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Funzione tiroidea neonatale a Seveso a 25 anni

dall’esposizione materna a diossina


(Traduzione semi-integrale del corpo originale dello studio pubblicato su Plos Medicine – Luglio 2008)

Introduzione
Le variazioni nelle funzioni della tiroide nei neonati valutata alla nascita con la misura del tasso di
Tyroid Stimulating Hormone (b-TSH) sono associate con variazioni nella disponibilità e
nell’assunzione di iodio della madre.[1] Secondo l’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) la
percentuale di neonati con b-TSH > 5 µU/ml dovrebbe essere inferiore al 3% in popolazione senza
deficit di iodio [1]. A parte il deficit di iodio nessuna esposizione ambientale è stata definitivamente
associata con la riduzione della fuzione della tiroide neonatale umana.
La 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD), un contaminante ambientale, è il più tossico
composto di una classe di inquinanti chimici ambientali, incluse altre diossine, Bisfenili
Policlorinati (PCB), furani, composti brominati, idrocarburi policiclici aromatici, pesticidi
organoclorici [5,6]. Forti esposizioni a diossina si sono verificate per lavoratori chimici, per i
veterani militari diffusori dell’agente Orange in Vietnam, per contaminazioni accidentali di olio di
riso e recenti isolati avvalenamenti come quello dell’attuale presidente ucraino e di cinque
collaboratori (...) [6]. Nei modelli su animali l’esposizione materna a TCDD produce elevati livelli
di b-TSH e ipotiroidismo primario nei neonati [2,7-10], così come si è osservato che il TCDD e altri
composti collegati, accelarano l’eliminazione di ormini tiroidei mediante l’incremento dell’attività
metabolica degli enzimi e la competizione con le proteine di connessione. [11-13].

Il TCDD presenta tempi di dimezzamento estremamente elevati, in particolare nelle donne (circa 10
anni) e si è mostrato ancora molto elevato nei campioni di sangue prelevati da donne esposte 20
anni dopo l’incidente di Seveso.

A partire dal 1994 i ricercatori hanno condotto due indagini correlate sulla popolazione di Seveso
per determinare se l’esposizione delle madri a TCDD così come gli elevati livelli attuali di diossina
nel sangue, abbiano modificato la funzione della tiroide nei neonati.

Materiali e Metodi.
Popolazione oggetto di studio.
Dopo l’incidente di Seveso sono state delimitate tre zone di contaminazione decrescente A, B e R
(zona di rispetto), sulla base della concentrazione di TCDD al suolo.
E’ stata indivuduato un gruppo che include tutti gli individui abitanti in queste tre zone (804 in zona
A, 5941 nella B 38624 nella R) e nelle aree circostanti non contaminate (zona “di riferimento”,
232740 persone).
Le misure effettuate su campioni di plasma prelevati da individui tra 1 e 2 anni dopo l’incidente
hanno mostrato livelli medi di TCDD di 447 parti per trilione (ppt) in zona A (n=296), 94 ppt in
zona B (n=80) e 48 ppt in zona R (n=48) [21].
(n indica la numerosità del campione).
Una campagna successiva svolta nel 1993-94 ha rilevato ancora livelli elevati nel plasma della
popolazione esposta, in particolare tra le donne, che avevano medie geometriche di TCCD nel
plasma di 60,5 ppt in zona A (n=71), 17,6 ppt in zona B (n=51) a fronte di 6,1 ppt negli individui
della zona di riferimento (n=52) [17].
Seveso è situata in Lombardia, una regione del nord Italia con una popolazione di 9,2 milioni di
abitanti dove la funzione della tiroide è controllata in tutti i neonati misurnado il b-TSH. I campioni
di sangue per lo screening del b-TSH vengono prelevati entro 72 ore dalla nascita da una piccola
puntura nel tallone (heel prick) e vengono (tutti) analizzati dal Laboratorio Centrale di Screening
Neonatale di Milano.
Dal 1/1/1994 tutti i dati sul b-TSH sono stati registrati nel Registro per lo Screening Neonatale che
include anche informazioni sulla data e l’ospedale di nascita, il peso alla nascita, e il luogo di
residenza.
Le due indagini descritte sotto sono state approvate dal review board dell’ospedale Maggiore
Policlinico Mangiagalli, Fondazione Regina Elena di Milano.

