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Spettrometria di Massa e I.R.

(il materiale riportato in queste dispense è stato elaborato anche grazie al materiale proveniente dai
vari testi di spettroscopia e dai numerosi siti web disponibi)
Indice
Capitolo 1. Spettrometria di massa 2
1.1 PRINCIPI DI BASE E APPARECCHIATURA 2
1.2 COMPONENTI SPETTROMETRO DI MASSA E RISOLUZIONE 2
1.3 CAMERA DI IONIZZAZIONE o SORGENTE 7
1.4 ELECTRON IMPACT (E.I) 7
1.4.1 MECCANISMO DI IONIZZAZIONE 8
1.5 SORGENTI DI IONIZZAZIONE ALTERNATIVE 9
1.5.1 CHEMICAL IONIZATION (C.I.) 9
1.5.2 FAST ATOM BOMBARDMENT (F.A.B.) 10
1.5.3 MATRIX-ASSISTED LASER DESORPTION IONISATION (M.A.L.D.I.) 12
1.5.4 ELECTROSPRAY (E.S.) 14
1.5.5 TECNICA DELLO ZOOM-SCAN 16
1.6 ANALIZZATORI 16
1.6.1 Analizzatori a deflessione magnetica 17
1.6.2 Analizzatori a quadrupolo 18
1.6.3 Analizzatori a tempo di volo (TOF) 19
1.7 IL RIVELATORE 19
1.8 ANALISI DI UNO SPETTRO DI MASSA 20
1.9 DETERMINAZIONE DELLA STRUTTURA E DEL PESO MOLECOLARE 21
1.9.1 ISOTOPI 22
1.10 FRAMMENTAZIONE DEGLI IONI POSITIVI 24
1.11 FATTORI CHE STABILIZZANO UNO IONE 25
1.12 FRAMMENTAZIONI A PIÙ CENTRI 27
1.13 Elenco dei frammenti ionici più comuni 29
1.14 Elenco dei frammenti neutri più comuni 30
Capitolo 2. Spettroscopia Infrarossa (IR) 31
2.1 Introduzione 31
2.2 Interpretazione degli spettri 32
2.3 Molecole biatomiche 33
2.4 Moti vibrazionali 34
2.5 Strumentazione IR 35
2.6 Bande di assorbimento caratteristiche 38
2.7 Esempi di Spettri IR 41

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Capitolo 1. Spettrometria di massa
1.1 PRINCIPI DI BASE E APPARECCHIATURA

La spettrometria di massa consiste in un insieme di tecniche analitiche, particolarmente usate


in chimica organica, che consentono di misurare le masse molecolari e di determinare la formula
molecolare di composti sconosciuti, anche avendone a disposizione piccole quantità.
Per poter essere osservata e misurata nelle sue proprietà di massa, una molecola deve essere
prima ionizzata.
Per ottenere uno spettro di massa, infatti, il requisito essenziale è la vaporizzazione degli ioni
che saranno successivamente accelerati fino a raggiungere una velocità specifica mediante un
campo elettrico, e poi proiettati in un analizzatore di massa appropriato che separa entità di massa
diversa. Mediante la spettrometria di massa è possibile studiare qualsiasi tipo di composto che sia
in grado di essere ionizzato, e i cui ioni possano esistere in fase gassosa. Questa tecnica, quindi,
risulta completamente diversa dagli altri comuni metodi analitici. A differenza delle tecniche
spettroscopiche, essa è un metodo d’analisi distruttivo (la molecola non rimane intatta dopo
l’analisi), e soprattutto non si basa sull’interazione tra radiazioni e materia: ecco perché si descrive
come spettrometria di massa (e non come spettroscopia di massa).

Le applicazioni attuali della spettrometria di massa sono estremamente vaste e vanno


dall’indagine isotopica (determinazione dell’origine geografica degli alimenti), allo studio degli
inquinanti ambientali, delle tracce di esplosivo su tessuti, e ancora all’indagine sulla struttura delle
molecole organiche delle più semplici fino alle macromolecole di origine biologica o, addirittura,
ai virus.
Essa è impiegata soprattutto nel campo farmaceutico e nel settore di controllo della qualità ed
è spesso associata a tecniche di separazione, come HPLC e gascromatografia (GC).

1.2 COMPONENTI SPETTROMETRO DI MASSA E RISOLUZIONE


In uno spettrometro di massa il campione è prima ionizzato (nella sorgente o camera di
ionizzazione); gli ioni risultanti sono poi separati in funzione del loro rapporto massa/carica (m/z)
nell’analizzatore. Tutti gli analizzatori di massa richiedono per il loro funzionamento un vuoto
elevato. Quelli più moderni sono largamente modulari: attorno ad un sistema di vuoto e ad un
analizzatore può essere assemblato uno strumento con diversi sistemi di introduzione del
campione e/o di ionizzazione (sorgente). Tutti gli spettrometri sono comunque costituiti
essenzialmente da tre parti:

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 una camera di ionizzazione o sorgente,
 un analizzatore,
 un rivelatore.

Ionizzatore Analizzatore Rivelatore Sistema Spettro


Campione (sorgente) Elaboraz. di massa
dati

Pompa a vuoto

L’introduzione del campione, e quindi la sua vaporizzazione, può avvenire sotto alto vuoto
(10-6 - 10-7 mmHg), per impedire una perdita di ionizzazione per urto con i gas atmosferici. Il
campione può essere introdotto sotto diverse forme fisiche:
- i gas si trovano già nella forma fisica adatta,
- i solidi e i liquidi vengono prima vaporizzati,
- nei casi di sostanze poco volatili si ricorre a derivatizzazione o a desorbimento da matrici.
Le molecole vaporizzate vengono inviate alla camera di ionizzazione che si trova a pressione
inferiore.

Una delle caratteristiche più importanti di uno spettrometro di massa, è rappresentata dalla
“risoluzione”. Vediamo in cosa consiste.

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Strumenti a bassa risoluzione: R < 5000
Strumenti ad alta risoluzione: R > 5000

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Esempio lo spettro di massa della proinsulina bovina di formula molecolare C381H586N107O114S6 non mostra
un solo picco corrispondente allo ione molecolare [M+H]+ a m/z 8676.1 (massa monoisotopica), ma un
insieme di picchi che tengono conto della distribuzione isotopica. Il picco a maggiore intensità ha massa
nominale di 8681 ed è esso stesso costituito da 10 differenti specie isotopiche. In totale i picchi presenti
nello spettro contengono 62 specie isotopiche.

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Componenti dello spettrometro

Sorgente Analizzatore Rivelatoree

Sorgenti:
 Sorgente EI (impatto
elettronico)
 Sorgente CI
(ionizzazione chimica)
 Sorgente FAB (fast atom
bombarment)
 Sorgente electrospray
 Sorgente MALDI m/z
(Matrix Assisted Laser
Desorption and Spettro
Ionization).
Sistema di
elaborazione

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1.3 CAMERA DI IONIZZAZIONE o SORGENTE

Se una molecola è investita in fase vapore da un fascio di elettroni di notevole energia cinetica
si può avere, per effetto dell’urto con questi ultimi, la sua ionizzazione a ione positivo o negativo. In
genere gli strumenti sono regolati per lavorare unicamente con ioni positivi, i quali possono
decomporsi in una serie di frammenti di massa inferiore. Ogni molecola avrà quindi una sua
frammentazione caratteristica e specifica che dipenderà sia dalla natura delle molecole sia dalle
condizioni operative di ionizzazione.
Tra i vari dispositivi presenti, alcuni consentono di analizzare solo frammenti positivi, altri
invece, permettono la rivelazione anche di ioni negativi. Inoltre alcune tecniche di ionizzazione
sono decisamente drastiche, operano cioè ad alta energia e portano ad una frammentazione spinta
(TECNICHE HARD), altre invece operano a bassa energia, producendo un numero inferiore di ioni
(TECNICHE SOFT).
In base al tipo di sorgente utilizzata la ionizzazione primaria del campione viene realizzata in
vario modo. Le tecniche più utilizzate sono:
- impatto elettronico (E.I., tecnica hard) ,

- ionizzazione chimica (C.I., tecnica soft),

- bombardamento con atomi veloci (F.A.B., tecnica soft),

- desorbimento con laser (M.A.L.D.I., tecnica soft),

- electrospray (E.S.I., tecnica soft)

1.4 ELECTRON IMPACT (E.I)


Nella spettrometria di massa la tecnica più nota (la prima sviluppata) è la ionizzazione per
impatto elettronico, una tecnica di ionizzazione hard che, proprio per l’alta energia in gioco, oltre a
ionizzare una molecola, generalmente ne provoca anche una estesa frammentazione.
Nella camera di ionizzazione ( 106  107 mmHg) le molecole del campione da analizzare, in
fase gassosa, interagiscono con un fascio di elettroni generato da un filamento incandescente (renio
o tungsteno: sorgente) ed accelerato attraverso un potenziale elettrico regolabile dall’operatore
(acceleratore). L’energia del fascio è normalmente fissata a 70 eV. Nella sorgente ad impatto
elettronico l’analita deve essere allo stato gassoso, il che pone dei limiti all’applicabilità del metodo
con alcuni materiali biologici (peptidi, proteine, zuccheri). L’interazione degli elettroni con le
molecole della sostanza può provocare due situazioni diverse:

- perdita di un elettrone dalla sostanza, con la formazione di un “radical catione”;


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- oppure l’elettrone viene ceduto alla sostanza formando un “radical anione”.
L’evento più probabile è che si formi il radical catione per questioni energetiche. Gli spettri
E.I. sono registrati, generalmente, con lettura su ioni positivi.

sorgente acceleratore
analizzatore
sorgente

1.4.1 MECCANISMO DI IONIZZAZIONE


La molecola allo stato gassoso M (gas) impatta con un elettrone (e  ) e dà luogo ad una

 
specie radical cationica M . ( gas) più due elettroni

M(gas)+e   M (gas
.
) +2e

L’energia cinetica viene trasferita al sistema provocando una transizione elettronica fino ad
orbitali di livello così elevato da sfuggire ai nuclei e quindi l’elettrone viene perso.

