Da sempre l’uomo si è interrogato con vivace curiosità sopra i fenomeni dell’ereditarietà biologica che

inevitabilbente condiziona la vita nei più svariati ambiti: ad esempio, per spiegare la somiglianza che
intercorre tra genitori e figli, il medico greco Ippocrate di Cos elaborò la teoria della Pangenesi, secondo la
quale alcune particelle chiamate pangeni si staccano dalle parti del corpo ed entrano negli organi sessuali
affinchè vengano trasmesse alla prole. Da altrettanto tempo, l’uomo si è ingegnato affinchè potesse
modificare gli organismi delle più svariate specie animali e vegetali, facendo riprodurre determinati
individui con caratteristiche selezionate allo scopo di ottenere una progenie nella quale fossero concentrate
tutte le qualità desiderate: vacche che producono maggiori quantità di latte, buoi più resistenti e
performanti nel traino dell’aratro, piante resistenti al freddo e ai parassiti o in grado di produrre frutti con
determinate caratteristiche. Certo, però, tale meccanismo di selezione artificiale ha stimolato le menti
perverse di alcuni folli, ispirando i programmi di eugenetica condotti ad esempio sotto il regime nazista. A
partire dalla seconda metà del secolo XX, le competenze scientifiche dell’uomo hanno raggiunto vette
elevatissime tali che da allora è possibile intervenire con inaudita efficacia nella selezione dei caratteri più
vantaggiosi per il potenziamento degli esseri viventi: e così, in grazia del fenomeno della manipolazione
genetica, è possibile “arrichire” e “modificare” il patrimonio genetico di un individuo di una determinata
specie con le informazioni contenute in specifici geni propri di un individuo di un’altra specie, appartenente
anche ad un altro regno (perché quello del DNA è un linguaggio universale sotteso ad ogni sfaccettatura
della vita).

Un gene è un segmento di DNA la cui successione di basi azotate nei nucleotidi costituisce l’informazione
genetica attraverso la quale si sintetizzano macromolecole proteiche caratterizzate da speciifiche funzioni
(enzimatica, strutturale, immunitaria ecc.). Ad ogni gene è associata una ed una sola proteina prodotta
attraverso il meccanismo della sintesi proteica (dogma centrale della biologia). La successione dei geni
adiacenti, distribuiti nei cromosomi, costituisce il genoma.

Come già introdotto, è possibile inserire all’interno del genoma di un individuo un gene proveniente dal
codice genetico di un individuo appartenente ad un qualunque clade evolutivo, secondo la tecnologia del
DNA ricombinante: volendo schematizzare tale processo, si può affermare che esso è composto da due
momenti:

1. Estrazione ed isolamento del materiale genetico di interesse;

2. Integrazione di questo nel DNA della cellula ospite.

Nell’ambito della biologia molecolare, il metodo più rilevante per l’isolamento dei geni è quello che impiega
gli enzimi di restrizione, di seguito illustrato.

Si incomincia con la lisi delle membrane cellulari e nucleari affinchè si verifichi la liberanzione del DNA, il
quale deve essere separato dagli altri coponenti cellulari mediante centrifugazione. Sul filamento
nucleotidico si fanno agire quindi gli enzimi di restrizione: essi sono descritti come “forbici molecolari”
poiché operano dei tagli lungo la catena in modo da isolare determinati segmenti. Non si pensi però che la
loro azione sia svolta in maniera aleatoria, giacchè essi tagliano la macromolecola in corrispondenza di
precise sequenze palindromiche, brevi tratti che presentano gli stessi nucleotidi se letti nella stessa
direzione su entrambe le eliche (ad esempio, entrambi nel verso 5’ 3’). Le estremità scaturite a seguito del
taglio possono essere di due tipi: quando l’enzima rompe i due filamenti alla stessa altezza si parla di
estremità piatte (bunt ends), mentre, quando essi vengono tagliati in modo sfalsato, si parla di estremità
coesive (sticky ends): queste ultime risultano complementari con le estremità di altri filamenti prodotti
dallo stesso enzima. Il gene così estratto, detto inserto, deve ora accedere al genoma della cellula ospite,
quindi è necessario che venga veicolato da un vettore, una molecla di DNA recante le seguenti
caratteristiche che compongono il packaging di espressione:

-sequenze bersaglio palindromiche per uno o più enzimi di restrizione;

-un sito di origine della duplicazione, affinchè si affranchi dalla duplicazione del genoma ospite;

-un gene marcatore per distinguere le cellule manipolate da quelle non integrate;

-dimensioni ridotte (5000bp);

-un ulteriore marcatore detto gene reporter, il quale permette la sintesidi proteine facilmente rilevabili
(enzimi in grado di modificare il substrato di un terreno differenziale);

Due modelli che ben si confanno alle suddette caratteristiche sono il plasmide e il virus, quindi, a seconda
delle esigenze, sono quelli maggiormente adoperati.

Per permettere l’integrazione dell’inserto nel plasmide, è necessario che questo sia digerito, ovvero tagliato
con lo stesso enzima di restrizione usato per estrarre il gene, per garantire la complementarietà tra le
estremità delle due entità genetiche; questo fenomeno di ligazione è catalizzato dall’enzima DNA ligasi, il
quale unisce con legame fosfodiesterico i suddetti filamenti: la reazione in vitro è favorita da un eccesso di
DNA inserto. Infine, il trasferimento del plasmide-vettore nella cellula ospite è realizzato attraverso il
fenomeno della trasformazione, uno tra i processi di trasferimento di geni presso i batteri, secondo il quale
le cellule ospiti sono in grado di acquisire il materiale genetico proveniente da cellule lisate situate nelle
vicinanze; la capacità delle cellule ospiti di poter subire la trasformazione è detta competenza e, nel caso in
cui le cellule non siano naturalmente competenti o si voglia incrementare l’efficacia di trasformazione, è
possibile mettere in atto artifizi tecnici quali l’elettroporazione o l’impiego di ghiaccio e soluzioni fredde di
ioniCa2+ .

Nel caso del modello del virus, essendo esso un parassita endeocellulare obbligato, può introdurre il
proprio bagaglio genetico nella cellula bersaglio da infettare. I principali virus dimostratisi validi a tale scopo
i retrovirus e gli herpesirus, ovviamente privati del loro potere patogeno attraverso la rimozione di
sequenze genetiche volte a sintetizzare le proteine responsabili di ciò

Oltre al metodo degli enzimi di restrizione, è possibile ottenere un gene attraverso processi di sintesi
chimica: le tecniche di sintesi di oligonucleotidi si basano sulle sperimentazioni condotte negli anni ’50-’60
del secolo XX dagli scienziati Khorana, Letsinger e Merrifield (quest’ultimo in maniera indiretta, poiché si
concentrò sulla sintesi di peptidi). Due sono i concetti fondamentali alla base di queste rivoluzionarie
tecniche: la protezione/deprotezione dei gruppi funzionali affinchè di volta in volta reagiscano solo quelli
desiiderati (Khorana) e l’impiego di un supposto solido insolubile al quale ancorare la prima unità della
biomacromolecola (Merrifield-Letsinger).

Si consideri un generico nucleotide di DNA: esso è formato da un gruppo fosfato legato all’atomo di
carbonio in posizione 3’ o 5’ di una molecola di deossiribosio, la quale leca una base azotata al carbonio
anomerico C-1. I gruppi funzionali liberi sono i seguenti:

-l’ossigeno recante carica negativa legato al fosforo;

-l’ossidrile coinvolto nellegame fosfodiesterico;