Studio in base alla zona di residenza della popolazione.


Sono state scelte per lo studio tutte le 1772 donne delle zone altamente contaminate (A e B) che
fossero:
(i) residenti in zona A (n=186) o B (n=1231) al tempo dell’incidente (10 luglio 1976) o
potenzialmente esposte a TCDD perchè si trovavano in zona A (n=27) o B (n=328) tra il
10/7/1976 e il il 31/12/1979;
(ii) in età fertile (data di nascita successiva al 31/12/1947);
(iii) in vita al 1/1/1994.

Come termine di paragone sono state scelte casualmente 1772 donne con caratteristiche analoghe
((ii) e (iii)) tra la popolazione (n=55576) residente nell’area di riferimento e quindi non esposte alla
contaminazione.
Le donne non esposte sono state accoppiate con le donne esposte in base all’anno di nascita e alla
residenza nell’area di riferimento alla data dell’incidente.
Sono stati contattati 472 uffici anagrafe dei comuni di residenza delle donne per identificare tutti i
bambini nati dai partecipanti allo studio.
I dati anagrafici sono stati rintracciati per 1761 (99,4%) delle 1772 donne delle aree contaminate (A
e B) e 1762 donne su 1772 (99,4%) donne dell’area di riferimento.
Poichè le misure di b-TSH del nostro studio son state ottenute tutte dal Laboratorio Centrale di
Screening Neonatale di Milano abbiamo escluso tutti i bambini nati fuori dalla Lombardia (n=156;
13,3% dei 1170 bambini tracciati).
Dopo tale esclusione abbiamo individuato 1014 bambini (56 dalla zona A, 425 dalla zona B, 533
dal riferimento) nati tra il 1/1/1994 e il 30/6/2005 da un gruppo composto da 42 donne della zona A,
327 donne della zona B e 403 donne dell’area di riferimento.
Per tutti i nati abbiamo ottenuto informazioni sul tipo di parto (naturale, cerareo) grazie al sistema
di registrazione regionale dei dati ospedalieri.

La popolazione della zona R è stata esclusa dallo studio.

Studio sul tasso di diossina nel plasma.


[Per poter capire se esisteva una relazione diretta fra tasso di diossine nel sangue delle madri e
aumento del tasso di TSH nei bambini n.d.t.] è stata condotta una seconda indagine sui bambini nati
dalle 109 donne in età fertile (nate dopo il dicembre 1947) che furono parte dello studio sulla
cloracne di Seveso [22].
Tutti i partecipanti hanno accordato consenso informato scritto. Tra il 1 gennaio 1994 e il 30 giugno
2005 sono nati 51 bambini (...) da 38 di queste 109 donne; le rimanenenti 71 donne non hanno
procreato nel periodo di studio. (...)
Le misurazioni di diossina [nel sangue di queste donne n.d.t.] sono state effettuate dal Center for
Desease Control (Atlanta, USA), utilizzando utilizzando gas cromatografia ad alta risoluzione /
spettrometria di massa ad alta risoluzione [23] su campioni di plasma prelevati tra il dicembre
1992 e il settembre 1998. Nel dettaglio sono stati misurati 24 congeneri inclusi il TCDD e sei
ulteriori dibenzo-p-diossine (PCDD), dieci dibenzofurani (PCDF) e quattro PCB coplanari. A
partire dal 1996 altri 36 PCB non coplanari, inclusi alcuni mono-orto congeneri sono stati aggiunti
al gruppo di congeneri testati. I PCB non coplanari sono stati riscontrati in un subset di 37 delle 51
coppie mamma-bambino. I risultati delle misure sono stati riportati in lipid adjusted ppt (parti per
trilione n.d.t.). Per le donne con concentrazione > 10 ppt è stato estrapolato il valore di TCDD nel
plasma alla data del parto utilizzando un modello farmacocinetico del primo primo ordine [24,15],
usando il tasso di eliminazione stimato a Seveso (equivalente ad un periodo di dimezzamento di 9,8
anni nelle donne) [15].
E’ stata definita una concentrazione di tossico equivalente (TEQ) per un mix di composti simili alla
diossina calcolato come prodotto della concentrazione di ciascun congenere per un coefficiente di
tossicità equivalente (TEF) [26].
Si è rilevato un livello medio di TCDD nelle madri di 18,9 ppt (n=51, valori da 1,4 a 309,4).
Il levello medio di TEQ rilevato è stato di 44,8 ppt (n=51, valori da 11,6 a 330,4) per i PCDD,
PCDF e PCB coplanari; e di 1,8 ppt (n=37, valori da 0,6 a 4,2) per PCB non-coplanari. (...)