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La molecola carica (M  . ) è sia un radicale perché ha un e  spaiato, ma è anche un catione
perché ha un protone non bilanciato. La specie M  . , detta IONE MOLECOLARE, è molto instabile,
e, a causa dell’eccesso di energia, si decompone ulteriormente in frammenti più piccoli con rapporto
m/z sempre più basso. Anche questi frammenti possono essere instabili e frammentarsi
ulteriormente; la frammentazione porta alla formazione di una serie di molecole e/o radicali neutri,
che non vengono rivelati dallo strumento, e una serie di ioni figli (cationi e/o radical cationi) che
vengono separati e poi rivelati in uno spettro di massa. Per limitare la frammentazione è possibile
ridurre l’energia del fascio elettronico a valori minori di 70 eV (ad es.: 16 eV).

1.6 SORGENTI DI IONIZZAZIONE ALTERNATIVE


Esistono numerose sorgenti di ionizzazione diverse che hanno un vasto impiego nel campo
analitico. Gli apparecchi hanno un enorme spettro di azione e gamma di ionizzazione. In genere le
sorgenti di ionizzazione alternative a quelle di tipo “impatto elettronico” sono utilizzate per
molecole ad alto peso molecolare e/o termolabili.

1.5.1 CHEMICAL IONIZATION (C.I.)


La ionizzazione chimica utilizza una sorgente ad impatto elettronico, ma determina una piccola
frammentazione del campione, dando luogo a spettri più chiari. E’ particolarmente vantaggiosa
nella determinazione delle masse molecolari, dal momento che vengono prodotti ioni molecolari o
pseudomolecolari (uno ione genitore protonato) con elevata intensità. Essa si basa su fenomeni
chimici e non fisici: non abbiamo elettroni ad alta velocità che impattano sulla molecola da rivelare,
ma dei reagenti chimici (metano, etilene protonati) che inducono la molecola a caricarsi.
La struttura della sorgente è essenzialmente la stessa usata in E.I., ma la camera viene riempita
da un gas idoneo, ad esempio metano.

La formazione di ioni per impatto elettrico a partire dal metano origina la specie CH 4 . :
.
CH 4  e   CH 4  2e 

Lo ione molecolare del metano può reagire con l’eccesso di metano formando CH 5 :

CH 4  CH 4.  CH 3.  CH 5

oppure subire una frammentazione e dividersi in catione metile e radicale idrogeno:


CH 4.  CH 3  H .

Lo ione metile può impattare col metano e formare un etilene protonato C 2 H 5 liberando

idrogeno CH 3  CH 4  C 2 H 5  H 2

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Le specie formate nei due percorsi CH 5 e C 2 H 5 sono acidi fortissimi, possono quindi protonare
con una reazione acido-base, praticamente qualsiasi molecola organica che viene introdotta nella
camera. L’impatto di una molecola gassosa (M(gas)) con una delle due specie protonate, provoca il
trasferimento di un protone e genera uno ione MH  detto pseudomolecolare molto più stabile dello
ione molecolare per cui la sua frammentazione risulta essere estremamente limitata:
M  gas  CH 5  MH gas  CH 4

M  gas  C2 H 5  MH gas  C2 H 4

Per questo motivo lo spettro risultante è molto chiaro e possiamo distinguere nettamente il picco
molecolare. Questa tecnica accompagna spesso quella dell’E.I. in cui non è sempre presente il
segnale relativo al picco genitore a causa della sua decomposizione.

1.5.2 FAST ATOM BOMBARDMENT (F.A.B.)


L’avvento del metodo di ionizzazione F.A.B. ha rivoluzionato la spettrometria di massa,
rendendola utilizzabile nella ricerca biologica (tecnica utilizzata dagli anni ’80 in poi e in seguito
soppiantata dall’ESI e dal MALDI). Questa tecnica, che a differenza delle tecniche viste
precedentemente non utilizza elettroni e neanche una camera riempita di gas, si basa sul
bombardamento dell’analita, una volta disperso in una opportuna matrice, con un fascio ionizzante
di atomi neutri ad elevatissima energia cinetica. I composti che si intende analizzare sono miscelati
con una matrice viscosa e poco volatile (costituita da glicerolo, tioglicerolo, nitrobenzil alcol).
La tecnica FAB riesce ad evidenziare molto bene gli ioni pseudomolecolari di composti con
elevata massa o molto polari e poco volatili. Per questo motivo risulta del tutto complementare alle
tecniche precedenti.

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La miscela (analita-matrice) posta su una sonda opportuna, viene introdotta nella camera della
sorgente, dove viene fatto il vuoto e dove viene bombardata con una pistola che spara atomi neutri
che si muovono ad alta velocità (atomi pesanti come xenon e ioni cesio). L’impatto degli atomi
contro la miscela proietta via molecole di analita. Il fatto che le matrici siano liquide determina un
continuo ricambio della superficie che viene bombardata dagli atomi veloci.

In questo modo gli ioni sono prima solvatati dalle molecole della matrice e il fenomeno della
frammentazione viene notevolmente limitato. Si verifica, localmente e per un tempo brevissimo, un
notevole innalzamento della temperatura, tale incremento termico risulta troppo breve per causare la
rottura dei legami chimici ma è sufficientemente per permettere la ionizzazione dei composti da
analizzare. La successiva frammentazione della sostanza permette di ottenere uno spettro di massa
che contiene molte informazioni di tipo strutturale. Possono essere prodotti spettri di massa positivi
e negativi.
I vantaggi della tecnica F.A.B. sono molteplici:
1. gli ioni possono essere generati da campioni a Tamb: non è richiesta la volatilizzazione.
2. possono essere prodotte: - molecole,
- ioni pseudomolecolari (molecole cariche per effetto della
protonazione o per l’aggiunta di ioni sodio o potassio nella
matrice),
- frammenti (ioni positivi o negativi),
3. la sensibilità del campione è alta,
4. la tecnica è particolarmente applicabile a biomolecole con alto peso molecolare (proteine,
acidi nucleici, ecc.) e a composti termicamente instabili,
5. la sorgente è relativamente semplice, i voltaggi richiesti sono inferiori a 10 KV.

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1.5.3 MATRIX-ASSISTED LASER DESORPTION IONISATION (M.A.L.D.I.)
Questa tecnica è basata essenzialmente sulla ionizzazione di un campione per desorbimento
effettuato con laser. Concettualmente è molto simile al FAB: anche in questa tecnica, infatti, gli
analiti sono associati a matrici. La differenza consiste nel processo di allontanamento dello ione
della matrice: mentre nel FAB avviene in seguito ad un bombardamento con atomi veloci, nel
MALDI è l’irradiazione con laser che permette alle molecole poste sulla superficie della matrice di
essere proiettate ad alte velocità nell’analizzatore. In genere questa tecnica viene associata ad
analizzatori basati sul principio del tempo di volo (Time of Flight, T.O.F.). Nei prossimi capitoli
vedremo le caratteristiche dell’analizzatore T.O.F.

A questo punto conviene solo accennare che in questo tipo di analizzatore (la parte dello
spettrometro di massa che separa gli ioni carichi in funzione del loro rapporto massa/carica) gli ioni
sono separati in base al tempo necessario per compiere un determinato percorso. Una volta formati
questi possiedono la stessa energia cinetica, ma una diversa velocità a seconda del rapporto m/z.
Lasciandoli correre perciò in una regione libera da campi (un tubo sotto vuoto spinto) essi
raggiungeranno il rivelatore in tempi diversi. Il tempo di volo è inversamente proporzionale alla
massa degli stessi ioni carichi: maggiore è la loro massa, più saranno lenti.
Come già accennato, anche nella tecnica MALDI il campione è dissolto in un’adatta matrice
solvente. Le fasi che portano alla rivelazione del composto analizzato sono:
a) irradiazione mediante laser delle molecole della miscela (matrice - analita),

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b) espulsione di un aggregato analita-molecole di matrice.
c) desolvatazione con conseguente trasferimento di un protone (reazione acido-base tra
matrice e analita).
Il processo ora può andare in due direzioni potremo analizzare molecole cariche
positivamente o negativamente, a seconda del processo avvenuto. In genere si ha il trasferimento di
un protone dalla matrice all’analita; come nella tecnica FAB anche nella tecnica MALDI il processo
di osservazione in modo positivo è quello più frequente.

