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Prova che le proteine prodotte nel lume del RE vengono divise dalla proteine secrete in uno scompartimento post-ER

Hugh R.B.Pelham MRC Laboratory of Molecular Biology, Hills Road, Cambridge CB2 2QH, UK Communicated by H.R.B.Pelham

Diverse proteine solubili che si trovano nel lume del ER contengono una specifica sequenza C-terminale (KDEL), che impedisce la loro secrezione. Questa sequenza pu essere riconosciuta da un recettore che immobilizza le proteine nel ER o le smista nella via secretoria in un altro momento e le riporta nella loro posizione normale. Per distinguere queste possibilit, ho allegato un segnale di ritenzione ER alla proteina lisosomiale catepsina D. Le catene laterali di oligosaccaridi di questa proteina normalmente sono modificate in sequenza da due enzimi per formare residui di mannosio-6-fosfato; questi enzimi non agiscono nellER ma sono localizzati in compartimenti separati allinterno (o quasi) dellapparato del Golgi. La Catepsina D recante il segnale di ER si accumula all'interno dellER ma continua ad essere modificata dal primo degli enzimi che formano il mannosio-6phosphate. La modifica fortemente dipendente dalla temperatura, che anche una caratteristica di trasporto dallER al Golgi. Questi risultati supportano l'idea che le proteine ER luminali sono continuamente recuperate da un vano post-ER, e che questo vano contiene attivit di Nacetylglucosaniinyl-1-fosfotransferasi. INTRODUZIONE Abbiamo recentemente mostrato come le proteine che normalmente risiedono nel lume del reticolo endoplasmatico recano un segnale comune C-Terminale tetrapeptidico, KDEL, e quelle sequenze che includono questo tetrapeptide sono sia necessarie che sufficienti per la loro ritenzione in quellorganulo. Si possono supporre due meccanismi generali per questa specifica ritenzione. La pi semplice quella che un recettore che esso stesso una proteina facente parte della membrana del reticolo endoplasmatico ( o parte di alcune matrici strutturali allinterno del reticolo) lega la sequenza KDEL e tiene a posto le proteine. Abbiamo dibattuto contro questo modello sulla base che tale interazione non rilevabile in vitro e che non c nessun candidato ovvio per un recettore che sia sufficientemente abbondante per legare le principali proteine del lume. In aggiunta recenti esperimenti ci mostrano che la presenza o lassenza della sequenza KDEL non influenza il tasso di diffusione della proteina GRP78 (BiP) allinterno del lume del reticolo endoplasmatico negli oociti di Xenopus, supponendo che esso non abbia una funzione di ancoraggio in vivo.

Il secondo meccanismo possibile che le proteine del reticolo endoplasmatico raggiungono un compartimento al di sopra del reticolo stesso nel canale di secrezione che poi sono recuperate da un recettore che le riconosce in questo sviluppo e le riporta indietro al reticolo endoplasmatico. Questo modello prevede che l'ordinamento da parte di costituenti dell'ER di proteine secrete succeda in alternativa nel cis Golgi o in qualche scompartimento tra il ruvido(RER) e il cis Golgi. Per testare il modello di riciclaggio, ho attaccato il segnale di ritenzione(mantenimento) KDEL,ad un cDNA codifica l'enzima lisosomiale catepsina D, ed ha espresso il gene di fusione in cellule COS. Le catene laterali di carboidrati di catepsina D sono normalmente substrati per mannosio-6-fosforilazione, la modifica che riguarda la destinazione degli enzimi lisosomiali (per le recensioni visualizza Kornfeld e Kornfeld, 1985; von Figura e Hasilik, 1986). Il primo enzima coinvolto nella costituzione del fosfato, N-acetilglucosaminil-1-fosfotransferasi(GlcNAc-P-transferasi), concentrata in un vano distinto dal RER e in genere previsto per essere il cis Golgi (Waheed et al, 1981;.. Pohlmann et al, 1982; Goldberg e Komfeld, 1983; Deutscher et al, 1983).. Io mostro che l'aggiunta della sequenza KDEL cause efficienti ritenzione di catepsina D al ER, ma non impedisce incorporazione di 32P nelle sue catene laterali di oligosaccaridi. I risultati sostengono l'idea che le proteine del lume ER, sono continuamente recuperate da un compartimento post-ER.