Analisi statistica
(La traduzione di questo paragrafo non è stata inclusa per l’elevata tecnicità dell’argomento. Per
chi fosse interessato agli strumenti matematici e statistici utilizzati si rimanda all’originale in
inglese.)

Risultati
Studio sulla popolazione residente
Le caratteristiche dei neonati inclusi nello studio sulla popolazione residente erano simili nelle tre
aree contaminate. Il tasso di b-TSH neonatale varia da 0,2 a 14,0 µU/ml. Il b-TSH neonatale medio
descresceva con il crescere del peso alla nascita (p=0,03) in modo consistente con le precedenti
osservazioni su altre popolazioni [27], e mostrava variazioni moderate e non significative in
relazione all’ordine di nascita e al tipo di parto.

La media del b-TSH neonatale era significativamente più elevata nella popolazione che aveva
vissuto nelle zone contaminata da TCDD al tempo dell’incidente (Tabella 2).

Tabella 2

Dato grezzo Analisi mutivariata


Zona n b-TSH medio CI 95% b-TSH medio CI 95%
numerosità del Escursione con Escursione con
campione un Indice di un Indice di
Confidenza 95% Confidenza 95%
Riferimento 533 0,98 da 0,90 a 1,08 0,99 da 0,90 a 1,08
A 425 1,35 da 1,22 a 1,49 1,35 da 1,23 a 1,50
B 56 1,66 da 1,19 a 2,31 1,63 da 1,13 a 2,33

Il b-TSH medio era di 0,98 µU/ml (95% CI 0,90 – 1,08) nella popolazione di riferimento, 1,35
µU/ml (95% CI 1,22 – 1,49) nella zona B e 1,66 µU/ml (95% CI 1,19 – 2,31) in zona A, la zona più
contaminata (...).
Le distribuzioni di b-TSH nelle diverse zone sono mostrate in Figura 1.
La proporzione di neonati con tasso di b-TSH > 5 µU/ml (Tabella 3) era pari al 2,8% nella zona di
riferimento, al 4,9% in zona B e al 16,1% in zona A (p < 0,001). In confronto con la zona di
riferimento i picchi relativi di b-TSH si incrementano nella zona contaminata con un Odd Ratio
(OR) = 1,79 (95% CI 0,92 – 3,50) per la zona B e OR = 6,60 (95% CI 2,45 – 17,8) per la zona A
(...).
Otto dei neonati nello studio (3 dal riferimento, pari allo 0,6%, 4 dalla zona B pari allo 0,9% e uno
dalla zona A, pari al 1,8%) presentavano livelli di b-TSH oltre a 10 µU/ml, indicato come soglia di
richiamo per ulteriori indagini di laboratorio e cliniche in Regione Lombardia.
Due di loro (uno della zona B (0,2%) e uno della zona A (1,8%) avevano b-TSH oltre i 10 µU/ml
due volte nei test di richiamo ed è stata loro probabilmente diagnosticato ipotiroidismo congenito
primario (p=0,0049 dal test esatto di Fisher). I rimanenti cinque bambini presentavano tutti b-TSH
inferiore a 5 µU/ml al primo richiamo e non sono stati sottoposti a test ulteriori.
228 donne hanno avuto più di un figlio durante il periodo di studio.
Abbiamo calcolato la differenza in b-TSH tra il primo e il secondo figlio (228 coppie), e tra il terzo
e il secondo figlio (14 coppie). Il b-TSH neonatale è diminuito nel tempo tra il primo e il secondo
figlio nelle zone contaminate (A e B) mentre non si sono rilevati decrementi nella popolazione di
riferimento (...).
Tutti i risultati nello studio sulla popolazione residente non si sono modificati dopo aver apportato
le correzioni per il sesso, il peso alla nascita, l’ordine di nascita l’età della madre al parto,
l’ospedale, e il tipo di parto (Tabelle 2-4).