Le matrici più importanti sono degli acidi organici che assorbono all’UV:

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1.5.4 ELECTROSPRAY (E.S.)
La sostanza è introdotta in soluzione (metanolo, acqua) in un ago capillare e ne fuoriesce sotto
forma di aerosol. Tra l’ago e il mantello della camera (elettrodo cilindrico) è creata una differenza
di potenziale di alcuni KV che induce sulle goccioline un eccesso di carica positiva. A causa delle
loro ridotte dimensioni, il solvente evapora rapidamente da ogni gocciolina che diventa sempre più
piccola; la densità di carica aumenta finché diventa così alta da determinare l’esplosione di ioni di
soluto dalla gocciolina (esplosione coulombiana). Gli ioni così prodotti sono poi spinti attraverso un
sistema di fenditure fino ad entrare nella zona a bassa pressione dove sono accelerate verso
l’analizzatore.

Una delle caratteristiche dell’ESI è la possibilità di generare ioni multicarica.. Il numero di cariche
assunte dalla molecola dipende sia dalla presenza di gruppi basici che dal pH del solvente. Se la
specie è policarica, dal punto di vista dello spettrometro di massa, si comporta come una specie “a
massa più bassa” . In questo caso il rapporto m/z non sarà uguale a 1 .
Con z = 1 lo spettro è effettivamente lo spettro di massa. Lo spettro ESI si presenta come una
distribuzione di picchi tutti derivanti dalla stessa molecola, ma con diverse cariche.
Nello spettro della mioglobina, mostrato sotto, si vede chiaramente la distribuzione gaussiana
degli ioni multicarica e i corrispondenti valori di m/z.

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Spettro ESI della mioglobina da cuore di cavallo (PM: 16950.7)
Successivamente lo spettro multicarica viene trasformato matematicamente (deconvoluzione)
dal computer per generare lo spettro “deconvoluto”, in cui appare il valore del PM della proteina.

Deconvoluzione dello spettro ESI multicarica della mioglobina.

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1.5.5 TECNICA DELLO ZOOM-SCAN
Per peptidi di massa incognita, è possibile stabilire il numero di cariche dello ione dal valore di
m/z del primo picco isotopico (M+1). Ad esempio per un peptide di massa incognita registriamo
uno ione molecolare a m/z 1001. In tal caso potremmo trovarci nel caso che il peptide pesi 1000 e lo
ione molecolare corrisponda allo ione [(M+H)]+, oppure il peptide pesi 2000 ed ha addizionato 2
cariche [(M+2H)]+2 (m/z 1001). La soluzione a questo problema può essere trovata considerando il
primo picco isotopico (generalmente associato alla presenza dei 13C).
Nel primo caso, infatti (quando il peptide pesa 1000), il picco isotopico sarà a valori di m/z
1002 ([(M+H)]+ + una unità dovuta all’isotopo).
Nel secondo caso (quando il peptide pesa 2000 ed ha due cariche), cercando un picco
isotopico a m/z 1002, non lo troveremo! Ci sarà, invece, un picco a valori di m/z 1001.5. Ciò perché
il composto che pesa 2000 risulta legato a due protoni pesando 2002. Se di questo si considera il
picco isotopico, che corrisponde a 2003 ed il fatto che questa molecola ha due cariche, il rapporto
m/z sarà: 2003 : 2, ossia: 1001.5. Poiché non possono esistere molecole con mezzi protoni o
neutroni, vuol dire che abbiamo a che fare con una molecola doppiamente carica.
Per rilevare con precisione masse frazionarie, occorre un apparecchio in grado di lavorare ad
alta risoluzione. La tecnica utilizzata è denominata:ZOOM SCAN, in quanto deve essere ingrandita
la parte relativa ai picchi isotopici della molecola e vedere se ci sono masse frazionarie.

1.6 ANALIZZATORI
L’analizzatore è quella porzione dello spettrometro di massa in cui avviene la selezione degli
ioni formati nella sorgente di ionizzazione. Tale selezione si verifica sulla base del rapporto m/z. Gli
ioni con differente m/z arriveranno al rivelatore in tempi diversi, apparendo nello spettro a valori
differenti. Così come per le sorgenti di ionizzazione, la tecnologia in questo settore ha sviluppato
vari tipi di analizzatori, dotati di caratteristiche diverse, ma con performance sempre maggiori.
Gli analizzatori possono essere classificati in base al modo in cui effettuano la selezione ionica in:
1) Analizzatori a deflessione magnetica,
2) analizzatori a quadrupolo,
3) analizzatori a tempo di volo (TOF),

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1.6.1 Analizzatori a deflessione magnetica
Negli analizzatori a focalizzazione magnetica si parla di “settore a singola focalizzazione”
quando l’analizzatore sfrutta il solo campo magnetico per effettuare la selezione degli ioni in base al
rapporto m/z. Questi strumenti non riescono a raggiungere un’elevata risoluzione (circa 4-5000).
La separazione degli ioni si realizza in base alla relazione fondamentale della spettrometria di
massa:

Per un dato valore di campo magnetico H, di potenziale di accelerazione V (indotto per


estrarre gli ioni dalla camera di ionizzazione) e di rapporto massa/carica (m/z), corrisponde un
raggio di curvatura specifico r, che si realizza all’interno del settore magnetico dello spettrometro di
massa. Variando gradualmente il valore di campo magnetico (H), vengono rivelati, man mano, tutti
gli ioni formati nella camera di ionizzazione presentanti diverso rapporto m/z.

Aggiungendo, prima dell'analizzatore magnetico, un filtro elettrostatico, il percorso degli ioni


positivi viene focalizzato ulteriormente in direzione dal campo elettrico statico.
In questo tipo di apparecchi (denominati “a doppia focalizzazione”) la risoluzione può
raggiungere 150˙000 e oltre (vedi figura in basso). Ciò permette di misurare la massa esatta fino alla
quarta cifra decimale. Gli spettrometri ad alta risoluzione di questo genere sono apparecchiature
molto costose, e quindi il loro impiego non è molto diffuso per misure di routine. Per misure più
veloci sono stati realizzati gli spettrometri a quadrupolo.

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1.6.2 Analizzatori a quadrupolo
L’analizzatore quadrupolare è schematicamente costituito da quattro barre di metallo (v.
figura sotto). Alle barre opposte del quadrupolo è applicata una differenza di potenziale, generata da
una corrente continua ed alternata. Gli ioni, a causa di tale differenza, subiranno nel loro transito
delle oscillazioni, che potranno essere stabili, permettendo così allo ione di uscire dal quadrupolo, o
instabili e porteranno alla collisione dello ione con le barre del quadrupolo. A determinati valori
della tensione applicata, solo ioni aventi un certo rapporto m/z usciranno dal quadrupolo stesso.
Variando nel tempo la tensione applicata, tutti gli ioni saranno messi in condizione di uscire (in
tempi diversi) dal quadrupolo. La risoluzione di questi analizzatori generalmente è nell’ordine di 5-
10.000).

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1.6.3 Analizzatori a tempo di volo (TOF)
Il principio su cui si basa questo analizzatore è che ioni di differente valore m/z hanno
uguale energia cinetica (1/2 mv2), ma differente velocità dopo l’accelerazione subita all’uscita della
camera di ionizzazione. Ne deriva che il tempo che ciascuno impiega ad attraversare l’analizzatore
è differente. Basandosi proprio su questi tempi è possibile assegnare il valore di m/z per i vari ioni.
In pratica, gli ioni provenienti dalla sorgente, vengono accelerati da un forte campo elettrico,
e percorrono l’analizzatore, che ha la forma di un tubo in cui è fatto un alto vuoto, in base alla
velocità dovuta alla loro energia cinetica. Così gli ioni che hanno il rapporto m/z minore arriveranno
al rivelatore prima di quelli più pesanti.
Questo analizzatore, a differenza degli altri, riesce a coprire un’ampia regione spettrale ed ha
un’alta sensibilità. Il potere risolutivo, che fino a pochi anni fa rappresentava il punto debole di
questi analizzatori, può raggiungere anche valori nell’ordine di 104 (reflectron TOF).