RISULTATI Espressione e delocalizzazione della fusione di Catepsina D e proteine Il sito diretto della mutagenesi fu utilizzato per introdurre un sito di restrizione sullestremit 3 della sequenza codificante la Catepsina D e fu composta la fusione di due geni. Il primo (CDM) allunga la sequenza codificata della proteina attraverso amminoacidi SMEQKLISEEDLN , la quale forma un epitopo riconosciuto dallanticorpo monoclonale 9E10( Munro e Pelham , 1986,1987). Questa modificazione facilita lindividuazione e lisolamento della proteina espressa. Il secondo costrutto (CDMK) simile, ma codifica la sequenza aggiuntiva C-terminale SEKDEL, la quale noi precedentemente mostrammo che era sufficiente per il mantenimento del lisozima delluccello nel ER. I geni furono inseriti in un vettore di espressione( esempio plasmidi) e trasferiti nelle COS cellule. La figura 1 mostra la colorazione di immunofluorescenza nelle

proteine espresse usando il 9E10 anticorpo monoclonale. Le cellule mutate con CDM mostrano una colorazione nella regione del Golgi e una pi forte colorazione nelle vescicole vicine, ma nessuna colorazione nei lisosomi maturi( figura 1a e b).Come la colorazione vescicolare non era visibile con le proteine secrete cosi anche il lisozima (Munro e Pelham ,1987) e di conseguenza presumibilmente rappresenta una proteina diretta ai lisosomi.

La mancanza della colorazione dei lisosomi maturi pu essere pi facilmente spiegata se l'epitopo 9E10, viene rimosso in questi organelli, dalla catepsina D, con la proteolisi . C'era anche poca colorazione del RE, il che indica che il trasporto delle proteine appena sintetizzate verso il Golgi rapido, in questo la catepsina D assomiglia al lisozima, che viene trasportata nel Golgi in meno di 30 min nelle cellule COS (Munro e Pelham, 1987).

Fig. 1. Distribuzione delle proteine di fusione catepsina D nelle cellule COS. Le cellule trasfettate con CDM (a, b) o CDMK (c, d), sono state colorate con lanticorpo monoclonale che riconosce le loro estensioni Cterminali. I Pannelli( b, d) mostrano a grande ingrandimento la regione perinucleare. CDM concentrato nel Golgi e nelle vescicole vicine, mentre CDMK si trova nel RE. Lintera larghezza dei pannelli corrisponde a 160 micron (a, b) o 40 micron (c, d)

Al contrario, le cellule trasfettate con CDMK mostrano una colorazione intensa del RE, senza una rilevante concentrazione nel Golgi o in vescicole (Figura 1c e d). Questo mostra che il segnale KDEL funzionale se collegato alla catepsina D, e tale da superare il segnale target lisosomiale, che pensato per essere riconosciuto in qualche parte del Golgi . Pertanto, lo smistamento delle proteine del RE deve precedere quello delle proteine lisosomiali. I dati di immunofluorescenza sono stati confermati dal protein blotting (Figura 2). Ben poca proteina CDM era secreta nel mezzo, il che implica che (la CDM) diretta verso i lisosomi in maniera efficace , e deve quindi essere un buon substrato per la fosforilazione del mannosio. Il materiale intracellulare aveva le dimensioni previste per la procathepsin D (Faust et al., 1987), ma solo bassi livelli sono stati rilevati dagli anticorpi. Come accennato in precedenza, ci coerente con la perdita dell epitopo 9E10 nei lisosomi. La proteina CDMK era inoltre della dimensione attesa per un derivato della procatepsina. E 'accumulata fino a un livello molto alto nelle cellule, e non stata rilevata nel mezzo.

Fig. 2. Individuazione delle proteine di fusione catepsina D mediante elettroforesi su gel e protein blotting. Le cellule trasfettate o falso- trasfettate sono state incubate per 2,5 h in un mezzo privo di siero.

Porzioni equivalenti di cellule (C) e di mezzo (M) sono state analizzate mediante elettroforesi su gel, trasferimento in nitrocellulosa e immunocolorazioni. La freccia grande indica la posizione prevista per una proteina di 48 kilodalton, come stimato da marcatori funzionanti sullo stesso gel. La piccola freccia indica proteine nel mezzo a partire da cellule trasfettate CDM, rilevabile solo dopo una prolungata esposizione dell autoradiogramma. Questa banda non era rilevabile con il mezzo a partire da cellule falso-trasfettate.