Studio sul tasso di diossina nel plasma.


I livelli di TCDD materno stimati alla data del parto sono stati associati positivamente con il tasso
di b-TSH (n=51, coefficiente di regressione standard β = 0,47 p<0,001, Figura 2A).
Quando sono stati considerati altri congeneri della diossina è stato rilevato un indice di correlazione
simile con il TEQ per PCDD, PCDF e PCB coplanare. (n=51, β = 0,45 p<0,005, figura 2B) ma non
con il PCB non-coplanare (n=37, β = 0,16, p<0,45, Figura 2C).
I modelli di regressione multivariata, apportando le correzioni per il sesso, il peso alla nascita,
l’ordine di nascita, l’età della madre al momento del parto, l’ospedale, e il tipo di parto hanno
confermato l’associazione del b-TSH neonatale con il tasso di TCDD nel plasma (β = 0,75
p<0,001), con il tasso di PCDD, PCDF e PCB complanari (β = 0,68 p<0,001) e la mancanza di
correlazione significativa con i PCB non-coplanari (β = 0,24 p<0,46).
Considerando la somma dei tutti i TEQ la correlazione con il b-TSH neonatale non era molto
significativa nell’analisi non depurata (crude analysis n.d.t.) (n=37, β = 0,31 p<0,14, Figura 2D).
Tuttavia nell’analisi multivariata la correlazione era significativa (β = 0,65 p<0,001).
(...)
Tutte le associazioni positive dipendono dalla presenza nelle analisi di persone con livelli molti alti
di TCDD nel plasma (> 50 ppt, n=5). Se si restringe l’analisi a individui con TCDD inferiore a 50
ppt nessuna delle correlazioni descritte era statisticamente significativa. Tuttavia, utilizzando il
coefficiente di correlazione di rango di Searman (rs), le associazioni di b-TSH con il TCDD
plasmatico (rs=0,28, p=0,04) e con TEQ per PCDD, PCDF e PCB coplanari (rs=0,33, p=0,02) sono
significative.

Dividendo i neonati per zona contaminata la correlazione con il b-TSH neonatale è più alta in zona
A sia per il TCDD (rs=0,70, p=0,01) che per PCDD, PCDF e PCB coplanare (rs=0,82, p=0,01)
mentre nella zona di riferimento non si riscontra alcuna associazione nè con il TCDD (rs=-0,25,
p=0,51) o con PCDD, PCDF e PCB coplanare (rs=-0,11, p=0,78).

