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Un gene è un segmento di DNA la cui successione di basi azotate dei nucleotidi costituisce
l’informazione genetica attraverso la quale si sintetizzano macromolecole proteiche caratterizzate
da specifiche funzioni (enzimatica, strutturale, immunitaria ecc.). Ad ogni gene è associata una ed
una sola proteina prodotta attraverso il meccanismo della sintesi proteica (dogma centrale della
biologia). La successione dei geni adiacenti, distribuiti nei cromosomi, costituisce il genoma.
Come già introdotto, è possibile inserire all’interno del genoma di un individuo un gene
proveniente dal codice genetico di un individuo appartenente ad un qualunque clade evolutivo,
secondo la tecnologia del DNA ricombinante: volendo schematizzare tale processo, si può
affermare che esso è composto da due momenti:
1. Estrazione ed isolamento del materiale genetico di interesse;
2. Integrazione di questo nel DNA della cellula ospite.
Nell’ambito della biologia molecolare, il metodo più rilevante per l’isolamento dei geni è quello
che impiega gli enzimi di restrizione, di seguito illustrato.
Si inizia con la lisi delle membrane cellulari e nucleari affinché si verifichi la liberazione del DNA, il
quale deve essere separato dagli altri componenti cellulari mediante centrifugazione. Sul
filamento nucleotidico si fanno agire quindi gli enzimi di restrizione: essi sono descritti come
“forbici molecolari” poiché operano dei tagli lungo la catena in modo da isolare determinati
segmenti. Non si pensi però che la loro azione sia svolta in maniera aleatoria, giacchè essi tagliano
la macromolecola in corrispondenza di precise sequenze palindromiche, brevi tratti che
presentano gli stessi nucleotidi se letti nella stessa direzione su entrambe le eliche (ad esempio,
entrambi nel verso 5’--> 3’). Le estremità scaturite a seguito del taglio possono essere di due tipi:
quando l’enzima rompe i due filamenti alla stessa altezza si parla di estremità piatte (bunt ends),
mentre, quando essi vengono tagliati in modo sfalsato, si parla di estremità coesive (sticky ends):
queste ultime risultano complementari con le estremità di altri filamenti prodotti dallo stesso
enzima.
Il gene così estratto, detto inserto, deve ora accedere al genoma della cellula ospite, quindi è
necessario che venga veicolato da un vettore, una molecola di DNA recante le seguenti
caratteristiche che compongono il packaging di espressione:
-sequenze bersaglio palindromiche per uno o più enzimi di restrizione (sito multiplo di clonaggio
polylinker);
-un sito di origine della duplicazione, affinchè si affranchi dalla duplicazione del genoma ospite;
-un gene marcatore per distinguere le cellule manipolate da quelle non integrate;
-dimensioni ridotte (5000bp);
-un ulteriore marcatore detto gene reporter, il quale permette la sintesi di proteine facilmente
rilevabili (enzimi in grado di modificare il substrato di un terreno differenziale);
Due modelli che ben si addicono alle suddette caratteristiche sono il plasmide e il virus, quindi, a
seconda delle esigenze, sono quelli maggiormente adoperati.
Per permettere l’integrazione dell’inserto nel plasmide, è necessario che questo sia digerito,
ovvero tagliato con lo stesso enzima di restrizione usato per estrarre il gene, per garantire la
complementarietà tra le estremità delle due entità genetiche; questo fenomeno di ligazione è
catalizzato dall’enzima DNA ligasi, il quale unisce, con legame fosfodiesterico, i suddetti filamenti.
La reazione in vitro è favorita da un eccesso di DNA inserto. Infine, il trasferimento del plasmide-
vettore nella cellula ospite è realizzato attraverso il fenomeno della trasformazione, uno tra i
processi di trasferimento di geni presso i batteri, secondo il quale le cellule ospiti sono in grado di
acquisire il materiale genetico proveniente da cellule lisate situate nelle vicinanze; la capacità
delle cellule ospiti di poter subire la trasformazione è detta competenza e, nel caso in cui le cellule
non siano naturalmente competenti o si voglia incrementare l’efficacia di trasformazione, è
possibile mettere in atto artifizi tecnici quali l’elettroporazione o l’impiego di ghiaccio e soluzioni
fredde di ioni Ca2+.
Nel caso del modello del virus, essendo esso un parassita endocellulare obbligato, può introdurre
il proprio bagaglio genetico nella cellula bersaglio da infettare. I principali virus dimostratisi validi
a tale scopo sono i retrovirus e gli herpesvirus, ovviamente privati del loro potere patogeno
attraverso la rimozione di sequenze genetiche volte a sintetizzare le proteine responsabili,
appunto, dell’essenza patogena.
Oltre al metodo degli enzimi di restrizione, è possibile ottenere un gene attraverso processi di
sintesi chimica: le tecniche di sintesi di oligonucleotidi si basano sulle sperimentazioni condotte
negli anni ’50-’60 del secolo XX dagli scienziati Khorana, Letsinger e Merrifield (quest’ultimo in
maniera indiretta, poiché si concentrò sulla sintesi di peptidi). Due sono i concetti fondamentali
alla base di queste rivoluzionarie tecniche: la protezione/deprotezione dei gruppi funzionali
affinché di volta in volta reagiscano solo quelli desiderati (Khorana-Letsinger) e l’impiego di un
supporto solido insolubile al quale ancorare la prima unità della biomacromolecola (Merrifield-
Letsinger).
