TEST IN VIVO DI ATTIVITA BIOLOGICHE (Prof.

BERTINI) SPETTROFOTOMETRIA CROMATOGRAFIA SU COLONNA

La spettrofotometria una tecnica ana itica per ana isi qualitative e quantitative con !uti i""o #e e ra#ia"ioni e ettroma$netic%e& i parametri sono' () Fre*uen"a' n+ #i ,i-ra"ioni .on#e) in unit/ #i tempo0 2) Lun$%e""a #!on#a' #istan"a tra 1 punti #i una fase e si misura in nm .nano-metri) e# in#icata #a a ettera .

Si ana i""ano sostan"e i*ui#e e ,a ricor#ato c%e e proteine possono interferire con !ana isi& ci sono infatti protoco i #a se$uire per e iminare e,entua i interferenti0 Le sostan"e c%e sono semi i*ui#e ,anno i*uefatte con specific%e meto#ic%e0 La sost0 pu ita si mette in una cou,ette e poi ne o spettrofotometro0 Consi#eran#o un ra$$io #i uce monocromatica c%e attra,ersa un campione& si inten#e TRASMITTAN2A .T) i rapporto tra intensit/ #e a ra#ia" c%e attra,ersa i campione .Iu o I( uscita) e !intensit/ #e a uce inci#ente .Ie o Io entrata) T3 Tu4Te0

ASSOR5AN2A .A) i o$aritmo #e ! in,erso #e a trasmittan"a A3 o$ .(4T) e misura a *uantit/ #i ener$ia assor-ita #a a sostan"a .pi6 sost c!& ma$$iore sar/ !assor-an"a)0 L!assor-an"a u$ua e a# un!e*ua"ione 7 A .propor"iona e a a concentra"ione)3 s .spessore cuo,ette)8 .cost)8concentra"ione0

Le parti fon#amenta i sono' una sor$ente uminosa& a cou,ette e# un ri e,atore c%e man#a i #ati a computer .per !ana isi *uantitati,a)0

Per una ana isi *ua itati,a imposto i soft9are in maniera ta e c%e a cou,ette sar/ co pita #a : #i,erse ne tempo e si otterr/ un $rafico in poc%i secon#i c%e ci #ir/ c%e sostan"e sono contenute a !int #e campione ini"ia e .$ra"ie ai tracciati #i,ersi)0 A propor"iona e a a concentra" ma per corrette""a tutte e pro,e ,en$ono fatte con un contro o accanto .;1O)0 E! importante fare una retta #i taratura0

La cromato$rafia su co onna .;PLC %i$% performance i*ui# c%romato$rap%<) una tecnica ana itica per conoscere i componenti #i una misce a sfruttan#o e attitu#ini #i o$ni componente #i formare intera"ioni con a fase sta"ionaria sotto a spinta #i una fase mo-i e e uente0 Es0 #e$ i spinaci su cui sopra metto !e uente e poi a,r= una separa"ione #ei #i,ersi componenti #e a c orofi a in tempi #i,ersi perc%> a#sor-iti #a a fase sta"ionaria in tempi #i,ersi0 Tipi di cromatografia' Su co onna' tecnica separati,a e s,i uppatasi in se$uito anc%e come tecnica ana itica& si -asa su fatto c%e i ,ari componenti #i una misce a ten#ono a ripartirsi in mo#o #i,erso tra #ue fasi& in fun"ione #e a oro #i,ersa affinit/ con ciascuna #i esse& ma un meto#o $re""o0 Su strato so i#o' a,,iene in ,asc%ette #i p astica #o,e su a -ase ,erranno messi so uti ,o ati i e a misce a #a separare ,err/ messa su un $e sotti e0 I so ,ente sa e per capi arit/ . proprio a capi arit/ c%e #i,i#e i componenti) e i ,ari componenti sa $ono in maniera #i,ersa0 Fr( .fattore #i riten"ione ( ossia #i una #ata sostan"a) 3 cm(4cm so ,ente& o$ni sostan"a %a i suo Fr c%e resta cost0 Su strato #i $as' con co onna impaccata .in acciaio con una se"ione int #o,e c! a fase sta"ionaria e ,iene messa in camera termostatata) o capi are0 Con una sirin$a ,iene iniettata a sostan"a #a ana i""are e con uno spru""o #i $as ,iene spostata ne a co onna e i #i,ersi componenti ,en$ono trattenuti in maniera #i,ersa e con un ri e,atore ,en$ono in#i,i#uati& re$istrati e man#ati a PC0 Fa ana isi sia *uantitati,e c%e *ua itati,e0 ?iene ana i""ato i Tempo #i riten"ione ossia i tempo c%e intercorre !inie"ione #e campione e a sua uscita #a a co onna a temperatura cost0 E! un ,a ore cost per a specifica sostan"a0 ;PLC %i$% performance i*ui# c%romato$rap%<' *uesta tecnica fa ana isi *uantitati,e in -ase a tempo #i riten"ione e fa ana isi *ua itati,e con !ampie""a #e picco c%e propor"iona e a a concentra"ione0