1.7 IL RIVELATORE
Come collettore e rivelatore degli ioni si usa comunemente un moltiplicatore elettronico,
costituito da una serie di elettrodi in cascata. Quando uno ione arriva sul primo elettrodo questo
emette un fascio di elettroni che vanno a colpire il secondo elettrodo, il quale a sua volta emette una
quantità maggiore di elettroni e così via. Il risultato è una forte amplificazione del segnale che viene
poi digitalizzato ed elaborato infine dal calcolatore dello spettrometro per la presentazione dello
spettro di massa.

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1.8 ANALISI DI UNO SPETTRO DI MASSA
Questo paragrafo riguarda principalmente l’interpretazione di spettri di massa di semplici
molecole ottenuti dopo ionizzazione per impatto elettronico.
L’impiego di metodi di ionizzazione alternativi (CI, ES, MALDI, ecc) e la registrazione di
spettri di ioni negativi è sempre più diffusa ma solo in particolari campi.
Lo spettrometro “consegna” i risultati sotto forma di uno spettro di massa, cioè di una serie di
picchi di intensità variabile, la posizione di ogni picco corrisponde ad un determinato valore di m/z.
In uno spettro di massa, l’asse delle x riporta valori di rapporto m/z e l’asse delle y valori di
abbondanza relativa degli ioni analizzati.
Un semplice esempio è rappresentato dal n-decano e dai suoi principali prodotti di
frammentazione.

L’intensità dei picchi sono espresse in percentuali del picco più intenso il cosiddetto picco
base cui si assegna arbitrariamente il valore 100. Gli spettri prodotti con questa tecnica sono
normalizzati ed essendo indipendenti dallo strumento impiegato, sono comparabili direttamente con
database di spettri presenti nel sofware dell’apparecchiatura: in questo modo l’assegnazione
strutturale dei composti risulta estremamente facilitata.
Se la risoluzione dello strumento è sufficientemente elevata, è possibile determinare anche la
massa esatta dei singoli ioni, dalla quale si può dedurre la composizione elementare dello ione
stesso. Dallo spettro di massa si può risalire alla struttura di un composto incognito, attribuendo ai

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singoli ioni una composizione elementare e ricostruendo i meccanismi di frammentazione seguendo
schemi tipici per le varie classi di composti.
Nell’interpretazione di uno spettro si segue una procedura abbastanza semplice:
1. identificazione dello ione molecolare,
2. identificazione di ioni caratteristici,
3. identificazione di processi di frammentazione caratteristici,
4. ricostruzione della struttura della molecola sulla base della conoscenza di meccanismi di
frammentazione standard.

1.9 DETERMINAZIONE DELLA STRUTTURA E DEL PESO MOLECOLARE


Lo ione molecolare si genera dalla molecola originale M per eliminazione di un elettrone:

+ e-
+
M M

La sua massa è praticamente uguale a quella della molecola originaria, dato che la perdita di
massa dovuta all'espulsione dell'elettrone è trascurabile. In pratica, assegnando con certezza il picco
dello ione molecolare di una sostanza pura si determina immediatamente la massa molecolare M.
Però il picco può essere poco intenso o addirittura assente nel caso di molecole facilmente
frammentabili. La sua intensità è maggiore per molecole lineari e minore per molecole ramificate.
In generale si osserva la seguente graduatoria di intensità per le diverse classi di composti organici:

- Picco molto intenso aromatici > olefine coniugate > aliciclici > alcani a catena lineare corta.
- Picco poco intenso chetoni > ammine >esteri >eteri > acidi, aldeidi, ammidi, alogenuri.
- Picco assente molecole ramificate, alcoli terziari, nitrili, nitrocomposti.

Nel dubbio si può ricorrere alla misura alternativa dello spettro utilizzando le tecniche di
ionizzazione chimica, all’ESI o al MALDI. Queste, essendo più blande dell'impatto elettronico
danno poca frammentazione e un picco intenso corrispondente a massa M + 1 (M più protone).
Quest’ultimo è denominato “picco pseudomolecolare”.
In certi casi l'identificazione del picco dello ione molecolare può essere verificata con la
cosiddetta regola dell'azoto, secondo cui una molecola contenente un numero dispari di atomi di
azoto ha massa molecolare dispari, mentre una molecola senza azoto o con un numero pari di atomi
di azoto ha massa molecolare pari.

21
1.9.1 ISOTOPI
La maggior parte degli elementi che compongono i composti organici possiede diversi isotopi
naturali, di cui di solito il più leggero è il più abbondante. Per tre elementi – carbonio, idrogeno e
azoto – il principale isotopo pesante è quello la cui massa è superiore di un’unità a quella
dell’isotopo più comune. Quando questi elementi sono presenti in un composto organico lo spettro
di massa mostra dei piccoli picchi isotopici a M+1. Nel caso di ossigeno, zolfo, cloro e bromo, le
masse dei principali isotopi pesanti sono superiori di due unità a quelle degli isotopi più abbondanti.
Perciò la presenza di questi elementi è rivelata dai picchi isotopici a M+2.
Dallo studio dei picchi isotopici e conoscendo le percentuali di abbondanza naturale dei vari
isotopi, è possibile risalire alla formula molecolare. Inoltre la presenza di alcuni atomi come cloro e
bromo, che hanno composizioni isotopiche peculiari (35Cl e 37
Cl 3:1; 79
Br e 81
Br circa 1:1), può
facilmente essere ipotizzata osservando le intensità dei picchi isotopici dello ione, che
rispecchieranno quelle relative all’abbondanza naturale dell’atomo in questione. (v. esempi)

Abbondanza isotopica relativa di elementi più comuni

Isotopo 1 Abbondanza Isotopo 2 Abbondanza Isotopo 3 Abbondanza

1 2
H 100 H 0.016
12 13
C 100 C 1.11
14 15
N 100 N 0.38
16 17 18
O 100 O 0.04 O 0.2
19
F 100
28 29 30
Si 100 Si 5.10 Si 3.35
31
P 100
32 33 34
S 100 S 0.78 S 4.40
35 37
Cl 100 Cl 32.5
79 81
Br 100 Br 98.0
127
I 100

22
23
1.10 FRAMMENTAZIONE DEGLI IONI POSITIVI

La formazione preferenziale di alcuni ioni, a partire dallo ione molecolare, dipende dagli
stessi fattori che regolano la reattività nella chimica organica.
Frammentazioni (rottura di un legame semplice tra due atomi) e trasposizioni o
riarrangiamenti (frammentazione contemporanea di più legami) possono essere compresi
valutando fattori quali:
1) FORZA DEI LEGAMI CHE TENGONO UNITI GLI ATOMI (i legami più
deboli si rompono prima)
2) STABILITA’ DEI PRODOTTI GENERATI (ioni stabilizzati per effetto induttivo
o di risonanza si formano più facilmente).
Prima di valutare in maggior dettaglio tali fattori è necessario premettere che UNO IONE
MOLECOLARE può DECOMPORSI IN MODO:
A) OMOLITICO o
B) ETEROLITICO.
- La rottura OMOLITICA avviene per trasferimento di un solo elettrone ed è indicata da
frecce ad amo. Es.:

+ +
CH3 CH2 O R H3C + CH2 O R

H3C
+
CH3 + CH3C O+ CH3C O
+

O
H3C
- La rottura ETEROLITICA avviene per trasferimento di una coppia di elettroni. In questo
caso si usa la freccia classica. Es.:

+ +
CH3 CH2 Br CH3 CH2 + Br

E’ importante ricordare che quando una molecola si frammenta un singolo legame si ottengono
frammenti carichi dispari, se la molecola ha un peso molecolare pari (si ottengono frammenti
carichi pari, se la molecola ha un peso molecolare dispari). Nel caso di trasposizioni o
riarrangiamenti (ossia quando sono coinvolti più legami) si ottengono prodotti di trasposizione (o
riarrangiamento) carichi pari, se la molecola ha un peso molecolare pari (si ottengono prodotti di
trasposizione carichi dispari, se la molecola ha un peso molecolare dispari).
Va ricordato che le molecole organiche (contenenti solo C, H e O) con un numero dispari di azoti
(1, 3, 5…) hanno pesi molecolari dispari; molecole organiche con un numero pari di azoti hanno

24
pesi molecolari pari (REGOLA DELL’AZOTO: un composto con un numero dispari di atomi di azoto
ha peso molecolare di valore dispari, un composto con un numero pari di atomi di azoto ha peso molecolare di
valore pari).

1.11 FATTORI CHE STABILIZZANO UNO IONE

Quanto più stabili sono lo ione o il frammento neutro che si formano in un dato processo di
frammentazione, tanto è più probabile quella via rispetto a possibili altre. I fattori responsabili della
STABILIZZAZIONE DI UNO IONE sono associabili a tre effetti (già visti in chimica organica):
1) EFFETTO INDUTTIVO (O DI IPERCONIUGAZIONE)
2) EFFETTO DI RISONANZA
3) EFFETTO DELLA COMPARTECIPAZIONE DI DOPPIETTI ELETTRONICI
VICINI.
Nel seguente paragrafo tali effetti saranno analizzati separatamente.