-il gruppo amminico esociclico sulla base azotata (eccezion fatta per la timina);
Le molecole impiegate per la protezione/deprotezione dei suddetti gruppi sono distinte in due categorie:
gruppi protettori semipermanenti rimovibili solo al termine dell’assemblaggio della catena, e gruppi
protettori temporanei rimovibili al termine di ogni ciclo accoppiamento, ossia prima dell’addizione del
nucleotide successivo. Alla prima categoria appartengono i gruppi relativi alla protezione del gruppo
amminico esociclico (benzoile per A, isobutirrileper G e C) e quelli relativi alla protezione del gruppo fosfato
(β-cianoetile e diisopropil ammino); al secondo gruppo appartiene il 4,4’-dimetossitrifenilmetile
dimetossitritile DMT), il quale proteggel’ossidrile sul C-5 del nucleotide da assemblare, rimovibile per
lavaggio con acido tricloroacetico in condizioni blande. Per quanto riguarda il supporto insolubile, numerosi
materiali sono stati sperimentati, poiché tutti manifestavano il problema dello swelling, ossia l’effetto di
rigonfiamento a seguito dell’interazione con solventi organici; oggi si impiegano vetri modificati a pori
controllati.

Il processo di sintesi esordisce con l’attacco dell’estremità 3’ di un nucleoside (quindi in assenza del gruppo
fosfato) al supporto solido attraverso un lniker, il quale forma un legame estereo con l’ossidrile sul C-3;
consequenzialmente, l’estremità 5’ resta protetta dal DMT. Successivamente si esegue il laavaggio con
acido tricloroacetico per la deprotonazione dell’ossidrile in 5’ e si prepara così l’attacco del gruppo fosfato
del nucleotide successivo: tale reazione avviene in presenza dell’agente condensante dicicloesil
carbodiammide (DCC). A questo punto, deproteggendo l’ossidrile sull’estremità 3’ di questo secondo
nucleotide, si può proseguire l’allungamento della catena ripetendo i passaggi appena illustrati.

L’uomo ha quindi a propria disposizione mirabili prodigi tecnici e biotecnologici attraverso i quali diventa
possibile curare alcune tra le più infauste malattie che lo affliggono: la nuova frontiera della terapia genica
permette sempre più che non si faccia ricorso ad antibiotici, chemioterapici, medicinali varî, terapie
radiologiche, trasfusioni e trapianti eterologhi, poiché agisce direttamente alla fonte del male, ovvero
laddove vi siano alterazioni del DNA (geniche, cromosomiche o genomiche) determinanti tumori o malattie
genetiche.

Nella vasta rosa di questi eventi morbosi, la drepanocitosi o anemia falciforme è oggetto di studi e
sperimentazioni in questo ambito. Si tratta di una malattia genetica ereditaria autosomica recessiva causata
da una mutazione puntiforme del gene responsabile della sintesi della catena β dell’emoglobina, situato sul
braccio p del cromosoma 11. A causa della sostituzione di una base azotata si manifesta una mutazione
missenso, giacché in luogo dell’acido glutammico (A.A. idrofilo) viene assemblata la valina (A.A. idrofobo): e
così viene alterata la struttura terziaria della proteina, compromettendone la idrosolubilità; in condizioni di
ipossia, ciò causa la precipitazione dell’emoglobina con formazione di fibrille. Il fenotipo alterato si esprime
in emazie la cui forma muta da discoidale a (appunto) falciforme, determinando l’incapacità dei globuli di
scorrere normalmente nei vasi, con dolori e possibilità di crisi vaso occlusive (VOC) e infarto per sindrome
cronica acuta (SCA). La malattia colpisce prevalentemente le popolazioni dell’Africa Subsahariana (forma
africana) e quelle affacciate sul Mediterraneo (forma mediterranea) ed è legata all’infezione da
Plasmodium falciparum, agente eziologico della Malaria:esso si riproduce nei globuli rossi sani, dall’emivita
di 120d, quindi la mutazione a monte dell’Anemia può essere interpretata come un meccanismo adattativo
per difendersi dal plasmodio, poiché i globuli falciformi hanno un’emivita di 20d, a seguito dei quali
vengono distrutti, impedendo il ciclo vitale di questo parassita.

