>1. Per aumentare la separazione di due picchi cromatografici si devono modificare le condizioni
della separazione cromatografica (es. natura della fase mobile, temperatura, pH, ecc.) o al limite
utilizzare una colonna con maggiore selettività in modo da rendere differenti le due costanti di
distribuzione degli analiti (KD)A e (KD)B.
La larghezza dei picchi cromatografici è legata alla efficienza del sistema, espressa attraverso il numero
di piatti teorici (N) della colonna. Per aumentare l'efficienza si deve effettuare la separazione in
condizioni ottimali (es. in termini di velocità di flusso) o utilizzare una colonna con prestazioni migliori.
Il concetto di piatto teorico deriva dalle colonne industriali per distillazione frazionata, che sono
effettivamente divise in piatti in corrispondenza dei quali si instaura l'equilibrio fra fase vapore e fase
liquida. Nelle colonne cromatografiche il piatto è invece una entità virtuale (le colonne hanno una fase
stazionaria distribuita omogeneamente). Un piatto teorico è il segmento virtuale di colonna ove si
instaura un equilibrio completo fra l'analita nella fase mobile e in quella stazionaria. Maggiore è il
numero di piatti teorici (in funzione del tipo di colonna N può variare da poche centinaia a centinaia di
migliaia), maggiore è il numero di stadi di equilibrio e più stretti sono i picchi cromatografici.
L’altezza del piatto teorico (H) è la lunghezza σ2/x dove σ è la deviazione standard della banda gaussiana
e x è la distanza percorsa. Un piatto teorico non ha un corrispondente fisico, ma sfruttando la correlazione
fra numero di piatti teorici e larghezza del picco cromatografico è possibile determinare il numero dei
piatti teorici di una colonna cromatografica da un cromatogramma. Fra le varie relazioni che legano il
numero dei piatti teorici N ai parametri di un picco cromatografico, la più semplice utilizza il tempo di
ritenzione (tR) di un analita e la larghezza alla base del picco (Wb).
Se si esprime L in funzione del tempo invece che di lunghezza, l’espressione più semplice utilizza il
tempo di ritenzione (tR) di un analita e la larghezza alla base del picco (Wb).
L’efficienza di una colonna cromatografica, espressa coma altezza del piatto teorico (H), dipende da vari
fattori legati alle caratteristiche della colonna e dalla velocità di flusso della fase mobile. Questa
dipendenza viene descritta dalla teoria della velocità in cromatografia, che spiega la formazione e la
larghezza delle bande cromatografiche con andamento gaussiano (forme non gaussiane e/o asimmetriche
sono indicative di fenomeni non ideali durante il processo di separazione). Sebbene con caratteristiche
differenti, questo fenomeno si presenta in qualsiasi tipo di cromatografia.
La dipendenza dell'altezza del piatto teorico (H) dalla velocità di flusso (u) della fase mobile è descritta
da una equazione del tipo:
I coefficienti A, B e C descrivono l'importanza dei vari contributi all'altezza complessiva del piatto
teorico. Indipendentemente dal valore di questi coefficienti, l'equazione prevede che esista una velocità di
flusso ottimale (uott) in corrispondenza della quale l'altezza del piatto teorico è minima (H min) e la colonna
ha la massima efficienza.
- Coefficiente A (diffusione vorticosa o diffusione di Eddy) Questo fattore è tipico delle colonne
cromatografiche impaccate, nelle quali la fase stazionaria è composta da particelle che riempiono
completamente la colonna. La fase mobile (e gli analiti in essa disciolti) possono infatti percorrere
differenti cammini all'interno della fase stazionaria: se questi cammini hanno lunghezza differente, gli
 analiti giungono in tempi differenti all'uscita della colonna determinando l'allargamento della banda.
Questo fenomeno in prima approssimazione non dipende dal flusso poiché i percorsi all'interno
dell'impaccamento sono fissi.
- Coefficiente B (diffusione longitudinale) Descrive l'allargamento delle bande cromatografiche legato
al processo di diffusione spontanea dell'analita dalle zone ad elevata concentrazione (le bande
cromatografiche ) a quelle a concentrazione inferiore. La dipendenza inversa dal flusso si spiega
considerando che all'aumentare del flusso i tempi di ritenzione diminuiscono; quindi, il processo di
diffusione ha meno tempo per verificarsi.
- Coefficiente C (trasferimento di massa) Questo termine è legato al fatto che l'equilibrio degli analiti
fra la fase mobile e la fase stazionaria non si instaura istantaneamente in tutto il volume delle due
fasi, poiché l'analita deve diffondere all'interno di esse per uniformare le concentrazioni. La
dipendenza diretta dalla velocità di flusso è spiegabile considerando che per bassi flussi i tempi di
ritenzione sono maggiori; quindi, l'equilibrio ha a disposizione un tempo più lungo per instaurarsi.

L'importanza relativa dei vari contributi dipende dal tipo di cromatografia. Per colonne tubolari dove il
flusso della fase mobile è regolare ed i moti turbolenti non sono rilevanti (colonne capillari - ovvero
senza impaccamento - operanti a basse velocità di flusso) sono prevalenti i fattori associati alla diffusione
longitudinale (B) ed al trasferimento di massa all'interno della fase stazionaria (C S) e della fase mobile
(CM).

Per colonne impaccate è rilevante anche il termine legato alla diffusione vorticosa (A) mentre (soprattutto
ad alte velocità di flusso) la fase mobile viene mescolata dalla turbolenza; quindi, il termine C M ha poca
importanza.

OTTIMIZZAZIONE DI UNA SEPARAZIONE CROMATOGRAFICA

L'obiettivo finale di una analisi cromatografica è trovare le condizioni sperimentali adatte alla
separazione completa di tutti gli analiti di interesse contenuti nel campione in analisi in un tempo
ragionevole.
Nella ottimizzazione di una procedura cromatografica si considerano le seguenti variabili:

- Altezza del piatto teorico ed efficienza generale della separazione. Il modo più semplice per
aumentare il numero di piatti teorici è quello di aumentare la lunghezza della colonna, ma questo
allunga anche l'analisi. E' invece possibile, a parità di lunghezza, ridurre l'altezza del piatto teorico
controllando la velocità di flusso.

- Fattore di ritenzione. Un valore ottimale di k migliora la risoluzione ma per valori troppo alti l'analisi
viene allungata inutilmente (valori ottimali sono compresi in genere fra 2 e 10).

- Fattore di selettività. Si deve agire sul fattore di selettività quando due analiti non sono
adeguatamente separati. Nella cromatografia in fase liquida si può variare la composizione della fase
mobile, una operazione più complessa è la modifica chimica degli analiti in modo da renderli più
diversi dal punto di vista chimico-fisico.

