La reazione PCR

Dipartimento di Scienze Agronomiche e Genetica Vegetale Agraria Corso di Genetica Agraria Giovanna Attene

La PCR (Polymerase Chain Reaction) o reazione a catena della polimerasi

La reazione a catena della polimerasi (PCR = Polymerase Chain Reaction) una tecnica estremamente potente che consente di amplificare sequenze di DNA milioni di volte in poche ore.

La tecnica venne inventata nel 1983 da K. Mullis che ricevette per questa scoperta il premio Nobel per la Chimica dieci anni pi tardi.

Lidea di Mullis si basa sullintuizione che tutti i processi di replicazione del DNA in vivo possono essere fatti avvenire in vitro e ciclicamente in modo controllato per copiare milioni di volte (=amplificare) determinate sequenze di DNA

La PCR (Polymerase Chain Reaction) o reazione a catena della polimerasi

In vivo
Elicasi

FASI
Denaturazione doppia elica (rottura legami idrogeno) Innesco per la DNA polimerasi
(i primer formano legami idrogeno con il filamento DNA in zone di omologia)

In vitro
C alte temperature (94C)

RNA polimerasi

primer sintetici di DNA

+
Riduzione delle temperature

DNA polimerasi + Nucleotidi

Allungamento del filamento

DNA polimerasi + Nucleotidi

La PCR (Polymerase Chain Reaction) o reazione a catena della polimerasi

Risolutiva fu la scoperta che la DNA polimerasi del batterio Thermus acquaticus (Taq polimerasi) che adattato a vivere nelle pozze di acqua bollente in prossimit dei geysers, resiste anche a temperature elevate (prossime ai 100 C) con un ottimo di funzionamento a 72 C

La PCR (Polymerase Chain Reaction) o reazione a catena della polimerasi

La PCR consiste fondamentalmente di 3 fasi:

1. DENATURAZIONE 2. APPAIAMENTO 3. ESTENSIONE DNA stampo Primers dNTP DNA polimerasi Buffer

La PCR (Polymerase Chain Reaction) o reazione a catena della polimerasi

1. Denaturazione del DNA stampo e a doppia elica e (in seguito a riscaldamento).

5 3 5 3 2. Appaiamento (annealing) dei primer al DNA stampo

3 5 94-96 C 3 5

5 3

3 5

37-68 C

La PCR (Polymerase Chain Reaction) o reazione a catena della polimerasi

Immaginiamo ora di ripetere per pi volte (cicli) la sequenza denaturazione-innesco-allungamento. Poich il numero di copie del DNA bersaglio raddoppia ad ogni ciclo denaturazione-innescoallungamento dopo poche ore si ha laccumulo (amplificazione) di uno o pochi tratti specifici del DNA stampo secondo una crescita esponenziale

Denaturazione Estensione Inizio Accoppiamento (annealing) Animazione

35 40 cicli:

La PCR (Polymerase Chain Reaction) o reazione a catena della polimerasi

Crescita esponenziale della sequenza bersaglio

1 (20)

2 (21)

4 (22)

8 (23)

16 (24)

La PCR (Polymerase Chain Reaction) o reazione a catena della polimerasi

Il termociclatore (thermalcycler)
Vista dallalto