Etichettatura delle proteine con 32P Le cellule trasfettate con costrutti di CDM e CDMK sono state marcate sia con [35S] Met che con 32PO4 per 4 ore. Le proteine espresse sono state quindi immunoprecipitate con lanticorpo monoclonale 9E10, separate mediante elettroforesi su gel e la radioattivit presente quantificata in fasce etichettate (tipici gel sono indicati nelle figure 3 e 4).

Entrambe le proteine potrebbero essere marcate con 32P e, come indicato nella tabella I, il rapporto di 32P con 35S stato lo stesso per CDMK e CDM. Ci implica che nonostante la sua efficiente conservazione in ER, la proteina etichetta KDEL raggiunge lo stesso livello di incorporazione di fosfato come catepsina D, che destinata ai lisosomi. Lapparente bassa incorporazione sia di [35S] Met che 32P in CDM dovuta alla perdita del epitopo 9E10 dalla proteina etichetta durante il periodo di etichettatura di 4 ore (vedi sotto). Questi risultati suggeriscono che sia CDM e CDMK raggiungono il GlcNAc P-transferasi sul lato cis del Golgi ma che poi seguono percorsi diversi, CDM procede attraverso il Golgi verso i lisosomi mentre CDMK ritorna allER. Per mostrare questa differenza pi chiaramente, le cellule sia CDM che CDMK sono state etichettate con 32PO4 per 2 ore, e poi per 4 ore in presenza di cicloeximide e fosfato non marcato (Figura 3, corsia 2, 3, 5 e 6)

Fig. 3. Stabilit di etichetta fosfato su CDMK. Cellule trasfettate sono state etichettate con 2P04 per 2 h (P), o etichettate e poi seguite per 4 h in un mezzo comtenente 0,3 mm di cicloeximide (C). Proteine plasmidiche sono stati isolate con immunoprecipitazione. Il campione nella linea 4 deriva da cellule trattate con cycloheximide per 20 minuti prima e durante il periodo di etichettatura. Le linee 7 e 8 mostrano

un campione di etichettato con CDMK che stata incubata con o senza endo H prima dell'analisi con gel. Le linee 9 e 10 mostrano un campione CDMK etichettato incubato con o senza fosfatasi alcalina. .

Circa la stessa quantit di 3p stata incorporata nelle due proteine durante il processo iniziale di labelling (incorporamento/assorbimento). Durante lesperimento la CDM assorbita ha cessato di essere immunoprecitabile, come ci si aspetterebbe se il determinante antigenico 9E10 fosse rimosso nei lisosomi. In contrasto a questo, lincorporamento della CDMK immunoprecipitabile in realt aumentato del 6070%. Nonostante questo incremento indichi che i precursori radioattivi persistano per un po di tempo durante lesperimento, anche chiaro che la proteina CDMK assorbita non viene n degradata n escreta rapidamente. Dato che limmunofluorescenza mostra soltanto reticolo endoplasmatico trattato per CDMK, concludo che le forme fosforilate di questa proteina si accumulino nel reticolo stesso. Per avere unindicazione sul tempo richiesto da proteine CDMK appena sintetizzate per essere completamente fosforilate, le cellule trasfette sono state trattate con cicloesimide per 20 minuti e poi assorbite per 2 ore in presenza continua del farmaco. Tale trattamento ha ridotto lincorporamento della 32p solo del 22%, come rilevato dal conteggio delle bande escisse dal gel mostrato in figura 3. Di conseguenza, la fosforilazione della proteina deve avvenire piuttosto lentamente e proseguire per diverse ore dopo la sua sintesi. Caratterizzazione della CDMK evidenziata con P32 Per confermare che il tracciante P32 attaccato alle catene laterali di oligosaccaridi della catepsina D, la CDMK marcata radioattivamente stata sottoposta alla degradazione da parte dell endoglicosidasi H, che rimuove dalla proteina gli oligosaccaridi di tipo high (?)- mannosio N-linked. Questo trattamento rimuove completamente il tracciante dalla proteina. I residui di Mannosio-6-fosfato sugli enzimi lisosomiali sono sintetizzati in due fasi che possono avvenire in compartimenti separati. Il primo unisce GlcNAc-P al mannosio formando un fosfodiestere; il residuo di GlcNAc successivamente rimosso da un secondo enzima per esporre un fosfomonoestere che sensibile alla fosfatasi alcalina. Per capire se la catepsina D contenente KDEL sia sottoposta allazione di entrambi gli enzimi o solo del primo, CDMK,che stata marcata radioattivamente per 2 ore e monitorato per 4 ore, stato eluito dallimmunoprecipitato e degradato con fosfatasi alcalina. Questo trattamento non ha rimosso la maggior parte di P32 (figura 3,passaggi 9 e 10), nonostante la densiometria dellautoradiogramma abbia rivelato un decremento del 10-15% dellintensit della striscia marcata radioattivamente. Come un controllo (?), il DNA marcato-end-32P(?) stato cubated (?) in condizioni identiche; la marcatura/letichetta stata rapidamente e completamente rimossa (dati non riportati). Sembra quindi che la maggior parte della proteina CDMK marcate-pulse (?) rimasta nella forma fosfodiesterica durante la caccia/inseguimento (?) di 4 ore, e non stata esposta a N-acetilglucosaminidasi.