La terapia medicinale a base di N-idrossiurea è limitata ai soli sintomi, e le continue trasfusioni di certo non
pongono fine al problema: come già detto, solo una terapia genica potrebbe ripristinare la produzione di Hb
corretta. A tale proposito l’azienda Bluebird bio sta mettendo a punto il farmaco LentiGlobin, basato
sull’impiego di un lentivirus in veste di vettore virale, il cui genoma è stato modificato affinchè rechi il gene
corretto associato alla β-globina: la terapia è condotta ex vivo provocando l’infezione di un campione di
cellule staminali emopoietiche del midollo osseo rosso, precedentemente prelevate; queste vengono poi
reimpiantate, attecchiscono e si differenziano in globuli rossi correttamente funzionanti. Il genere dei
lentivirus appartiene al Gruppo VI dei retrovirus a ssRNA, mentre tra le specie che rientrano in questo
genere vi sono i virus dell'HIV umano HIV-1 e HIV-2, agenti eziologici dell'AIDS.

Per testare e valutare la terapia è stato intrapreso un trial clinico controllato per il quale sono state
arruolate 3 coorti A B C, ciascuna composta da soggetti under 50 affetti da anemia falciforme: le coorti sono
state trattate in successione, modificando e affinando di volta in volta il farmaco per renderlo più efficace:
quindi ora ci si riferirà alla coorte C.

Essa è composta da 49 pazienti, dei quali 17 sono stati trattati con LentiGlobin. Il periodo di follow up più
lungo è durato 21 mesi: 12 di questi avevano almeno 6 mesi di follow-up al momento del cut-off dei dati
(ovvero al momento in cui la prova vira da negativa a positiva). In questi pazienti, i livelli mediani di
emoglobina anti-falcemica HbAT87Q indotta dalla terapia genica rappresentavano almeno il 40%
dell'emoglobina totale e, all'ultima visita, i livelli totali di emoglobina e di HbAT87Q risultavano compresi
rispettivamente tra 9,3 e 15,2 g/dl e tra 2,7 e 9,0 g/dl: infatti l’emoglobina ‘anti-falcemica’ è presente nella
maggior parte dei globuli rossi dei pazienti trattati e la forte produzione di HbAT87Q è associata a una
sostanziale riduzione dell’emoglobina falcemica HbS caratteristica della malattia, i cui livelli mediani non
superavano il 60% a 6 mesi dall’infusione con LentiGlobin; è stata inoltre attestata una riduzione dei marker
chiave dell’emolisi, come la conta dei reticolociti (globuli rossi immaturi), i livelli di lattato deidrogenasi e i
livelli di bilirubina totale. Ciò che più sorprende è che tutti i pazienti del Gruppo C hanno potuto
interrompere le regolari trasfusioni di sangue mantenendo l’indipendenza dalle trasfusioni a tre mesi dal
trattamento e che, nel lasso di tempo fra 1 e 21 mesi post-infusione, nessun paziente ha sviluppato VOC o
SCA severe; è stato riscontrato un solo caso di VOC di grado 2 dopo 3,5 mesi dal trattamento. Attualmente
lo studio si trova nella terza fase, quindi prevede coorti piuttosto numerose: se anch’esso dovesse avere
esiti positivi, ben presto il trattamento con LentiGlobin potrà ricevere il via libera al commercio e alla
somministrazione.

I GENI E LA TERAPIA GENICA

Bibliografia, sitografia, videografia

Cain, Dickey, Hogan: Campbell BIOLOGIA concetti e collegamenti edizione AZZURRA (secondo biennio)

Hart, Hadad, Craine: Chimica organica (settima edizione)

Fiorin: Biologia e microbiologia ambientale e sanitaria

Fanti: Biologia, microbiologia e biotecnologie

Carnevali, Balugani, Marra: Elementi di igiene e patologia

Prof.ssa Ratti: Appunti di Igiene

https://www.youtube.com/watch?v=fWveePFM3zI