Si consideri un generico nucleotide di DNA: esso è formato da un gruppo fosfato legato all’atomo
di carbonio in posizione 3’ o 5’ di una molecola di deossiribosio, la quale lega una base azotata al
carbonio anomerico C-1. I gruppi funzionali liberi sono i seguenti:
-l’ossigeno recante carica negativa legato al fosforo;
-l’ossidrile coinvolto nel legame fosfodiesterico;
-il gruppo amminico esociclico sulla base azotata (eccezion fatta per la timina);
Le molecole impiegate per la protezione/deprotezione dei suddetti gruppi sono distinte in due
categorie: gruppi protettori semipermanenti, rimovibili solo al termine dell’assemblaggio della
catena, e gruppi protettori temporanei, rimovibili al termine di ogni ciclo accoppiamento, ossia
prima dell’addizione del nucleotide successivo. Alla prima categoria appartengono i gruppi relativi
alla protezione del gruppo amminico esociclico (benzoile per A e C, isobutirrile per G) e quelli
relativi alla protezione del gruppo fosfato (β-cianoetile N≡C-CH2-CH2-); al secondo gruppo
appartiene il 4,4’-dimetossi trifenilmetile, o dimetossi tritile DMT), il quale protegge l'ossidrile sul
C-5 del nucleotide da assemblare, rimovibile per lavaggio con acido tricloroacetico in condizioni
blande. Per quanto riguarda il supporto insolubile, numerosi materiali sono stati sperimentati,
poiché tutti manifestavano il problema dello swelling, ossia l’effetto di rigonfiamento a seguito
dell’interazione con solventi organici; oggi si impiegano vetri modificati a pori controllati, i quali
non sono soggetti a tale fenomeno.
Il processo di sintesi esordisce con l’attacco dell’estremità 3’ di un nucleoside (quindi in assenza
del gruppo fosfato) al supporto solido attraverso un raccordo, il quale forma un legame estereo
con l’ossidrile sul C-3; consequenzialmente, l’estremità 5’ resta protetta dal DMT.
Successivamente si esegue il lavaggio con acido tricloroacetico per la deprotonazione dell’ossidrile
in 5’ e si prepara così l’attacco del gruppo fosfato del nucleotide successivo: tale reazione avviene
in presenza dell’agente condensante dicicloesil carbodiammide (DCC). A questo punto,
deproteggendo l’ossidrile sull’estremità 3’ di questo secondo nucleotide, si può proseguire
l’allungamento della catena ripetendo i passaggi appena illustrati.
L’uomo ha quindi a propria disposizione mirabili prodigi tecnici e biotecnologici attraverso i quali
diventa possibile curare alcune tra le più infauste malattie che lo affliggono: la nuova frontiera
della terapia genica permette sempre più che non si faccia ricorso ad antibiotici, chemioterapici,
medicinali varî, terapie radiologiche, trasfusioni e trapianti eterologhi, poiché agisce direttamente
alla fonte del male, ovvero laddove vi siano alterazioni del DNA (geniche, cromosomiche o
genomiche) determinanti tumori o malattie genetiche.
Nella vasta rosa di questi eventi morbosi, la drepanocitosi o anemia falciforme è oggetto di studi e
sperimentazioni in questo ambito. Si tratta di una malattia genetica ereditaria autosomica
recessiva causata da una mutazione puntiforme del gene responsabile della sintesi della catena β
dell’emoglobina, situato sul braccio p del cromosoma 11. A causa della sostituzione di una base
azotata si manifesta una mutazione missenso, giacché in luogo dell’acido glutammico (A.A.
idrofilo) viene assemblata la valina (A.A. idrofobo): e così viene alterata la struttura terziaria della
proteina, compromettendone la idrosolubilità; in condizioni di ipossia, ciò causa la precipitazione
dell’emoglobina con formazione di fibrille. Il fenotipo alterato si esprime in emazie la cui forma
muta da discoidale a (appunto) falciforme, determinando l’incapacità dei globuli di scorrere
normalmente nei vasi, con dolori e possibilità di crisi vaso occlusive (VOC) e infarto per sindrome
cronica acuta (SCA).
La malattia colpisce prevalentemente le popolazioni dell’Africa Subsahariana (forma africana) e
quelle affacciate sul Mediterraneo (forma mediterranea) ed è legata all’infezione da Plasmodium
falciparum, agente eziologico della Malaria: esso si riproduce nei globuli rossi sani, dall’emivita di
120d; la mutazione a monte dell’Anemia può essere interpretata come un meccanismo adattativo
per difendersi dal plasmodio, poiché i globuli falciformi hanno un’emivita di 20d, a seguito dei
quali vengono distrutti, impedendo il lungo ciclo vitale di questo parassita.