Effetto della temperatura sulla marcata-32P della catepsina D conservata/trattenuta

I risultati sopra riportati sono coerenti con l'idea che la catepsina D recante il segnale KDEL subisce trasporto vescicolare dal Reticolo Endoplasmatico ad uno scomparto che ospita GlcNAc-P-transferasi, viene modificato in questo compartimento, e poi ritorna al Reticolo Endoplasmatico . Se cos, allora l'incorporazione di fosforo deve essere sensibile alle condizioni che riducono il tasso/la velocit di trasporto. Dato che l'etichettatura/marcatura non dipende dalla sintesi proteica in corso, l'effetto di tali condizioni sulla fosforilazione pu essere misurata indipendentemente da qualsiasi effetto che possono avere sulla traduzione.Una caratteristica comune di trasporto vescicolare, all'interno di entrambi i percorsi secretori e endocitici, la sua forte dipendenza della temperatura (es.,Marsh e Helenius, 1980; Saraste e Kuismanen, 1984; Tartakoff, 1986; Balch et al,1986).Ho quindi etichettato CDMK con 32P per 4 ore a diverse temperature tra i 10ei 30 C. Fig. 4. Dipendenza dalla temperatura di 32P incorporato in CDMK. Le cellule sono state contrassegnate per 4 ore a temperature comprese tra 30 e 10 C. Il pannello A mostra uno autoradiogramma CDMK immunoprecipitato. La sezione inferiore mostra una parte del gel corrispondente Coomassie;la proteina CDMK contrassegnata con una freccia, ed h indica la catena pesante dell'immunoglobulina derivata dall'anticorpo Sepharose.

Pannello B mostra un autoradiogramma delle fosfoproteine presenti nell'anticorpo sopranatante. L'ultima traccia una esposizione 10 volte pi lunga del campione a 10 C. Pannello C riporta l'incorporazione, in percentuale di quello ottenuto a 30 C, in CDMK (0), nella fosfoproteina contrassegnati con una freccia nel pannello B (A), e nell'RNA citoplasmatico(A). Si noti la scala logaritmica sull'asse verticale.

I dati sono riassunti nella Figura 4. La marcatura di CDMK era circa 1000 volte meno efficiente a 10 C che a 30 C, la pi forte inibizione che si verifica al di sotto di 20 C (una riduzione di 8 volte per ogni diminuzione di 5 C). Per confronto stata anche misurata lincorporazione nellRNA citoplasmatico e nelle singole fosfoproteine citoplasmatiche. Sorprendentemente la marcatura di RNA e di tutte le altre fosfoproteine principali ha mostrato una simile dipendenza di temperatura (Figura 4b e c), nonostante i differenti ammassi precursori e i meccanismi enzimatici coinvolti. La marcatura di questi componenti era significativamente meno sensibile al raffreddamento rispetto a tutta la gamma di temperature esaminate di CDMK, calando solo dalle 20 alle 30 volte tra i 30 e i 10 C. Anche se la prova indiretta, questi risultati suggeriscono che un ulteriore passaggio energetico necessario per la marcatura di CDMK in confronto a quella di altri componenti cellulari, e il trasporto vescicolare un candidato evidente. Come discusso sopra, non necessario che la sintesi proteica continui. La marcatura allinterno del Golgi o del ER richiede captazione di [32P]UDPGlcNac in questi compartimenti, che avviene attraverso lo scambio con il luminal UDP-GlcNac o UMP.Tuttavia, improbabile che ci sia limitante poich studi in vitro dimostrano che rapido (70% del UDPGlcNAc cambia entro 1 minuto a 30C), non necessita di energia metabolica e mostra solo una dipendenza da una temperatura moderata (riduzione da 5 a 10 volte tra 30 e 0C) (Perez and Hirschberg, 1985).