1) EFFETTO INDUTTIVO. Questo effetto si basa sulla tendenza che hanno alcuni composti a
formare carbocationi stabili. Ciò permette l’allontanamento dell’elettrone spaiato di un
radicalcatione, determinando la formazione di una carbocatione stabile (rivelato dallo
spettrometro di massa) e un radicale neutro. Un esempio classico è la frammentazione del 2,2-
dimetilbutano. La via preferita è sicuramente la b) in quanto porta alla formazione del
carbocatione terz-butile, che è relativamente stabile. La via porta, invece, ad un carbocatione
primario, che risulta estremamente instabile.
CH3
+
a)
CH3 C + CH3 CH2
CH3
a) carbocat.
CH3 primario
CH3 C CH2 CH3
b) CH3
CH3 +
b)
CH3 C + CH3 CH2
carbocat.
terziario CH3

In un altro esempio l’effetto della presenza di gruppi elettronegativi si manifesta con


l’attrazione degli elettroni del legame adiacente. Ciò determina l’autoeliminazione dell’atomo
elettronegativo come radicale e contemporanea formazione del carbocatione complementare.

25
+ +
R Cl R + Cl
+ +
R OCH3 R + OCH3

L’ordine di efficacia degli atomi elettronattrattori (ad indurre la frammentazione) è il


seguente:

Cl > Br > O, S > I >N.

2) EFFETTO DI RISONANZA. Questo è uno dei fattori più importanti che giocano nella
frammentazione in quanto gli ioni stabilizzati per risonanza si formano con grande facilità.
La formazione di frammenti cationici di tipo allilico e benzilico è frequente. Un esempio di
tale effetto si riscontra in un idrocarburo insaturo come il butene. In questo caso si può
prevedere un cammino che contempla la rottura di un legame con formazione di un catione
vinilico (via a); improbabile) e una frammentazione che porta a un carbocatione allilico (via
b); plausibile).
+
b) a) a) H3C CH2 + CH CH2
carbocat.
vinilico
CH3 CH2 CH CH2

b) +
CH3 + CH2 CH CH2

+
H2C CH CH2
carbocat.
allilico

Nel caso del propilbenzene la situazione è simile:


H H

ALLARGAMENTO
ANELLO
E SHIFT IDRURO
H

H H

H H

H H

Catione tropilio (m/z = 91)

Si forma il catione tropilio che è facilmente riconoscibile per il suo valore a m/z = 91.

26
3) EFFETTO DELLA COMPARTECIPAZIONE DI DOPPIETTI ELETTRONICI
VICINI. Tale effetto può essere fatto rientrare in quello di risonanza. La compartecipazione
di doppietti elettronici vicini è dovuta alla presenza di un eteroatomo che contiene un
doppietto elettronico non condiviso (N, O, S). Il doppietto dell’eteroatomo può stabilizzare
lo ione per rottura del legame C— C tramite la formazione di uno ione onio stabilizzato
dalla risonanza e dalla presenza di un doppio legame:

+ +
CH3 CH2 CH2 NH2 H3C CH2 + CH2 NH2

1.12 FRAMMENTAZIONI A PIÙ CENTRI


Le frammentazioni viste in precedenza vengono indicate con il termine di frammentazioni
semplici in quanto coinvolgono la rottura di un solo legame.
Nelle molecole complesse, l’interazione tra i vari gruppi funzionali può portare a complicate
reazioni di frammentazione che coinvolgono la rottura di più di un legame. Tra le frammentazioni
più comuni ricordiamo quelle che coinvolgono la MIGRAZIONE DI UN IDROGENO CON
ESPULSIONE DI UN FRAMMENTO NEUTRO (REAZIONE DI ELIMINAZIONE E
RIARRANGIAMENTO DI McLAFFERTY) e la reazione di riassestamento dei legami
all’interno di una molecola (RETROREAZIONE DI DIELS-ALDER).
Vediamole singolarmente.

1) REAZIONE DI ELIMINAZIONE
Tale reazione di frammentazione può verificarsi in alcoli, alogenuri, ammine, eteri, tioli e
può, genericamente, essere riportata come segue:

CH2
+
X
+
HX
CH2 X

CH2 CH2 H
n n

CH H CH
R R
+
CH2 CH2

CH2 CH2 X = Cl, Br, I, OH,


n n OR, NH2, NHR, SH
CH CH
R R

27
2) RIARRANGIAMENTO DI Mc LAFFERTY
Il riarrangiamento di Mc Lafferty si verifica nei composti che possiedono un atomo di
idrogeno in posizione  rispetto all’atomo sede della carica positiva e del centro radicalico. Si può
osservare in composti contenenti CARBONILI (aldeidi, chetoni, esteri, ammidi, acidi carbossilici),
DERIVATI AZOTATI DEL GRUPPO CARBONILICO (ossame, idrazoni, immine), oltre a
olefine, alchilbenzeni, alchileteri.

+
H + H H
+
O CH R O O HC R
+
C CH R C C HC R
R R R
CH CH
CH
R R R

3) RETROREAZIONE DI DIELS-ALDER
Questa è una frammentazione estremamente comune nello spettro di massa delle OLEFINE
CICLICHE. In genere si ottiene un frammento dienico carico positivamente e un frammento
olefinico neutro.

28
1.13 Elenco dei frammenti ionici più comuni

14 CH2
15 CH3
16 O
17 OH
18 H2O, NH4
19 F
26 CN, C2H2
27 C2H3
28 C2H4, CO
29 C2H5, CHO
30 CH2NH2
31 CH2OH
32 O2
33 SH
34 H2S
35 Cl
36 HCl
39 C3H3
41 C3H5
42 C3H6, C2H2O
43 C3H7, CH3C=O
44 CH2CHO
45 CH3CHOH, CH2CH2OH, CH2OCH2
46 NO2
47 CH2SH
48 CH3S + H
49 CH2Cl
51 CHF2, C3H3
53 C4H5
54 CH2CH2CN
55 C4H7
56 C4H8
57 C4H9, C2H5C=O
58 CH3C(=O)CH2 + H, C2H5CHNH2
59 C3H6OH, CH2OC2H5
60 CH2COOH
61 CH3COO
65 C5H5
66 C5H6
67 C5H7
68 CH2CH2CH2CN
69 C5H9, CF3
70 C5H10
71 C5H11, C3H7C=O
76 C6H4
77 C6H5
78 C6H5 + H
79 C6H5 + 2H, Br
91 C7H7

29
1.14 Elenco dei frammenti neutri più comuni
17 HO•
18 H2O
19 F•
20 HF
26 CHCH, •CN
27 CH2=CH•, HCN
28 CH2=CH2, CO
29 •CH2CH3, •CHO
30 NH2CH2•, CH2O, NO, C2H6
31 •OCH3, •CH2OH, CH2NH2
32 CH3OH, S
33 HS•, (•CH3 + H2O)
34 H2S
35 Cl•
36 HCl, 2 H2O
37 H2Cl
38 C3H2, C2N, F2
39 C3H3, HC2N
40 CH3CCH
41 CH2=CHCH2•
42 CH2=CHCH3, CH2=C=O
43 C3H7, CH3C•=O

30
Capitolo 2. Spettroscopia Infrarossa (IR)

2.1 Introduzione
Da questa tecnica spettroscopica si ricavano informazioni sui gruppi funzionali presenti nella
molecola. La porzione IR dello spettro elettromagnetico copre un segmento che va dai confini del
visibile 0.8 m fino a circa 300 m. La porzione utilizzata a scopi analitici dal chimico organico è la
porzione mediana che va da 2.5 m fino a 20 m.

Negli spettri IR (a differenza di quelli UV) in ascissa non sono riportate le lunghezze d’onda, bensì le
frequenze espresse in numeri d’onda ( ) anziché in Hertz. Il numero d’onda è espresso in cm-1 e si
ricava come l’inverso della lunghezza d’onda.

Il range spettrale varia tra i 4.000 e i 400 cm-1.


Va ricordato che la radiazione IR tra 10.000 e 100 cm-1 è assorbita e convertita dalla molecola
organica in energia di moto vibrazionale. L’interazione tra moti vibrazionali e campo elettrico
associato alla radiazione IR è rappresentata in Figura 1:

Figura 1: interazione tra l’oscillazione di un dipolo associato a una molecola biatomica (es. H-Cl) e
campo elettrico associato alla radiazione IR

Solo le vibrazioni che provocano una variazione di momento di dipolo del legame provocano
assorbimento della radiazione infrarossa (IR attive):

31
Gli assorbimenti, inoltre, sono quantizzati, ma gli spettri vibrazionali appaiono come bande piuttosto
che come linee. Ciò è dovuto al fatto che il cambiamento nell’energia vibrazionale è accompagnato da
variazioni nello stato rotazionale. Le bande sono quindi, più correttamente, bande rotovibrazionali.
Vi sono due modi di studiare la spettroscopia IR: uno teorico, complesso, che presuppone la
conoscenza della teoria dei gruppi, e uno pratico, più semplice, che consiste nella valutazione degli
assorbimenti presenti dello spettro IR per comprendere quali gruppi funzionali siano presenti nella
molecola in esame. Nel presente corso faremo riferimento alla valutazione degli spettri IR per fini più
semplicemente analitici.