- Separazione in gradiente. Talvolta se il campione contiene analiti con caratteristiche di ritenzione

molto differenti non è possibile trovare una sola condizione ottimale per la separazione. In tal caso è
possibile variare i parametri della separazione durante l'analisi, es. mediante programmazione della
temperatura (in GC) o eluizione in gradiente (in HPLC).
Nel complesso, l'efficienza di una colonna può essere aumentata applicando le seguenti strategie (che
però possono presentare altri tipi di controindicazioni).
- Mantenere la velocità di flusso al valore ottimale.
- Ridurre l'effetto dei cammini multipli (A), es. riducendo il diametro della colonna o la dimensione
delle particelle della fase stazionaria.
- Ridurre l'effetto della diffusione longitudinale (specialmente in GC) riducendo la temperatura.
- Ridurre l'effetto del trasferimento di massa nella fase stazionaria (CS ) usando fasi stazionarie di
spessore ridotto.

ANALISI QUALITATIVA E QUANTITATIVA

I rivelatori impiegati in cromatografia in genere non permettono l'identificazione diretta degli analiti.
L'analisi qualitativa in cromatografia è quindi basata essenzialmente sul confronto dei tempi di
ritenzione dei picchi del campione con quelli ottenuti dall'analisi nelle stesse condizioni di standard di
analiti. Per una identificazione più certa (una coincidenza casuale dei tempi di ritenzione è sempre
possibile), l'identità degli analiti potrebbe essere confermata da una seconda analisi effettuata in differenti
condizioni. I rivelatori basati su spettrometria di massa sono gli unici in grado di confermare l'identità di
un analita. I rivelatori spettroscopici (spettrofotometri UV/Vis e spettrofluorimetri) permettono
l’acquisizione dello spettro di assorbimento o emissione durante l’eluizione del picco, ma non danno in
genere informazioni sufficienti per una identificazione certa.
L'analisi quantitativa è basata sulla misura delle aree (o talvolta delle altezze) dei picchi cromatografici
e sul loro confronto con una curva di calibrazione ottenuta dall'analisi di standard. Le procedure di
calibrazione più comunemente utilizzate in cromatografia sono: Calibrazione esterna e Calibrazione
interna. La calibrazione interna viene utilizzata specialmente in gascromatografia per eliminare fattori di
incertezza legati, es., alla procedura di caricamento del campione. Lo standard interno deve essere
selezionato in modo che il suo picco cada in una zona del cromatogramma priva di analiti. Se l'intervallo
di tempi di ritenzione degli analiti da determinare è molto ampio, si possono usare più standard interni a
differenti tempi di ritenzione.

Capitolo 7: Cromatografia Liquida

La tecniche di cromatografia liquida sono impiegate per l'analisi di miscele di composti non volatili (es.
specie ad alto peso molecolare, specie ioniche, macromolecole biologiche). Sono classificate in base alle
caratteristiche della fase stazionaria e ai processi responsabili della ritenzione degli analiti:
Adsorbimento, Ripartizione, Scambio ionico, Esclusione dimensionale, Affinità.

Le tecniche di cromatografia liquida sono estremamente versatili in quanto offrono diversi meccanismi di
ritenzione; quindi, è possibile separare gli analiti sfruttando differenti proprietà chimico-fisiche.
Per Carica: cromatografia a scambio ionico;
per Solubilità: cromatografia di ripartizione/ adsorbimento;
per specificità per ligandi: cromatografia di affinità;
per dimensione: cromatografia a esclusione dimensionale;
per polarità: cromatografia di ripartizione.

Cromatografia di adsorbimento
La fase stazionaria è un materiale adsorbente polare, es. silice (SiO2) o allumina (Al2O3), con elevata
area superficiale specifica (tipicamente 50 - 100 m2 /g). La separazione si basa sul legame degli analiti sui
siti attivi superficiali del materiale adsorbente mediante interazioni relativamente forti (es. legami a
idrogeno, interazioni dipolo-dipolo o dipolo-dipolo indotto).
La fase stazionaria interagisce con i gruppi funzionali degli analiti. La cromatografia di adsorbimento è
spesso usata per separare e/o purificare i prodotti di una sintesi organica in quanto permette di
differenziare classi diverse di composti ma anche isomeri (es. geometrici) di un singolo composto. Le fasi
stazionarie in cromatografia di adsorbimento sono tutte polari; pertanto, questa tecnica cromatografica
non è adatta alla separazione di sostanze apolari.
Durante l'eluizione il solvente compete con gli analiti per i siti attivi della fase stazionaria. Solventi con
elevata capacità di legarsi alla fase stazionaria hanno maggiore potere eluente e riducono i tempi di
ritenzione degli analiti. Poiché la fase stazionaria è polare, vengono eluiti per primi gli analiti meno
polari (si legano meno fortemente alla fase stazionaria). La affinità dei solventi per la fase stazionaria
polare è descritta dalla serie eluotropica.

Cromatografia di ripartizione

La fase stazionaria è un liquido immiscibile con la fase mobile, in genere sotto forma di fase stazionaria
legata (un supporto di silice su cui le molecole della fase stazionaria "liquida" sono fissate
covalentemente ai gruppi -OH superficiali). La separazione è basata sulla ripartizione degli analiti legata
alla loro differente solubilità nelle due fasi. Nelle prime cromatografie di ripartizione la fase stazionaria
era un liquido che impregnava un supporto poroso inerte, ma veniva lentamente persa a causa della sia
pur minima solubilità nella fase mobile. Variando la natura dei gruppi legati alla silice è possibile
sintetizzare fasi stazionarie legate a diversa polarità, adatte alla separazione di composti con
caratteristiche differenti. Per evitare residue interazioni polari, gli eventuali gruppi – OH superficiali
residui sono spesso neutralizzati usando silani a basso peso molecolare (meno sensibili all'ingombro
sterico dei gruppi -OH adiacenti funzionalizzati).
Una ulteriore classificazione considera le polarità relative di fase stazionaria e fase mobile:
- Cromatografia di ripartizione in fase normale La fase stazionaria è più polare della fase mobile (un
solvente organico o una miscela di solventi organici). Vengono eluiti per primi i composti meno
polari (interagiscono meno con la fase stazionaria). Questo tipo di cromatografia è relativamente
poco utilizzato perché le fasi stazionarie polari danno interazioni forti e possono trattenere molto
alcuni analiti, determinando lunghi tempi di ritenzione o contaminazioni irreversibili.
- Cromatografia di ripartizione in fase inversa La fase stazionaria è meno polare della fase mobile (in
genere una miscela di acqua e solventi organici, es. metanolo o acetonitrile). Vengono eluiti per primi
i composti più polari. È la cromatografia più utilizzata per la separazione di composti organici.