Discussione Prova per il recupero di KDEL contenenti protein da un compartimento post-RER I risultati in questa carta mostrano che laggiunta della sequenza KDEL alla catepsina D porta a unefficace ritenzione di questa proteina nellER, ma non impedisce la fosforilazione delle sue catene laterali di oligosaccaridi. Poich la GlcNAc-P-transferasi pensata per essere collocata nel Glogi cis (Waheed et al., 1981; Pohlmann et al., 1982; Goldberg and Kornfeld, 1983; Deutescher et al., 1983), ci supporta con forza lidea che le proteine ER recanti il segnale KDEL sono consegnate ad un comparto post-ER insieme alle proteine secretorie, e successivamente sono recuperate da un recettore che le ricicla nellER. Lalternativa pi probabile a questa conclusione che la transferasi presente anche nel RER a qualche livello, ed responsabile delletichettatura della proteina conservata. Questo sembra improbabile per varie ragioni.Primo, il frazionamento subcellulare mostra che la maggior parte dellenzima co fraziona con le vescicole del Golgi piuttosto che con il Reticolo Endoplasmatico ruvido o liscio. Nelle cellule in crescita c probabilmente una piccola quantit di GlcNAc-P-transferasi in transito verso il Golgi ma la relativa insensibilit di etichettatura delle 32p alla cicloeximide suggerisce che non sia mediata da tali molecole. certamente difficile escludere la possibilit che una piccola percentuale dellattivit totale delle trasferasi risieda permanentemente nel Reticolo Endoplasmatico, ma non ci si aspetterebbe che questo favorisca lo stesso grado complessivo di incorporazione di fosfato della versione del Reticolo Endoplasmatico della catepsina, (della catepsina nel corpo del reticolo endoplasmatico) allo stesso modo di come ottenuto con la proteine normali una volta attraversato il Golgi, che il risultato osservato. Secondo, c una buona testimonianza del fatto che la fosforilazione di normali enzimi lisosomiali non avviene prima che essi abbiano lasciato il Reticolo Endoplasmatico. Studi con fl-glucuronidasi in una serie di cellule macrofagiche mostrano che c un ritardo di 15-20 minuti tra la sintesi delle proteine e la prima apparizione di molecole contenenti fosfato . Inoltre, le versioni del Reticolo Endoplasmatico delle proteine che conservano uno o pi residui di glucosio sulla loro catena oligosaccaridica non contengono mai fosfato.

Questo non a causa di una incapacit degli enzimi di fosforilazione nel riconoscere tali strutture, perch in una linea cellulare carente di glucosidasi le proteine II lascia il reticolo endoplasmatico ruvido con i residui di glucosio in sede, e la fosforilazione delle loro oligosaccaridi si verifica (Gabel e Kornfeld, 1982). Infine, la forte temperatura- dipendenza del fosfato incorporato nella forma conservata di catepsina D implica che qualcosa di pi del semplice scontro di enzima e substrato in un reticolo endoplasmatico ruvido necessario per la fosforilazione. Il Trasporto delle proteine presintetizzate dal reticolo endoplasmatico ruvido al Golgi noto per essere molto inefficiente a bassa temperatura, ma il motivo preciso per questo poco chiaro (Tartakoff, 1986; Saraste et al, 1986;. Saraste e Kuismanen, 1984; Balch et al,. 1986). E 'anche difficile confrontare i risultati quantitativi in Figura 4 con studi precedenti, che sono stati pi di natura qualitativa. Tuttavia mi sembra una ragionevole ipotesi che il passo della temperatura-dipendenza in catepsina Fosforilazione D il suo