Le analisi descritte sopra sono basate su livelli di TCDD che, per le donne con tasso > 10 ppt sono
state estrapolate usando un modello farmacocinetico del primo ordine.
L’uso delle concentrazioni di TCDD misurate al posto dei valori estrapolati influisce sui risultati
solo marginalmente. In partcolare i livelli di b-TSH neonatale hanno mostrato associazioni
significativa nel modello mutlivariato con il TCDD del plasma (β = 0,68 p<0,002); plasma TEQ per
PCDD, PCDF e PCB coplanari (β = 0,60 p<0,004); e con la somma di tutti i TEQ (β = 0,65
p<0,001).
Come illustrato dalla Tabella 5, il tasso di diossina nel plasma materno erano significativamente più
alti per i neonati con b-TSH > 5 µU/ml. Il tasso di TCDD del plasma era di 5,2 ppt (95% CI 4,1 –
6,7) nei neonati con b-TSH ≤ 5 µU/ml mentre era di 39,0 ppt (95% CI 8,9 – 173) in quelli con b-
TSH > 5 µU/ml (p=0,005).
Il tasso di TEQ per PCDD, PCDF e PCB coplanari era di 30,6 ppt (95% CI 26,9 – 34,8) nei neonati
con b-TSH ≤ 5 µU/ml mentre era di di 88,9 ppt (95% CI 43,1 – 183,5) in quelli con b-TSH > 5
µU/ml (p=0,002).
Inoltre nel gruppo con b-TSH ≤ 5 µU/ml il livello di PCB non-coplanari (1,5 ppt, 95% CI 1,2 – 1,8)
e la somma di tutti i TEQ (29,2 ppt, 95% CI 25,3% - 33,5%) erano singificativamente differenti dai
livelli riscontrati nei gruppi con b-TSH > 5 µU/ml (2,9 ppt, 95% CI 1,8 – 4,6, p=0,003 per PCB
non-coplanari; 84,5% ppt, 95% CI 16,7 – 427,8 p=0,01 per la somma di tutti i TEQ).
Discussione
Il b-TSH neonatale, che viene utilizzato nella maggior parte dei paesi per individuare
l’ipotiroidismo neonatale, è considerato un marcatore di ipotoroidismo primario subclinico ed è un
indice significativo della presenza di fattori che causano ingrossamenti della toroide e potenziali
alterazioni delle sue funzioni [1,29,30].
I nostri risultati sulla popolazione di Seveso hanno mostrato che i neonati da mamme aventi un
elevato carico corporeo di TCDD, per effetto dell’esposizione alla diossina avvenuta circa 20-30
anni prima, hanno causato concentrazioni più alte b-TSH nei neonati rispetto a donne non esposte.
Nel nostro studio sulla popolazione residente abbiamo osservato uno spostamento nella
distribuzione di b-TSH verso valori più alti per i gruppi esposti, cosa che suggerisce come
l’esposizione a diossina possa produrre effetti rintracciabili a livello di popolazione.
I livelli medi di b-TSH si incrementano nelle zone contaminate (zone A e B) con proporzioni di b-
TSH olte i 5 µU/ml che, nelle zone contaminate (A e B) egualiano quelli associati a lieve deficienza
di iodio (dal 3% al 19,9% secondo l’OMS) [1]. Studi epidemiologici condotti in aree con lieve o
moderata deficienza di iodio hanno dimostrato, anche in assenza di ipotiroidismo clinico, la
presenza di anormalità nello sviluppo psicomotorio e intellettuale, inclusi indebolimento delle
capacità visivo-motorie, capacità di movimento, capacità percettive e neuromotorie, così come
riduzioni dello sviluppo e del quoziente intellettivo (IQ) [29,31]. Le alterazionei cognitive e motorie
sono anche state descritte in bambini con esposizione perinatale a composti collegati alla diossina
[10,32-36]. A livello individuale solo 8 dei neonati nello studio mostrava livello di b-TSH > 10
µU/ml, comunemente stabilita come soglia di richiamo per ulteriori analisi di laboratorio e indagine
clinica di ipotiroidismo. Dopo utleriori esami è stato diagnosticato ipotiroidismo primario a due dei
bambini delle zone contaminate e a nessuno dei bambini delle zone di riferimento.
La nostra indagine sulla popolazione residente non ha incluso le donne della zona R che era l’area
meno contaminata, che rappresenta una striscia tra la zona contaminata e la zona circostante [20].
Si raccomandano ulteriori analisi per determinare se le funzioni della tiroide siano state alterate
dall’esposione alla diossina nella zona R.
Si è dimostrato che la disossina nel plasma, sia a Seveso che altrove, decresce esponenzialmente
nel tempo negli individui con forte accumulo corporeo, mentre rimane pressochè costante in
individui con esposizione dovuta alle normali condizioni ambientali [24,25]. Nello studio sulla zona
di residenza l’analisi di variazioni del b-TSH neonatale di fratelli nati appartneneti alla zona
contaminata ha mostrato che il b-TSH era più alto nel primo nato e tendeva a diminuire nel tempo
nei successivi. Non si sono osservati decrementi nel tempo del b-TSH nella zona di riferimento.