Cromatografia di scambio ionico

La fase stazionaria è un solido (in genere un polimero organico, es. un copolimero stirene-divinilbenzene)
contenente siti attivi ionizzati di carica opposta rispetto a quella degli ioni dell'analita. La separazione è
basata sulla competizione fra gli ioni dell'analita e quelli della fase mobile (in genere un elettrolita
acquoso diluito) per il legame ai siti attivi della fase stazionaria. Le resine a scambio ionico vengono
classificate in resine scambiatrici forti e resine scambiatrici deboli. I due tipi di scambiatori hanno
differenti intervalli utili di pH: le resine scambiatrici forti sono sempre cariche, quindi utilizzabili in un
ampio intervallo di pH, mentre quelle deboli sono cariche solo in intervalli di pH ristretti. Ciò significa
che la capacità di legame di una resina scambiatrice debole può essere controllata variando il pH della
fase mobile. La cromatografia ionica è la tecnica di elezione per l'analisi di miscele di cationi e
(soprattutto) anioni, es. in campo ambientale. Per queste analisi viene normalmente utilizzato un
rivelatore universale a conducibilità, sensibile a qualunque specie carica. Le proteine possono essere
analizzate per cromatografia ionica operando ad un pH al quale esse si trovano in una forma carica.

Cromatografia di esclusione dimensionale

La fase stazionaria è un materiale poroso (es. un solido, un polimero o un gel) con pori compresi in un
intervallo di dimensioni paragonabile a quello delle molecole degli analiti da separare. La separazione si
basa sulle dimensioni delle molecole (le molecole in grado di entrare nei pori della fase stazionaria
vengono rallentate, quelle troppo grandi restano nella fase mobile e si muovono più velocemente). Per
questo tipo di cromatografia è fondamentale che non esistano interazioni specifiche (es. adsorbimento)
fra la fase stazionaria e gli analiti.
La cromatografia di gel permeazione viene utilizzata per la separazione di sostanze insolubili in acqua
(es. polimeri organici) e impiega come fase mobile un solvente organico.
La cromatografia di gel esclusione viene invece utilizzata per la separazione di sostanze solubili in
acqua (es. macromolecole biologiche quali proteine, peptidi ed acidi nucleici) in base al loro peso
molecolare ed usa come fase mobile soluzioni acquose (es. soluzioni elettrolitiche o tamponi).

Cromatografia di affinità

La fase stazionaria è un supporto solido sul quale sono immobilizzati ligandi (in genere di natura
biologica) specifici per gli analiti di interesse. L'interazione si basa sul riconoscimento ed il legame
dell'analita (o di una classe di analiti) mediante interazioni in genere forti e molto selettive. Per la elevata
selettività, queste tecniche possono essere anche considerate tecniche di estrazione (uno o pochi analiti
vengono trattenuti, il resto del campione viene eluito quasi immediatamente).
Il recupero degli analiti può essere difficile a causa della intensità delle interazioni di legame; pertanto,
spesso sono necessarie condizioni di eluizione abbastanza drastiche. Condizioni di eluizione molto
drastiche possono provocare alterazioni negli analiti.
- Eluizione specifica: Un competitore che forma con il ligando un legame più energico può essere
utilizzato per recuperare l'analita.
- Eluizione non specifica: Modificazioni dell'ambiente oppure denaturazione del ligando. Variazioni di
forza ionica. Variazioni di pH (modificano i siti di legame). Agenti denaturanti blandi o energici (es.
urea, cloridrato di guanidinio).

CROMATOGRAFIA PLANARE

La cromatografia planare è uno dei più semplici tipi di cromatografia liquida, spesso impiegata per avere
informazioni preliminari qualitative o semiquantitative sulla composizione di una miscela. La tecnica più
usata è la cromatografia su strato sottile (TLC), dove la fase stazionaria è uno strato sottile su un supporto
piano (es. vetro, alluminio, plastica). Il campione (1 – 2 µl) viene depositata vicino ad un bordo della
lastra con un capillare o una siringa. La lastra viene poi posta in una camera immergendole l'estremità
inferiore nella fase mobile, che per capillarità sale trascinando gli analiti e separandoli. Prima che il
solvente abbia raggiunto l'altra estremità, la lastra viene estratta e gli analiti separati visualizzati.

Fase stazionaria

Le fasi stazionarie più utilizzate sono silice o allumina (per cromatografia di adsorbimento) e cellulosa
(per cromatografia di ripartizione in fase diretta, in questo caso la vera fase stazionaria è l’acqua
adsorbita sulle particelle di cellulosa). Le fasi mobili sono in genere miscele di solventi organici
relativamente volatili (l'uso di miscele permette di adattare la polarità della fase mobile agli analiti da
separare).

Rivelazione

Se le sostanze separate non sono colorate la rivelazione si effettua spesso sfruttando il loro assorbimento
nell'UV. Illuminando con una radiazione UV (di solito si usa una lampada fluorescente con emissione a
254 o 366 nm) lastre TLC contenenti una specie fluorescente (di solito un fosforo inorganico) le specie
separate sono visibili come macchie scure in quanto assorbono la radiazione ultravioletta impedendo
l'eccitazione del fosforo contenuto nella lastra.
Per la rivelazione possono essere utilizzati anche reattivi cromogeni più o meno specifici, nebulizzati in
soluzione direttamente sulle lastre dopo evaporazione della fase mobile residua (in alternativa, la lastra
può essere semplicemente esposta ai loro vapori nel caso di reagenti volatili).
L'analisi qualitativa in TLC si basa sulla diversa velocità di migrazione degli analiti, descritta dal fattore
di ritenzione Rf.
Il fattore di ritenzione è compreso fra 0 (analiti completamente trattenuti) ed 1 (analiti non trattenuti,
che migrano con la fase mobile). Vengono considerati ottimali per la identificazione valori compresi fra
0,4 e 0,8. In generale, per garantire la correttezza della identificazione assieme ai campioni vengono fatti
sempre correre sulla lastra anche gli standard.

CROMATOGRAFIA SU COLONNA

La cromatografia su colonna con flusso di fase mobile per gravità viene in genere utilizzata per semplice
procedure di frazionamento o purificazione. Colonne per varie applicazioni possono essere preparate
partendo dalla fase stazionaria o acquistate già pronte all'uso.
Per separazione più lunghe e/o su scala maggiore si possono utilizzare sistemi che producono il flusso
della fase mobile usando pompe oppure pressurizzando la testa della colonna cromatografica. Un
raccoglitore automatico di frazioni permette di recuperare le varie frazioni eluite per analisi e/o recupero
dei composti separati.
STRUMENTAZIONE PER HPLC

La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) è la tecnica di cromatografia liquida strumentale più
utilizzata ed è caratterizzata da una elevata efficienza (le colonne per HPLC hanno tipicamente fino a
40000 - 60000 piatti teorici/m). Un sistema per HPLC impiega pompe per produrre il flusso di fase
mobile desiderato. Il campione da analizzare viene iniettato nella colonna con una valvola di iniezione;
quindi, i componenti separati vengono rivelati e quantificati da un rivelatore posto all'uscita della
colonna. Le analisi mediante HPLC vengono in prevalenza effettuate utilizzando cromatografia di
ripartizione.