trasporto dal reticolo endoplasmatico ruvido al sito in cui la reazione si verifica. Vi un precedente per la presenza di un enzima fosforilato lisosomiale in un reticolo endoplasmatico ruvido che fa pensare che il fenomeno non limitato a costruzioni artificiali in tessuto-cultura cellule. Nel fegato di ratto l'enzima J3glucuronidasi si trova sia nei lisosomi e nei microsomi, le due forme di essere prontamente separabili dalla messa a fuoco isoelettrica.La forma microsomiale legata ad una proteina chiamata egasina, la quale stata recentemente segnala come proteina luminale ER (Brown et al., 1987 e referenze inerenti largomento). Nonostante la sua ubicazione allinterno dellER, la f3-glucuronidase microsomiale contenente fosforo tiene bloccato da un lato loligosaccaride (Mizouchi et al., 1981). Non vi ancora disponibile una sequenza amminoacidica per legasina, ma se come sostenuto dal sistema KDEL, i risultati della B-glucuronidase sono equivalenti a quelli (delleligasina) in questo articolo, tranne per il fatto che il legame dellenzima ad un sito di attacco dellER non-covalente piuttosto che covalente

Luogo al quale le proteine luminali ER sono selezionate dalle proteine secretorie Quanto lontano possono le KDEL contenenti proteine penetrare/entrare nella la scia secretoria prima che ritornino allER? I risultati in questo articolo indicano che esse possono raggiungere la GlcNac-P- transferasi, ma apparentemente non sono esposte allenzima che rimuove i residui GlcNac. Una conclusione simile pu essere dedotta dai dati della 3-glucuronidase (Mizouchi et al., 1981), sebbene in nessuno dei due casi pu essere scartato una piccola quantit di gruppi fosfati scoperti. evidente che i due enzimi in questione sono in compartimenti separabili, con lenzima scoperto in vescicole meno dense (presumibilmente pi allinterno nella cisterna del Golgi) (Goldberg e Kornfeld, 1983; Deutscher et al., 1983). Se le proteine ER possono raggiungere Mannosidasi I nel Golgi meno chiaro. La mancanza di oligosaccaridi ritagliati sul Man5.GlcNAc2 della proteina luminare ER GPRP94(Erp99) usato come argomentazione contro il passaggio attraverso il cis Golgi. (Warren, 1987; Wieland et al., 1987). Comunque questa argomentazione basata su analisi fatte sui residui di mannosio (3H) della proteina GPRP94(Erp99) tre ore dopo l etichettatura. (Lewis et al., 1985) . Da un analogia con GRP78 (Munro and Pelham,1987) solo circa una met della proteina pu aver attraversato cis Golgi in questo periodo; Il tempo di permanenza in tale comparto potrebbe essere molto breve e lenzima potrebbe essere un povero substrato per Manosidasi I. Un contro esempio mostrato dal microsomiale B-glucoridasi: la popolazione allo stato stazionario nel fegato di ratto ha una parte importante dei suoi oligosaccaridi neutrali nello stato di Man5.GlcNAc2 (Mizuochi et al., 1981). Sfortunatamente questo non prova che la proteina ha raggiunto nel golgi Mannosidasi I, perch lattivit di Mannosidasi nelle proteine ER potrebbe essere forse capace di formare questa struttura. Un altro argomento a sfavore del passaggio delle ER proteine attraverso la cisterna CIS del Golgi che non possono essere individuate in questorganello per immunocitochimica (Bole et al., 1987). Tuttavia, come abbiamo indicato precedentemente, un movimento a bassa velocit fuori dal RER insieme a un efficiente ripristino porterebbe a uno stato stazionario a bassa concentrazione del sito di smistamento (Munro e Pelham, 1987). Infatti questo un postulato necessario poich, se le proteine dellER hanno raggiunto unalta concentrazione nella fase fluida, esse tenderebbero inevitabilmente a lasciare il compartimento di smistamento dal normale pathway secretorio. In conclusione, i dati attuali ci indicano che le ER proteine luminali sono ordinati da proteine secretorie in un compartimento contenente N-acetilglucosammin-1 fosfotrasferasi. Se ci corrisponde al RER o ad altri compartimenti tra il RE e il Golgi (come discusso da Warren, 1987), pu essere determinato da ulteriori studi citologici.