2.2 Interpretazione degli spettri


Nello spettro IR sono presenti due tipologie di segnali: quelli legati alla presenza di particolari gruppi
funzionali (presenti nella regione superiore ai 1500 cm-1), e quelli considerati fingerprint (presenti
nella regione inferiore ai 1500 cm-1, detta regione delle impronte digitali, Figura 2). Questi ultimi
sono segnali tipici della molecola analizzata, ma non utilizzabili analiticamente. I segnali fingerprint
sono caratteristici e unici per ogni tipo di molecola e non esistono due molecole che abbiano gli stessi
segnali fingerprint (ecco il motivo della loro denominazione).
I picchi caratteristici di gruppi funzionali cadono invece alle stesse frequenze, a prescindere dalla
struttura della molecola in cui il gruppo stesso è presente.

Figura 2: spettro IR diviso nelle due regioni fondamentali. Quella dei gruppi funzionali e quelle
fingerprint.

32
2.3 Molecole biatomiche
In una molecola biatomica i due atomi sono tenuti a certa una distanza da una serie di forze attrattive e
repulsive. La distanza di equilibrio è tale da bilanciare perfettamente le forze in gioco. Se si tenta di
comprimere il legame crescono le forze repulsive e aumenta l’energia potenziale della molecola; allo
stesso modo le forze attrattive impediscono di allontanare i due atomi. In entrambi i casi l’energia
della molecola aumenterebbe seguendo la legge illustrata in figura 3. Il minimo di energia, cioè la
situazione di maggiore stabilità, si trova in corrispondenza della distanza di equilibrio re

Figura 3: curva dell’energia potenziale (rosso) di una molecola biatomica in funzione della distanza
internucleare. La curva in nero rappresenta una parabola.

In prossimità di re l’energia segue un andamento parabolico.


Il comportamento della molecola biatomica può essere approssimato a quello dell’oscillatore
armonico. La legge di Hooke stabilisce che la forza di richiamo f, che determina la compressione e
l’estensione dell’oscillatore, è proporzionale alla costante di forza k della molla e all’allontanamento
dalla posizione di equilibrio:
f = - k(r-re)
Dalla legge di Hooke possiamo calcolare la frequenza vibrazionale (in termini di
numero d’onda ):

 k rappresenta la forza del legame (molla). Più elevato è il valore di k, più forte è il legame e
maggiore è la frequenza della vibrazione ( più elevato).

33
 La massa ridotta è riconducibile a quella degli atomi: minore è il valore di m* e maggiore è la
frequenza di vibrazione ( più elevato).

L’analogia tra una molecola biatomica vibrante e un oscillatore armonico ha, però, un limite.
L’oscillatore, infatti, può descrivere vibrazioni di ampiezza qualsiasi, in una molecola invece sono
permesse solo vibrazioni di ampiezza ben definita in quanto l’energia vibrazionale molecolare non
può variare in modo continuo ma solo per quantità discrete.

2.4 Moti vibrazionali


I moti vibrazionali possibili all’interno di una molecola (considerata come un insieme di masse e
molle) sono:
1) stretching: sono indicati con ν, sono individuati da due nuclei e consistono
nella variazione (ritmica) della distanza internucleare;
2) in plane bending: sono indicati con β. Si tratta di moti di deformazione di angoli di legame α e
interessano tre nuclei uniti in successione:
Lo stretching è un moto su una retta, il bending è un moto su un piano.

L’energia richiesta per provocare moti di bending o di stretching dipende dalla massa degli atomi o
gruppi di atomi, dall’ordine di legame (ovvero dall’ibridazione degli atomi che formano il legame). In
generale l’energia richiesta per moti di bending è inferiore a quella di stretching, come conseguenza le
deformazioni di bending si troveranno a  maggiori ( minori).

34
2.5 Strumentazione IR
L’IR è una spettroscopia di assorbimento: viene misurata e registrata la luce assorbita dal campione. Il
campione assorbe quindi alcune frequenze della sorgente, la radiazione in uscita dal campione (I) avrà
la stessa potenza della radiazione in entrata sul campione (I0) per le frequenze non assorbite, mentre
per le altre la potenza in uscita risulterà minore.
I dispositivi strumentali IR sono sostanzialmente di due tipi:
1) SPETTROFOTOMETRI A DISPERSIONE (CW IR, dove CW sta per onda continua)
2) SPETTROFOTOMETRI A INTERFERENZA (FT IR, dove FT sta per Trasformata di Fourier).
2.5.1 Spettrofotometri a dispersione (CW IR)
In modo del tutto generale uno spettrometro CW IR è costituito da una sorgente, una locazione
per il campione, un monocromatore e un detector.
Gli spettrometri IR sono in genere a doppio raggio, cioè sul detector incide sia I0 sia I, in
questo modo il rivelatore riesce a stabilire se I e I0 sono uguali o diverse. Così come accade nella
spettroscopia UV-Vis, a partire da I e I0 si definisce la grandezza T (trasmittanza) pari a T= I/I0
mentre un altro parametro utilizzato è A (assorbanza) A= -log T. Chiaramente T può assumere i valori
compresi tra 0 e 100%; è massima allorché non c’è assorbimento; se invece la potenza incidente è
stata completamente assorbita allora I=0 quindi risulta T=0. L’assorbanza A varia tra +∞ e 0.
Normalmente gli spettri IR presentano sulle ascisse la frequenza e sulle ordinate A o T come
osservabile nella figura 5.

Figura 5: spettro IR.

2.5.1.1 Sorgente. Nello spettrometro IR la sorgente è sostanzialmente una stufa: questa


fornisce radiazioni elettromagnetiche di frequenza inferiore al rosso; queste radiazioni vengono
percepite dai nostri sensi come calore. Le sorgenti nello spettrometro IR sono generalmente costituite
da un Globar: filamento di carburo di silicio (richiede eccessiva potenza), un filamento di Nernst