Controllo dei tempi di ritenzione

La composizione della fase mobile è il fattore fondamentale che in HPLC determina i tempi di
ritenzione. A differenza della gascromatografia, in HPLC la temperatura ha un effetto minimo sui tempi
di ritenzione. Le colonne HPLC possono comunque essere termostatate per migliorare la riproducibilità
dell'analisi. Si definisce isocratica una separazione cromatografica condotta con una fase mobile a
composizione costante. In una eluizione in gradiente la composizione della fase mobile varia durante
l'analisi in modo da ottimizzare la separazione degli analiti.
Il gradiente di eluizione viene generato dal sistema cromatografico miscelando in varie proporzioni due o
più solventi. La miscelazione può essere effettuata usando pompe indipendenti per ogni solvente, nel qual
caso la composizione viene variata modificando la velocità delle pompe (miscelazione ad alta
pressione), o con una valvola a disproporzionamento a più vie che permette di prelevare alternativamente
i vari solventi (miscelazione a bassa pressione).

Sistema di degassamento della fase mobile

Poiché nelle miscele di acqua e solventi organici la solubilità dei gas atmosferici (es. ossigeno ed azoto) è
in genere minore rispetto a quella nei solventi separati, per evitare la formazione di bolle nel sistema o
nella colonna cromatografica si utilizzano sistemi di degassamento che eliminano i gas disciolti nella
fase mobile. Una procedura più semplice ma non altrettanto efficiente (l'operazione va ripetuta
periodicamente) è quella di degassare i solventi facendovi gorgogliare un gas a bassa solubilità (es. elio).

Iniezione del campione

Il campione da analizzare viene iniettato nello strumento in forma liquida, puro od in soluzione in un
adatto solvente, mediante specifiche valvole di iniezione. Il campione viene caricato nella valvola con
una microsiringa, ma il volume esatto trasferito in colonna è determinato dal volume del "loop" montato
sulla valvola. Il "loop" (una piccola sezione di tubazione a volume esattamente noto) stabilisce il volume
di campione effettivamente iniettato in colonna. Il volume trasferito con la siringa non è pertanto critico.
Per migliorare la riproducibilità ed automatizzare le procedure analitiche esistono anche sistemi di
campionamento automatico. La valvola di iniezione permette di effettuare manualmente l'iniezione del
campione senza interrompere il flusso della fase mobile e alterare gli equilibri instaurati all'interno della
colonna cromatografica (un inserimento diretto del campione in colonna non è possibile a causa della
elevata pressione presente nel sistema).

Colonne cromatografiche

Si utilizzano colonne impaccate con diametro interno di alcuni millimetri (tipicamente 2 - 5 mm) e
relativamente corte (lunghezza 10 - 30 cm). La fase stazionaria è sotto forma di particelle di piccolo
diametro (4 - 10 µm) in modo da garantire una elevata efficienza (una colonna per HPLC può avere da
qualche migliaio a 15000 - 20000 piatti teorici). La dimensione delle particelle di fase stazionaria è il
fattore principale che limita l'efficienza della colonna. Nelle più moderne tecniche cromatografiche
UPLC le particelle sono più piccole (2 µm o meno) e le colonne sono più corte ed efficienti, ma le
pressioni richieste per produrre il flusso di fase mobile sono molto maggiori.
Prima della colonna cromatografica vera e propria viene spesso installata una colonna di guardia molto
più corta, che ha la funzione di trattenere eventuali impurezze contenute nel campione ed in grado di
legarsi irreversibilmente alla fase stazionaria prima che giungano in colonna.

Rivelatori

Il rivelatore a indice di rifrazione misura le variazioni di indice di rifrazione della fase mobile dovute
alla presenza di analiti in soluzione. Poiché le variazioni di indice di rifrazione sono piccole e l'indice di
rifrazione di un solvente è influenzato anche da altri fattori (es. la temperatura) la cella di misura è
costruita in modo da determinare la differenza fra gli indici di rifrazione delle fasi mobili in ingresso nel
sistema ed in uscita dalla colonna cromatografica. Le tecniche spettrofotometriche sono fra le tecniche di
rivelazione più utilizzate in HPLC. I rivelatori spettrofotometrici sono simili agli spettrofotometri
convenzionali ma impiegano celle a flusso nelle quali passa la fase mobile in uscita dalla colonna, dotate
di finestre di quarzo per effettuare misure anche nel campo dell'UV a partire da 180 – 200 nm.

Il rivelatore a fluorescenza è fondamentalmente uno spettrofluorimetro equipaggiato con una cella a

flusso appositamente disegnata per permettere una misura di fluorescenza. È un rivelatore molto
sensibile, ma risponde soltanto ai pochi analiti fluorescenti. Per aumentarne l’applicabilità si possono
legare covalentemente dei marker fluorescenti. Questa derivatizzazione può essere fatta o prima della
separazione o post-colonna aggiungendo i reattivi marcanti tra la colonna e il rivelatore.

Il rivelatore a conducibilità viene utilizzato per rivelare specie cariche (es. in cromatografia ionica).
Registra qualsiasi specie ionica ma la risposta ad un dato analita dipende dalle sue caratteristiche
chimico-fisiche (es. carica, mobilità in soluzione e grado di dissociazione nel caso lo ione misurato derivi
da un elettrolita debole). La termocoppia permette di correggere la conducibilità tenendo conto delle
variazioni della temperatura della fase mobile.

Come per la gascromatografia, anche in HPLC la rivelazione mediante spettrometria di massa è

sempre più utilizzata come alternativa alle altre tecniche di rivelazione. L'accoppiamento delle tecniche
di rivelazione mediante spettrometria di massa con cromatografia liquida è relativamente recente. Gli
ostacoli fondamentali da superare sono la necessità di portare allo stato gassoso e ionizzato gli analiti in
soluzione e la eliminazione del solvente, che costituisce la frazione maggiore dell'eluato uscente dalla
colonna. Un problema ulteriore è rappresentato dalla possibile presenza nell'eluato di quantità
significative di sostanze non volatili (es. elettroliti). Per tale motivo si devono utilizzare tamponi basati su
sostanze volatili, es. sali di ammonio.