L’osservazione fornisce una evidenza indiretta del decrescere degli effetti della diossina sul b-TSH
neonatale per effetto dell’eliminazione della diossina nel tempo così come descritto a Seveso [15].
La nostra analisi basata sulla misura della diossina nel plasma ha confermato i risultati dello studio
svolto sulla base della zona di residenza della popolazione e ha permesso una conferma diretta della
correlazione positiva tra il livello di b-TSH e quello di TCDD, o di altri tossici simili, stimato nel
plasma (della madre) alla nascita. La persistenza di di livelli elevati di TCDD dopo oltre 20
dall’incidente e la forza relativa dell’associazione suggerisce che il TCDD sia il fattore principale
che governa la relazione fra diossina nel plasma e b-TSH. Seveso è stata esposta in modo
predominante a TCDD [14] e le associazioni osservate nel tasso di b-TSH neonatale può riflettere
differenti dosi di esposizione così come differente suscettibilità individuale.
I risultati, mostrando livelli maggiori di b-TSH negli individui esposti a TCDD, sono consistenti
con le indagini sugli animali che indicano che l’esposizione a TCDD delle madri induce livelli
elevati di b-TSH e ipotiroidismo neonatale primario. [2,7,8,10].
Le precedenti indagini sugli uomini in cui si erano misurate le funzionalità della tiroide e
l’esposizione a TCDD in coppie mamma-figlio su popolazioni generiche avevano prodotto risultati
inconsistenti [2].
(...)
Il nostro studio ha il vantaggio di essere basato su un’unica popolazione di donne esposte a forti
livelli di TCDD. Il nostro studio basato sulla zona di residenza ha compreso più di 1000 neonati la
cui funzione tiroidea è stata valutata appena dopo la nascita con procedure standardizzate di
prelievo e di conferimento dei campioni di sange. Le misure di b-TSH sono state tutte effettuate da
un solo laboratorio con lo stesso metodo durante tutto il periodo di studio.
Lo studio riguardante le misure di diossina del sange, condotto su un campione più limitato,
includendo solo in parte la popolazione inclusa nello studio basato sulla residenza, ha permesso di
valutare la relazione dose-effetto con diverse metriche di concentrazione di diossina.
Poichè il livello di b-TSH è stato misurato fino a 72 ore dopo il parto, è possibile che i trasferimenti
di diossina madre-bambino attraverso il colostro (il primo latte materno n.d.t.) abbiano contribuito
alla correlazione tra diossina e livello di b-TSH. Data la mancanza di informazioni sull’allattamento
prima della misura del b-TSH il contributo relativo di diossina dal colostro non è stato valutato.
Nella nostra analisi abbiamo rettificato i dati per tener conto di altri fattori che potessero influenzare
il b-TSH o il livello di TCDD, inclusi il sesso, il peso alla nascita, l’ordine di nascita, l’età della
madre al parto, l’ospedale, e il tipo di parto.
Non erano disponibili dati su altri fattori influenti sul b-TSH neonatale, qui l’assunzine di iodio da
parte della madre. Tuttavia non vi era alcuna indicazione di possibili differenze nell’assunzione di
iodio tra le donne esposte e quelle non-esposte. Le donne esposte e la popolazione di riferimento
vivevano tutte in un’area geografica relativamente piccola al momento dell’incidente.
Il cambio di residenza immediatamente dopo l’incidente e le successive migrazioni in un pò tutta la
Lombardia sono molto simili per la popolazione esposta e quella non esposta [14,20,51]. Tutti gli
indicatori disponibili hanno mostrato forte analogia in termini sociali, educativi, culturali e
occupazionali così come per l’accesso ai servizi sanitari tra le due popolazioni.
Inoltre, rettificando i dati in base all’ospedale di nascita nei modelli multivariati, abbiamo anche
verificato la provenienza geografica, riducendo così ulteriormente la possibilità che differenze
ambientali nella concentrazione di iodio tra popolazione esposta e non-esposta possano aver
influenzato i risultati.
La nostra ricerca sulla popolazione di Seveso indica che l’esposizione materna persistente a
contaminanti ambientali come il TCDD produce effetti sulle funzioni della tiroide dei neonati che
possono manifestarsi dopo molto tempo l’esposizione iniziale. Per chiarire il significato clinico
della scoperta si raccomandano ulteriori indagini sullo sviluppo dei bambini in relazione
all’esposizione a diossina delle madri.