35
costituito da una miscela di ossidi fusi, un filamento di Nichel–Cromo, un filamento di Wolframio o
una bacchetta di grafite, materiale la cui resistenza diminuisce all’aumentare della temperatura. Una
buona sorgente deve soddisfare alcuni requisiti:
1. deve fornire potenza costante nel tempo, deve quindi essere stabile;
2. deve fornire, in genere, un campo continuo di frequenze che copra tutto il range di frequenze che
interessa il tipo di spettroscopia in questione;
3. tutte le frequenze devono essere fornite a potenza sufficientemente alta e con la stessa potenza.
2.5.1.2 Monocromatore. I monocromatori si basano sul fatto che, allorché una radiazione
elettromagnetica passa da un mezzo ad un altro con indice di rifrazione diverso, la sua direzione di
propagazione cambia. Il rapporto degli angoli tra le direzioni dei raggi deviati dipende anche dalla λ,
il che significa che se la radiazione incidente contiene più frequenze al passaggio attraverso il secondo
mezzo queste si separano cioè viaggiano lungo direzioni distinte.
I primi strumenti usavano prismi come monocromatori, nella spettroscopia IR è necessario ricorrere a
sistemi trasparenti all’IR. Questi sono ad esempio i solidi ionici, che hanno però lo svantaggio di
essere costosi e deliquescenti (cioè assorbono acqua) ed il grado di trasparenza degli stessi varia con il
loro grado di ionicità, trasparenza che può essere estesa anche fino a 200 cm-1. Un solido ionico molto
usato è KBr anidro, che risulta trasparente all’IR fino a 400 cm-1. Per ottiche migliori si devono usare
sali di Cesio o di Rubidio. La superficie del KBr deve essere liscia, la presenza di asperità dovute ad
esempio all’azione dell’acqua può essere dannosa. Molto usati come monocromatori sono i reticoli. Il
reticolo è costituito da una superficie piana su cui è incisa una trama di linee parallele, fenditure
parallele, uguali e equidistanti, distanze che sono dell’ordine della λ della radiazione incidente.
Normalmente un solo reticolo non consente di separare sufficientemente le varie ν osservate all’IR;
per tale motivo gli spettrometri sono dotati di più reticoli, in genere cinque, disposti su un tamburo
rotante (ognuno di questi reticoli è specifico per un certo range di ν).
2.5.1.3 Detector. Le radiazioni passanti attraverso la fenditura sono convogliate sul detector. Si
tratta del dispositivo in grado di convertire la radiazione termica (IR) in un segnale elettrico, che viene
poi inviato al sistema di elaborazione e di registrazione.
2.5.1.4 Preparazione del campione. Gli spettri IR possono essere ottenuti per campioni
gassosi, liquidi o solidi. Gli spettri dei gas si possono registrare espandendo il campione in una cella
nella quale si sia precedentemente fatto il vuoto. La locazione del campione negli spettrometri
standard può contenere celle lunghe fino a 10 cm.
I liquidi possono essere esaminati puri o in soluzione. I liquidi puri sono esaminati tra lastre di KBr,
generalmente senza uno spaziatore. Il liquido (una goccia) si pone tra due lastre di KBr; queste si
chiudono tra due rettangoli metallici; su questi rettangoli sono presenti dei fori; inserendo in questi
fori delle viti calibrate si chiude il tutto. È molto importante lo spessore del liquido tra le piastre: se
c’è troppo liquido l’assorbimento è troppo forte e non si ha uno spettro soddisfacente. Liquidi volatili
36
vengono esaminati in celle sigillate, usando spaziatori molto sottili; se le celle non fossero sigillate il
liquido evaporerebbe per effetto della radiazione elettromagnetica, falsando la misura. Per liquidi in
soluzione il campione si prepara mettendo sulla lastra di KBr un film della soluzione: una goccia di
soluzione si mette sulla lastra di KBr. Si sovrappone una seconda lastra di KBr. La scelta del solvente
è un grosso problema: il solvente, infatti, deve avere pochi legami covalenti, perché questi assorbono
all’IR, deve essere anidro e trasparente nella regione dello spettro che ci interessa. Una cella di
compensazione contenente il solvente puro è posta nel fascio di riferimento. Lo spettro ottenuto è
quindi quello del soluto, eccetto nelle regioni in cui il solvente assorbe fortemente. Infatti laddove il
solvente assorbe fortemente la compensazione è inefficace, poiché il forte assorbimento impedisce
l’arrivo della radiazione sul detector. Solventi comunemente usati sono CS2 e CCl4. CCl4 assorbe a
800 cm-1, CS2 a 1.500 e 2.150 cm-1. Altri solventi usati sono paraffine lunghe, tipo Nujol; con queste
si ottengono miscele liquido-liquido molto viscose. Questa miscela si pone tra le due lastre di KBr
dalle quali data la sua viscosità non fuoriesce.
I campioni solidi possono essere disciolti e analizzati come i liquidi. In alternativa possono essere
disciolti in nujol (paraffina liquida). Un’altra possibilità è quella di mescolare il campione solido con
KBr, comprimere il tutto (fino a 100 atmosfere con un’apparecchiatura speciale) per ottenere una
pasticca e utilizzare tale pasticca per l’analisi.
2.5.2 Spettrofotometri a interferenza (FT IR)
Questa tecnica si è sviluppata grazie alla computerizzazione del laboratorio strumentale. Il suo
principio di base è rappresentato dalla possibilità di cogliere contemporaneamente tutte le frequenze
dello spettro IR nel rilevatore, il che rende superflua la scansione della lunghezza d'onda. Questo è
possibile trasformando, per mezzo di un interferometro, la radiazione IR policromatica emessa dalla
sorgente (istante per istante con la medesima intensità) in un interferogramma, dove l’assorbimento
non è più funzione della frequenza, ma del tempo (cioè si passa da dominio delle frequenze a dominio
dei tempi).
Contrariamente agli spettrofotometri tradizionali, quindi, in questa apparecchiatura non si ha un
monocromatore a dispersione. Dopo il passaggio della radiazione attraverso il campione,
l'interferogramma viene trasformato dal calcolatore collegato allo strumento in un tradizionale spettro
infrarosso mediante un'operazione matematica, la cosiddetta Trasformata di Fourier. In questa
maniera si passa perciò dall’interferogramma, un grafico dello spazio o del tempo, a uno spettro
comune, che rappresenta però la variazione dell’intensità del segnale in funzione del numero d’onda
(o della lunghezza d’onda) della radiazione.
Rispetto alla tecnica convenzionale la spettroscopia FT IR offre dei vantaggi:
1) un notevole risparmio di tempo: siccome la radiazione di tutte le lunghezze d'onda viene registrata
contemporaneamente dal rilevatore, il tempo di misura si riduce a pochi secondi rispetto ai 10 minuti
circa degli strumenti tradizionali;
37
2) nessun effetto di riscaldamento del campione: la sorgente è infatti sufficientemente lontana dal
campione;
3) possibilità di interfacciare un gascromatografo;
4) assenza di luce diffusa.

2.6 Bande di assorbimento caratteristiche

1.5.1 Legame C-H


L’assorbimento dovuto al legame C-H si trova, nella regione dello stretching a 3300-2500 cm-1 e
nella regione di bending tra 1500 e 600 cm-1. L’assorbimento è influenzato dall’ibridazione
dell’atomo di carbonio:

Il legame C-H del groppo aldeidico presenta due bande di media intensità 2820 cm-1 e 2700 cm-1.
Quest’ultima è molto utili per individuare la presenza di un’aldeide, anche se ovviamente il segnale
più intenso ed importante rimane lo stretching del C=O che vedremo più avanti.
2.6.2 Legame X-H
2.6.2.1 –OH di alcoli ed acidi carbossilici Lo stretching dei legami O-H avviene tra 3700-
2500 cm-1. La posizione e la forma della banda risente molto della struttura molecolare ed è perciò
molto utile per l’identificazione di composti organici. Posizione e forma sono anche sensibili al tipo e
al grado di legame ad idrogeno che il gruppo OH può formare. Quando l’ossidrile è libero dà origine
ad una banda netta attorno ai 3650-3600 cm-1. Si può parlare di OH libero a concentrazioni <5% in
peso in solventi non polari. Tanto più forte sarà il legame ad idrogeno che si forma tanto più larga e
più spostata verso le frequenze basse sarà la curva.

Nel caso degli acidi carbossilici la banda presenta un massimo attorno ai 2940 cm-1 a causa di una
forte interazione ad idrogeno che si origina dal dimero sotto riportato.

38
2.6.21.2 -NH Amine primarie e secondarie Lo stretching dei legami N-H avviene a frequenze
leggermente inferiori a quelle del legame OH. Le ammine primarie presentano due bande
corrispondenti rispettivamente allo stretching simmetrico ed asimmetrico dei due legami NH, quelle
secondarie danno ovviamente luogo ad un'unica banda. Per quanto riguarda le deformazioni di
bending il legame N-H (nelle ammine secondarie) presenta bande simili a quelle dei CH2,
leggermente superiori in frequenze.
2.6.3 Legame C-C
2.6.3.1 Legame semplice C-C I legami semplici carbonio-carbonio forniscono bande di stretching
estremamente variabili nella loro posizione e di debole intensità. Esse pertanto non saranno di pratica
utilità nella determinazione della struttura di molecole organiche.
2.6.3.2 Doppio Legame C-C Lo stretching del doppio legame C-C si verifica tra 2000 e 1430 cm-1.
Posizione ed intensità sono fortemente influenzate dalla sostituzione e nel caso delle ammine cicliche
dalla dimensione dell’anello. All’aumentare del numero di gruppi alchilici legati al doppio legame si
ha uno spostamento verso frequenze più alte; questo fenomeno è di piccola entità nelle olefine
acicliche e diviene più importante in quelle cicliche man mano che diminuiscono le dimensioni
dell’anello. La coniugazione provoca invece spostamenti a frequenze più basse di circa 40-60 cm-1 e
contemporaneamente si nota un sostanziale aumento dell’intensità della banda. Di particolare
interesse sono le cosiddette bande di respiro dell’anello aromatico (o skeletal vibration in plane) che si
osservano a 1600, 1580, 1500, 1450 cm-1.
2.6.3.3 Triplo legame C-C Negli acetileni terminali lo stretching del triplo legame avviene a 2140-
2080 cm-1; esso è relativamente debole, ma molto netto. La presenza di questa banda e di quella di
stretching del C-H vista prima a 3300 cm-1 identifica con chiarezza la presenza di un alchino
terminale. Negli acetileni disostituiti l’assorbimento si verifica invece a 2260-2190 cm-1. L’intensità
della banda è funzione della simmetria della molecola; più la molecola è simmetrica e minore sarà
l’intensità. In alchini simmetrici la banda è nulla.
2.6.4 Legame C-N (ammine, immine, nitrili)
I valori più importanti sono:
1220-1020 cm-1 C-N (stretching) nelle ammine è di debole intensità e di scarsa utilità spettroscopica
1700-1615 cm-1 C=N (stretching)
Il triplo legame CN dei nitrili può essere messo facilmente in evidenza per via IR. Esso assorbe a
2260-2210 cm-1 e da luogo ad una banda molto più intensa di quella relativa al triplo legame C-C.
2.6.5 Legame C-O
Il legame semplice C-O assorbe a 1250-1000 cm-1 e non è di particolare importanza. Il doppio
legame C=O invece assorbe fortemente nella zona tra 1850- 1650 cm-1. Questa è probabilmente la
zona più utile dell’intero spettro IR poiché la posizione del carbonile è fortemente sensibile agli effetti
dei sostituenti ed alla geometria della molecola. Inoltre, a causa della grande polarità del legame C=O,
39
la posizione della banda è influenzata anche dal solvente. Per composti carbonilici aciclici, senza
quindi particolari tensioni d’anello, in tetracloruro di carbonio possono essere individuati i seguenti
valori di riferimento.