Capitolo 8: Gascromatografia

In gascromatografia un analita gassoso viene trasportato attraverso la colonna da una fase mobile gassosa
detta gas di trasporto. Il campione (un gas o un liquido volatile, viene iniettato attraverso un setto in un
iniettore riscaldato, nel quale evapora rapidamente. Il vapore fluisce attraverso la colonna miscelato al
gas di trasporto (He, N2 , H2 ) e gli analiti separati giungono ad un rivelatore la cui risposta è visualizzata
tramite pc. La colonna deve essere abbastanza calda in modo che gli analiti abbiano una pressione di
vapore sufficiente a consentire l’eluizione in un tempo ragionevole.
La tecniche di analisi gascromatografiche sono impiegate per l'analisi di miscele di composti gassosi o
comunque sufficientemente volatili e termostabili da potere essere portati allo stato gassoso per
riscaldamento. Sono classificate in base alle caratteristiche della fase stazionaria e ai processi
responsabili della ritenzione degli analiti: Adsorbimento e Ripartizione Nel caso della gascromatografia
tutte le tecniche sono in colonna.

Gascromatografia di adsorbimento (gascromatografia gas-solido)

La fase stazionaria è un materiale poroso (es. carbone, setacci molecolari sintetici) con elevata area
superficiale specifica (fino a 1000 m2 /g) e con pori di dimensioni simili (tipicamente 3 - 10 Å) alle
molecole degli analiti. La separazione si basa sull'adsorbimento degli analiti sui siti attivi della fase
stazionaria, in grado di legarli mediante vari tipi di interazioni (es. forze di van der Waals o legami a
idrogeno), ma anche sulla capacità dell'analita di entrare nei pori del materiale adsorbente, dipendente
dalle sue dimensioni molecolari. Il meccanismo di ritenzione è quindi misto, in quanto legato sia a
processi di adsorbimento che alle dimensioni molecolari (per gli analiti in grado di entrare nei pori
l'area apparente del materiale adsorbente è maggiore).
La gascromatografia di adsorbimento viene in genere utilizzata per gas permanenti, ovvero composti
allo stato gassoso in condizioni normali (es. CO2, CO, NOx, SOx ma anche composti organici a basso
peso molecolare, es. metano, etano, etilene). Queste caratteristiche la rendono importante in applicazioni
specifiche quali l'analisi degli inquinanti atmosferici. Per questo tipo di applicazioni si impiegano spesso
rivelatori a conducibilità termica, sensibili a qualsiasi tipo di gas, sia inorganico che organico.

Gascromatografia di ripartizione (gascromatografia gas-liquido)

La fase stazionaria è costituita da liquidi (su supporti solidi porosi) o polimeri che agiscono da solventi
nei confronti degli analiti. La separazione si basa sul processo di ripartizione degli analiti fra la fase
mobile gassosa e la fase stazionaria. Il criterio di selezione della fase stazionaria in gascromatografia gas-
liquido è basato sulla polarità; pertanto, viene utilizzata una fase stazionaria con polarità simile a quella
degli analiti da separare.
Un problema generale della gascromatografia di ripartizione è la perdita di fase stazionaria a causa
della sua lenta evaporazione (le separazioni avvengono sempre ad elevata temperatura). Per ridurre
questo fenomeno la fase stazionaria viene legata in modo stabile (fasi stazionarie legate) fissandola
chimicamente su un supporto solido o polimerizzandola attraverso la formazione di legami covalenti
intermolecolari. Il problema della evaporazione della fase stazionaria non si presenta se si usano polimeri
ad elevato peso molecolare e quindi poco volatili.
Le fasi stazionarie attualmente più usate in gascromatografia gas-liquido sono i polisilossani, polimeri
siliconici disponibili in un ampio intervallo di polarità (la polarità del polimero varia secondo natura e/o
proporzioni dei gruppi nelle catene laterali).
La gascromatografia gas-liquido viene utilizzata per l'analisi di miscele di composti organici volatili e
sufficientemente termostabili da potere essere portati allo stato gassoso per riscaldamento. Composti
poco volatili a causa di forti legami intermolecolari (es. alcoli ed acidi organici, che danno legami ad
idrogeno) possono essere comunque analizzati per gascromatografia dopo derivatizzazione chimica per
ridurne il punto di ebollizione.

STRUMENTAZIONE PER GASCROMATOGRAFIA

Nelle tecniche di analisi gascromatografiche il campione viene inserito in una camera di iniezione e
trascinato dalla fase mobile gassosa nella colonna gascromatografica termostatata dove i componenti si
separano in funzione della loro affinità con la fase stazionaria. I componenti separati vengono infine
rivelati e quantificati da un rivelatore all'uscita della colonna.

Gas di trasporto

A differenza della maggior parte delle tecniche cromatografiche, in gascromatografia la fase mobile non
interagisce con gli analiti e/o con la fase stazionaria, ma ha solo il compito di trasportarli lungo la
colonna. Come fase mobile vengono utilizzati gas nobili (elio, argon) che garantiscono una completa
inerzia chimica nei confronti degli analiti e della fase stazionaria, idrogeno, azoto oppure aria.

Iniezione del campione

Per l'iniezione del campione si utilizzano microsiringhe di volume variabile. In generale, l'iniezione
manuale con microsiringhe permette una riproducibilità solo discreta e pertanto per analisi quantitative
accurate si utilizza spesso uno standard interno.
Per campioni liquidi l'iniezione viene effettuata in una camera di iniezione riscaldata dove scorre il gas
di trasporto. La funzione della camera di iniezione è quella di vaporizzare istantaneamente gli analiti (ed
eventualmente il solvente) in modo che entrino nella colonna in fase gassosa. Per questo motivo la
camera è mantenuta ad una temperatura nettamente superiore - almeno 50°C - a quella di ebollizione
degli analiti.

Colonne cromatografiche

Le colonne tubolari aperte sono più sottili (diametro interno dell'ordine del millimetro) e lunghe (fino a
20 - 50 metri) ed hanno efficienze elevate ma minore capacità (contengono meno fase stazionaria). La
fase stazionaria è disposta sulle pareti interne della colonna e sono disponibili in diverse tipologie, sia per
gascromatografia gas-liquido che gas-solido.
Le colonne tubolari aperte a silice fusa (o colonne capillari) sono estremamente sottili (diametro
interno 100 - 250 µm) e lunghe (fino a 100 metri) ed hanno efficienze molto elevate. Queste colonne
sono utilizzate soltanto in gascromatografia gas-liquido ed hanno una fase stazionaria che riveste le pareti
interne della colonna sotto forma di film sottile (spessore 0,2 - 1 µm)

A temperature operative elevate, la fase stazionaria si decompone e rilascia i prodotti di decomposizione.

Questi prodotti generano: un elevato segnale di fondo, riducono il rapporto segnale/rumore per gli analiti
e contaminano il rivelatore.
Per ridurre tali interferenze è bene utilizzare: uno strato più sottile di fase stazionaria; una colonna più
stretta; gas di trasporto ad elevata purezza (in particolare, dal momento che la principale fonte di rilascio
è l’ossidazione di fase stazionaria da parte di O2 i gas di trasporto devono passare prima di giungere in
colonna attraverso una trappola che rimuove O2).

Controllo dei tempi di ritenzione

In aggiunta alle caratteristiche della colonna, la temperatura è il parametro principale che determina
l’andamento della separazione degli analiti (temperature maggiori riducono i tempi di ritenzione). Nelle
separazioni a temperatura costante la temperatura è mantenuta ad un valore intermedio entro l'intervallo
di temperature di ebollizione degli analiti nel campione. Per campioni con analiti in un ampio intervallo
di temperature di ebollizione potrebbe non esistere una temperatura che permette una separazione
ottimale. Si effettuano allora eluizioni con programmazione della temperatura, nelle quali la temperatura
viene variata in modo che ogni analita venga eluito nelle condizioni più adatte.

Rivelatori

Il rivelatore deve fornire un segnale proporzionale alla concentrazione dell'analita in uscita dalla colonna.
Il rivelatore ideale dovrebbe avere caratteristiche quali sensibilità, stabilità e riproducibilità, ampia
risposta lineare con la concentrazione di analita, risposta indipendente dalla natura dell'analita, ecc.
- Il rivelatore a conducibilità termica misura le variazioni nella conducibilità termica della fase
mobile in uscita dalla colonna gascromatografica usando un filamento conduttore riscaldato (quando
il gas di trasporto contiene un analita, la minore conducibilità termica causa una variazione della
temperatura del filamento). Poiché la conducibilità termica di un gas è inversamente proporzionale al
suo peso molecolare, la massima sensibilità si ottiene usando gas di trasporto ad elevata conducibilità
termica, es. elio. Il rivelatore è sensibile a qualunque sostanza con peso molecolare differente dal gas
di trasporto, è semplice e possiede un ampio intervallo dinamico. La sua limitazione principale è la
bassa sensibilità, che lo rende inadatto all'uso con colonne a bassa capacità (es. le colonne capillari).
- Il rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID) è probabilmente il rivelatore più utilizzato in
gascromatografia. In questo rivelatore la fase mobile in uscita dalla colonna viene bruciata in una
fiamma aria/idrogeno e si rilevano gli ioni prodotti dalla combustione dei composti organici (in
pratica si determina l'incremento nella conducibilità elettrica della fiamma applicando una differenza
di potenziale fra il bruciatore ed un elettrodo collettore sopra di essa e misurando la corrente
risultante). La rivelazione di un analita dipende dalla sua combustione, quindi il rivelatore è sensibile
alla maggior parte dei composti organici, es. idrocarburi saturi, idrocarburi aromatici, composti
organici con eteroatomi (es. alcoli e chetoni). Non rivela i composti organici non combustibili, quali
quelli ad elevato grado di ossidazione (es. acidi organici a basso peso molecolare) o altamente
alogenati.

- Il rivelatore a cattura di elettroni è importante in alcuni ambiti (es. analisi ambientale) in quanto è
selettivo per composti contenenti alogeni (es. pesticidi, solventi alogenati). Contiene un elettrodo
rivestito da un emettitore β (63Ni), che ionizza il gas di trasporto (in genere azoto). Gli ioni prodotti
(cationi N2 + ed elettroni liberi) generano una corrente elettrica fra questo elettrodo ed un secondo
elettrodo di raccolta. Se il gas di trasporto contiene analiti con atomi elettronegativi, essi catturano
parte degli elettroni portando ad una riduzione della corrente misurata. La rivelazione è legata alla
elettronegatività degli analiti. Il rivelatore è pertanto sensibile ai composti organici alogenati (es. la
maggior parte dei pesticidi, diossine, PCB) ed anche a composti altri gruppi elettronegativi (es.
nitrogruppi o gruppi cianuro).

La rivelazione mediante spettrometria di massa è particolarmente importante perché mediante la misura

della massa delle molecole di analita (o meglio del rapporto massa/carica dei loro ioni) e/o del loro
spettro di frammentazione permette sia analisi quantitativa che identificazione degli analiti.
Poiché gli analiti separati sono già in forma gassosa (quella richiesta dallo spettrometro di massa), questo
tipo di rivelazione si presta molto bene all'accoppiamento con la gascromatografia. La spettrometria di
massa è una tecnica di rivelazione quasi ideale: è sensibile, ha un ampio intervallo di linearità e permette
di determinare qualsiasi analita (l'unica condizione è che sia ionizzabile). Inoltre, a differenza della
maggior parte delle tecniche di rivelazione, ne permette anche l'identificazione.

Capitolo 9: Spettrometria di Massa

ANALISI MEDIANTE SPETTROMETRIA DI MASSA

Le tecniche di spettrometria di massa sono tecniche di analisi basate sulla misura della massa delle
molecole dell'analita, o meglio del rapporto massa/carica (m/z) degli ioni prodotti dell'analita. La loro
importanza è dovuta al fatto che esse permettono sia l’identificazione (analisi qualitativa) che la
quantificazione (analisi quantitativa) delle specie di interesse.
Analisi qualitativa:
- Lo spettro di massa derivante dalla frammentazione di una molecola è in genere caratteristico di
una specie e permette la sua identificazione.
- La massa esatta (valore di m/z accurato alla terza o quarta cifra decimale) ottenuta con uno
spettrometro di massa ad alta risoluzione permette di stabilire la formula bruta di un analita.
Analisi quantitativa:
- La quantità di ioni ottenuta in condizioni controllate è proporzionale alla concentrazione dell'analita
in esame (è comunque indispensabile passare attraverso una curva di calibrazione).
Molto spesso le tecniche di spettrometria di massa vengono usate in combinazione con tecniche
separative (GC, HPLC). La rivelazione in spettrometria di massa presenta significativi vantaggi rispetto
ad altre tecniche di rivelazione più convenzionali.
- Applicabilità a qualsiasi tipo di analita L'unica caratteristica che un analita deve possedere per
essere determinato mediante spettrometria di massa è la possibilità di essere ottenuto in forma
ionizzata.
- Applicabilità a tutte le tecniche cromatografiche (GC, HPLC, ecc.)
- Alta sensibilità.
- Alta selettività. La spettrometria di massa permette l'identificazione degli analiti (es. mediante massa
esatta o spettro di frammentazione), pertanto è possibile identificare e quantificare anche analiti
coeluiti (cioè non separati dal sistema cromatografico).