La coniugazione di un carbonile con un C=C o con un anello aromatico produce uno


spostamento dell’assorbimento di circa 30 cm-1 verso frequenze più basse. L’introduzione di un
secondo doppio legame provoca un ulteriore spostamento di altri 15 cm-1.

2.6.6 Legame N-O


Il nitrogruppo –NO2 dei nitroderivati presenta due bande di assorbimenrto molto intense 1600-1500
cm-1 e a 1390-1300 cm-1; la coniugazione provoca uno spostamento a frequenze più basse. Il gruppo
nitroso –N=O fornisce invece un unico assorbimento tra 1600 e 1500 cm-1.
2.6.7 Legami S-H, S-R, S=O
Lo stretching del legame SH dei tioli si osserva a 2250 cm-1 ed è di debole intensità. Nel caso di
solfossidi R2S=O si osserva una banda a 1050cm-1che diventa doppia nel caso dei solfonil derivati
RSO2 per la presenza di uno stretching simmetrico ed uno asimmetrico:
Solfoni R-SO2-R 1300-1150 cm-1
Solfonil cloruri R-SO2-Cl 1375-1280 cm-1
Solfonati R-SO2-OR 1350-1175 cm-1
Solfonammidi R-SO2-NH2 1325-1140 cm-1

Per una rapida interpretazione degli spettri esistono tabelle di correlazione. E’ comunque utile tenere a
mente alcuni valori per potersi orientare rapidamente:
OH 3600
NH 3500
CH aromatico etilenici sopra 3000

40
CH alifatici sotto 3000
CN 2250
Alchini 2150
C=O 1715
C=C 1650

Segue uno schema per ricordare gli assorbimenti più importanti:

2.7 Esempi di Spettri IR

41
Stretching C-H: 3000-2840 cm-1 (comunque <3000 cm-1)
Bending C-H: s CH3 1375 cm-1 (scissoring)
as CH31450 cm-1
s CH2 1465 cm-1
Alcani
 CH2 720 cm-1 (rocking)
Stretching C-C 1200-800 cm-1 (deboli, non diagnostiche)
Bending C-C <500 cm-1 (fuori dalla regione esaminata)

42
Stretching C-H: >3000 cm-1 (più importante)
Stretching C=C 1670-1640 cm-1
debole o assente in situazioni simmetriche
aumenta con la sostituzione Alcheni
aumenta in C=C esociclici
Bending C-H
fuori dal piano: 1000-650 cm-1 (intensa)

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Stretching CC 2260-2100 cm-1 (banda sottile)
intensa in alchini terminali
debole o assente in alchini interni con sostituenti simili Alchini
sempre assente in alchini simmetrici
Stretching C-H: 3330-3270 cm-1 (banda sottile)
Bending C-H 700-610 cm-1 (banda larga)

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Ricorda gli alcheni in:
Stretching C-H: >3000 cm-1
Stretching C=C 1600-1585 cm-1
Idrocarburi aromatici
1500-1400 cm-1
Le bande più diagnostiche sono:
Bending C-H fuori dal piano: 710-675 cm-1
Queste ultime sono bande intense, il loro numero e posizione
dipende dal pattern di sostituzione del nucleo aromatico.

Dita dell’
aromatico

45
Stretching O-H: 3650-3580 cm-1 (OH libero, banda stretta)
3550-3200 cm-1 (con legami H, banda allargata)
Stretching C-O 1260-1100 cm-1 (più intenso di un C-C)
la frequenza aumenta con la sostituzione e con la simmetria
diminuisce con insaturazioni e ramificazioni
-1
Alcoli
Bending O-H 1420-1330 cm (poco diagnostiche)

46
Fenoli

stretching
C-O
Dita dell’
aromatico

stretching Sostituzione
C=C bending aromatico
C-H

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Dialchileteri
Stretching asimm. C-O-C 1150-1085 cm-1 (tipic. 1125 cm-1)
Arilalchileteri
Stretching asimm. C-O-C 1275-1200 cm-1 Eteri
Stretching simm. C-O-C 1075-1020 cm-1
Stretching
C-O-C

Dita dell’
aromatico
Sostituzione
aromatico

48
Stretching N-H: 3500-3250 cm-1
(bande meno larghe e meno intense che per gli OH)
Ammine primarie: due bande, ~3500 e ~3400 cm-1
Ammine secondarie: una banda, ~3330 cm-1
Ammine terziarie: nessun assorbimento Ammine
Bending N-H: 1650-1580 cm-1 (solo primarie, scissoring)
900-650 cm-1 (solo primarie, wagging)
Stretching C-N: ammine alifatiche 1250-1020 cm-1 (debole)
ammine aromatiche 1340-1260 cm-1 (forte)

49
La REGIONE dello STRETCHING del
CARBONILE

La regione va da 1800 a 1650 cm-1 - GIUSTO
AL CENTRO DELLO SPETTRO!
• Il VALORE BASE è 1715 cm-1 (chetone)
• Le BANDE SONO MOLTO INTENSE!!! A
causa dell’ampio momento dipolare del C=O
• C=O è spesso il picco più
importante dello spettro
Il C=O E’ SENSIBILE al SUO
INTORNO

50
CHETONE

2-Butanone BASE = 1715

overtone
2x C=O

C-H CH bend
O
C=O CH3 C CH2 CH3

51
OGNI DIFFERENTE C=O HA UN SUO TIPICO
VALORE DI FREQUENZA
Cloruro estere aldeide Acido
dell’acido chetone carbossilico ammide
O O O O O O
R C R C R C R C R C R C
Cl OR' H R OH NH2
1800 1735 1725 1715 1710 1690
anidride
O O
VALORE BASE
R C O C R

1810 and 1760


( due picchi )

52
EFFETTO DELLA
CONIUGAZIONE
•La forza di legame del carbonile è influenzata dal sostituente legato al C,
infatti esso può avere un effetto induttivo (atomo più elettronegativo), che ne
riduce la lunghezza aumentando così la sua k e la frequenza di assorbimento.

•Effetto coniugativo o di risonanza che aumenta la lunghezza del legame e ne


riduce la frequenza di assorbimento.

• Coniugazione
La coniugazione delocalizza, e quindi indebolisce il legame C=O: la frequenza
di assorbimento scende.

Per un chetone coniugato (con vinili o fenili):


Stretching C=O: 1685-1665 cm-1
La diminuzione della frequenza di assorbimento può essere minore se per
motivi sterici non si può ottenere coplanarità.

53
CONFERMA DEL GRUPPO
FUOGNI
N ZIONTIPO
A LE DI CARBONILE PRESENTA
FREQUENZE ADDIZIONALI CHE CONFERMANO IL
TIPO DI GRUPPO FUNZIONALE
O C=O a 1710 cm-1
O
C=O a 1725 cm-1
R C
R C
O H Si osserva anche
H
Si osserva anche CH OH (legami-H) e
2850 and 2750 cm-1 C-O ~1200 cm-1

O
C=O a 1690 cm -1
R C
O
C=O a 1735 cm-1
R C
N H O R'
H Si osservano anche Si osservano due
due picchi NH picchi picchi C-O at 1200
a 3400 cm-1 e 1000 cm-1

I Chetoni hanno il C=O a 1715 cm-1 e nessun


NH, OH, C-Ohanno
Le Anidridi or -CHOdue C=O picchi a 1800 cm-1
e due C-O 54
SPETTRI ESEMPLIFICATIVI
ALDEIDE

Nonanale BASE = 1725

CHO >4C

CH bend

C=O
O

CH3 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 C H

3460
55
CLORURO ACILICO BASE = 1800

Dodecanoil Cloruro

CH bend

C
CH3 (CH2)10 Cl

C=O
C-H

3608
ESTERE BASE = 1735
56
Butanoato di Etile

C-O
C-H
O

CH3 CH2 CH2


C
O CH2 CH3 C=O

3482

57
ACIDO CARBOSSILICO
BASE = 1710

Acido2-Metilpropanoico

O-H

O
C-O
C-H C=O C
CH3 CH OH

CH3

Elaborazione del materiale proveniente anche da:


Dott. C. Oliviero Rossi, Univ. della Calabria (http://labterenzi.unical.it/metcf%5COlivieroIR.pdf)
Prof. C. Santi, Univ. di Perugia (www.metodifisici.net/TESTI/testo/capitolo3.pdf).

58
Due picchi

Propanammide
AMMIDE
BASE = 1690

C-H O

C
C=O CH3 CH2 NH2

NH2 CH bend

59