Uno spettrometro di massa misura le masse reali delle molecole, non quelle calcolabili dalla tavola
periodica. Per ogni specie chimica si ottiene una serie di masse differenti, generate dalle combinazioni
degli isotopi stabili degli elementi nella molecola.

MASSE E SPETTRI DI MASSA

Le tecniche di spettrometria di massa agiscono su specie ioniche e misurano il rapporto massa/carica

(m/z) dello ione. Una specie in grado di produrre più ioni con carica differente darà quindi origine a più
segnali a differenti valori m/z nel suo spettro di massa (questo non è in genere un problema per piccole
molecole, che formano solo ioni a carica singola). Lo spettro di massa di una sostanza rappresenta i
valori m/z degli ioni che si ottengono da quella sostanza e le loro abbondanze relative. È assimilabile ad
una carta di identità della sostanza e contiene una serie di informazioni utili alla sua identificazione.
Siccome viene misurato il rapporto massa/carica, nel caso di ioni multicarica i valori ottenuti non
coincideranno con la massa reale dell'analita (se da una stessa specie si ottengono ioni differenti, si
avranno inoltre differenti valori di m/z). Spesso il valore di m/z di uno ione non è sufficiente per una
identificazione definitiva (altre specie nel campione possono avere valori simili di m/z, o anche identici
nel caso di sostanze con la stessa formula molecolare). In tal caso si misura lo spettro di
frammentazione della specie in esame, ottenuto fornendo energia allo ione in modo da indurre la sua
frammentazione in ioni di minori dimensioni. Poiché gli ioni frammento ottenuti dipendono dalla
struttura della molecola, essi sono caratteristici di ogni specie e ne permettono la identificazione.

SPETTRI DI MASSA

La spettrometria di massa permette di studiare le masse di atomi o di molecole o di frammenti di

molecole. Le tre componenti essenziali di uno spettrometro di massa sono:
1. Sorgente di ioni: le molecole neutre possono essere convertite in ioni attraverso due processi: -
Ionizzazione elettronica: produce lo ione molecolare (M°+) e molti altri frammenti - Ionizzazione
chimica: produce MH+ e pochi altri frammenti
2. Separatore di massa: gli ioni sono accelerati da un campo elettrico e quindi separati in base al loro
rapporto massa/carica
3. Rivelatore: quando gli ioni arrivano al rivelatore, ogni ione dà luogo ad una cascata di elettroni che
raggiungono l’anodo dove viene misurata la corrente.

Ionizzazione elettronica
- Gli elettroni emessi da un filamento caldo vengono accelerati attraverso un potenziale di 70 V prima
che interagiscano con le molecole in arrivo. Alcune molecole M (0.01%) assorbono circa 12-15
elettronvolt, energia sufficiente a provocarne la ionizzazione.
- Il risultante ione molecolare, M+• , possiede solitamente abbastanza energia interna da scindersi in
frammenti.
- M+• e i suoi ioni frammenti sono accelerati verso l’analizzatore di massa.
- La quantità dello ione molecolare è così piccolo che il picco nello spettro sarà molto piccolo o
addirittura assente.

Ionizzazione chimica

- Produce una frammentazione minore rispetto alla ionizzazione elettronica.

- La sorgente di ionizzazione è riempita con un gas reagente come metano, isobutano, ammoniaca alla
pressione di 1 mbar.
- Gli elettroni ad alta energia (100–200 eV) convertono CH4 in una varietà di specie reattive:
CH4 + e- → CH4 +• + 2e-
CH4 +• + CH4 → CH5 + + •CH3
CH4 +• →CH3 + + H•
CH3 + + CH4 → C2H5 + + H2
- CH5 + reagisce con l’’analita M per formare MH+ , lo ione più abbondante nello spettro di
ionizzazione chimica.
M + CH5 + → MH+ + CH4

SPETTROMETRIA DI MASSA

Uno spettro di massa mostra tutti gli ioni rivelati, ognuno dei quali è caratterizzato da un determinato
rapporto massa su carica, m/z. Lo ione molecolare, M+•, ci dà informazioni sulla massa molecolare di un
analita incognito. Per ricavare la massa molecolare possiamo ottenere uno spettro di massa a ionizzazione
chimica che è solitamente caratterizzato da un intenso picco attribuibile a MH +. Quando la ionizzazione
elettronica non porta alla formazione dello ione molecolare, i frammenti ottenuti possono fornire indizi
sulla struttura di un analita incognito.
Uno spettrometro di massa consiste di tre componenti fondamentali.
- Sorgente. Ha la funzione di convertire l'analita in una forma ionizzata ed in fase gassosa; quindi,
adatta per essere analizzata dallo spettrometro di massa.
- Analizzatore. Seleziona gli ioni in funzione del loro valore del rapporto m/z e li invia al rivelatore.
- Rivelatore. Produce un segnale proporzionale agli ioni che vengono convogliati su di esso.
- Comparto in alto vuoto. Il moto libero degli ioni, e quindi il funzionamento dello strumento,
richiedono che l'ambiente operativo sia in alto vuoto.

STRUMENTAZIONE

Sorgente di ionizzazione

Ha il compito di trasformare gli analiti in specie ionizzate in fase gassosa (Sorgente a plasma ad
accoppiamento induttivo; Sorgente ad impatto elettronico; Sorgente elettrospray; Sorgente a
desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice). Nello sviluppo di una sorgente di ionizzazione si
devono affrontare vari tipi di problemi:
- Trasferimento in fase gassosa (il processo può degradare gli analiti).
- Eliminazione del solvente (per analiti in soluzione).
- Produzione degli ioni (la ionizzazione implica spesso processi ad alta energia, quindi può degradare
gli analiti).
- Interfacciamento con lo spettrometro di massa (operante in alto vuoto) con la sorgente di
ionizzazione.
La sorgente di ionizzazione opera spesso a pressione atmosferica, quindi è necessario evitare l'ingresso di
quantità significative di gas (e di vapori del solvente nel caso di campioni in soluzione) nello
spettrometro di massa.

Sorgente a plasma ad accoppiamento induttivo (ICP)

La soluzione contenente il campione viene nebulizzata in un gas inerte (argon) riscaldato a 5000 -
10000°C da un generatore a radiofrequenza (a queste temperature il gas è in gran parte ionizzato e forma
un plasma). Le altissime temperature causano la decomposizione di quasi tutte le specie molecolari
(eccetto le più stabili) e la ionizzazione degli atomi prodotti.

Sorgente ad impatto elettronico (EI)

Impiega una camera di ionizzazione dove il campione viene inserito in fase gassosa e ionizzato mediante
un fascio di elettroni accelerati ad energie di 50 -100 eV. Gli elettroni collidono con le molecole
dell'analita e ne strappano un elettrone formando ioni positivi che spesso (per instabilità intrinseca o a
causa dell'energia ceduta dalla collisione) subiscono una ulteriore frammentazione (l'entità della
frammentazione aumenta con l'energia degli elettroni incidenti).

Sorgente elettrospray (ESI)

La soluzione contenente gli analiti viene nebulizzata attraverso un ago mantenuto ad un potenziale di
2000 - 4000 V (il segno dipende dalla carica degli ioni che si desidera ottenere) producendo un aerosol
carico elettricamente. Le goccioline di aerosol poi evaporano in un flusso di gas inerte caldo (200 -
300°C) rilasciando in fase gassosa gli analiti ionizzati, poiché la carica delle gocce si trasferisce alle
molecole di analita (nel caso di peptidi e proteine si ottengono sempre ioni multicarica). Questo è una
sorgente di ionizzazione "soft", poiché non avvengono processi ad alta energia che possono causare la
frammentazione delle molecole degli analiti.

Sorgente a desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI)

Il campione, depositato allo stato solido in miscela con una matrice (un composto organico a carattere
acido con un forte assorbimento nell'UV, es. acido picolinico, acido caffeico, acido sinapico), viene
irradiato con un laser ad alta energia. La matrice assorbe l'energia del laser e vaporizza trascinando con sé
l'analita, che viene rilasciato allo stato gassoso in forma ionizzata, in genere come ione a carica singola.
Questa sorgente è indicata per composti termolabili ad alto peso molecolare (es. proteine, peptidi e
zuccheri) che si degraderebbero con le tecniche di ionizzazione convenzionali (a differenza della sorgente
ESI, proteine e peptidi non danno ioni multicarica).

Analizzatore

L’analizzatore seleziona gli ioni in base al loro rapporto m/z. Negli spettrometri di massa sono impiegati
diversi tipi di analizzatore, che operano in base a principi fisici differenti:
- Analizzatori a deflessione. Si basano sulla deflessione della traiettoria degli ioni sotto l'azione di
campi elettrici e/o magnetici.
- Analizzatori a risonanza. Impiegano processi di risonanza fra le traiettorie degli ioni ecampi
elettromagnetici oscillanti
- Analizzatori a tempo di volo. Misurano il tempo impiegato dagli ioni per percorrere il tragitto dalla
sorgente al rivelatore.
Le prestazioni di un analizzatore sono descritte dal massimo valore di m/z raggiungibile (che determina -
in prima approssimazione – la massima massa misurabile di uno ione) e dalla risoluzione (che determina
l'accuratezza delle masse misurate). Nella spettrometria di massa la risoluzione viene calcolata come:

Nella formula m è il valore di m/z del picco nello spettro di massa e Δm è l'ampiezza del picco misurata a
metà altezza. La risoluzione di uno spettrometro di massa è un parametro fondamentale quando è
necessario distinguere ioni con valori di m/z simili.

Analizzatore a settore magnetico (presente nei primi spettrometri di massa)

Sfrutta l'effetto di un campo magnetico (generato da un magnete permanente o da un elettromagnete) sul
moto degli ioni. Poiché l'entità della deviazione dipende dall'energia dello ione, dal campo magnetico e
dal rapporto m/z dello ione, agendo sull'energia e/o sull'intensità del campo magnetico è possibile
selezionare solo gli ioni con un determinato rapporto m/z.

Analizzatore a quadrupolo (arriva fino m/z=2000 – 3000, ha risoluzione relativamente bassa)

Agisce come un filtro selettivo di massa e lascia passare soltanto ioni con un determinato valore di m/z.
Agendo sui potenziali applicati, un quadrupolo può operare come un filtro di massa fisso impostato a un
dato valore di m/z o effettuare una scansione per osservare in sequenza ioni con differenti valori di m/z.

Analizzatore a trappola ionica (simile a quadruplo ma arriva fino a m/z= 20000)

Gli ioni (prodotti da un sistema di ionizzazione esterno o direttamente all'interno della trappola) vengono
intrappolati all'interno di una camera delimitata da elettrodi ai quali viene applicato un potenziale
oscillante. Variando la frequenza del potenziale applicato gli ioni vengono espulsi in ordine di valore di
m/z e misurati da un rivelatore posto immediatamente all'esterno della trappola.

Analizzatore a trappola a orbita (Orbitrap®) (elevate prestazioni)

Sfrutta il confinamento degli ioni in una camera delimitata da elettrodi opportunamente sagomati grazie
all'applicazione di un campo elettrico. Il moto degli ioni nella camera genera negli elettrodi correnti
oscillanti che vengono analizzate per determinare quantità e massa degli ioni intrappolati (la frequenza di
ogni componente delle correnti dipende dal valore di m/z dello ione, mentre l'intensità è proporzionale al
numero degli ioni).

Analizzatore a tempo di volo (alta risoluzione e determinano masse molto elevate)

Misura il tempo necessario ad uno ione per percorrere il tragitto dalla sorgente al rivelatore (per ioni della
stessa energia, il tempo è inversamente proporzionale al valore di m/z). Nella configurazione "reflectron"
uno specchio elettrostatico riflette gli ioni e migliora la risoluzione compensando le piccole differenze
nell'energia fornita dall'acceleratore.

Rivelatore

I rivelatori utilizzati comunemente in spettrometria di massa hanno un funzionamento analogo a quello

dei tubi fotomoltiplicatori (convertono ogni ione incidente in un elevato numero di elettroni attraverso
un processo di amplificazione, generando così una corrente facilmente misurabile anche per un piccolo
quantitativo di ioni).
 La capacità di identificare gli
analiti degli strumenti a triplo
quadrupolo si basa sulla
frammentazione controllata di
ioni selezionati fra quelli prodotti
dalla sorgente. Ciò avviene in una
cella di collisione, un quadrupolo
modificato dove gli ioni accelerati
da una differenza di potenziale
vengono fatti collidere con un gas
inerte (es. azoto, argon)
causandone la frammentazione.

La frammentazione controllata di ioni selezionati permette varie modalità di analisi degli ioni prodotti
dalla sorgente. Una delle più usate è la modalità Multiple Reaction Monitoring (MRM) nella quale gli
ioni dell'analita vengono selezionati dal primo analizzatore, frammentati nella cella di collisione ed il
secondo analizzatore viene usato per ricercare due o più ioni frammento caratteristici. Questa procedura
garantisce elevata selettività (l'individuazione dell'analita avviene in due stadi separati) e bassi limiti di
rivelazione, anche in matrici complesse. L'analisi dei prodotti di frammentazione permette anche
l'identificazione dei peptidi, es. prodotti dalla digestione di una proteina (la frammentazione avviene con
modalità note e l'analisi complessiva degli ioni frammento con software dedicati permette di ricostruire la
sequenza amminoacidica).