Single Nucleotide Polymorphism

Prof. Renato Fani

Dipartimento di Biologia Animale e Genetica
Università degli Studi di Firenze

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 Cosa sono gli SNPs?
• Questo termine è principalmente
legato alla genetica eucariotica e si
riferisce alla differenza di sequenza
in una sola base tra due alleli

A T C G

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 Come ogni mutazione
puntiforme lo SNP può essere:
Questo tipo di mutazione è presente
• Silente soprattutto nelle regioni non
codificantiÆ ma è presente anche in
quelle codificanti (terza base del
codone..)
• Non senso
Sono le mutazioni più evidenti
perché portano all’alterazione di
• Missenso una proteina.

Possibile cambiamento
fenotipico
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 COME PUO’ ESSERE INDIVIDUATO
UN POLIMORFISMO PUNTIFORME?

Tra i vari metodi usati per l’individuazione di SNP

possiamo prendere in considerazione l’RFLP e due
sistemi che possono essere applicati a frammenti di
DNA di diversa lunghezza:

• RFLPÆ sistema generico

• Individuazione dello SNP con trattamento chimico (fino
a 2000 pb)
• SSCPs (single-strand conformation polymorphisms) per
frammenti fino a 500 bp.

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1. RFLP (Restriction fragment lenght polymorphism)
Il sistema permette di evidenziare SNP localizzati
internamente ad un sito di restrizione. Il diverso pattern
di restrizione può essere visualizzato su gel d’agarosio.

In questo esempio lo
stesso frammento di 275 sogg1 sogg2
bp proveniente da due
diversi soggetti è stato HaeIII TaqI MwoI HaeIII TaqI MwoI
trattato separatamente
con tre enzimi di
restrizione, due dei quali
hanno evidenziato la
presenza di un
polimorfismo.
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 2. Individuazione
dello SNP
con trattamento
chimico
IdrossilamminaÆmodifica la
citosina

Tretraossido di
osmioÆmodifica le timine

PiperidinaÆ enzima che

taglia in corrispondenza delle
basi modificate.

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3. SSCPs
(single-strand
conformation
polymorphisms)

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A COSA PUO’ SERVIRE INDIVIDUARE UNO SNP?

MALATTIA GENETICA

LOCALIZZAZIONE
DI UNA MUTAZIONE
PUNTIFORME CARATTERISTICA

DIAGNOSI PRECOCE

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 ESEMPIO: Fibrosi cistica

La fibrosi cistica è una malattia genetica ereditaria,

cronica ed evolutiva causata dal difetto nel funzionamento
di una proteina, CFTR (cystic fibrosis transmembrane
regulator). Questa proteina ha il compito di regolare il
passaggio di ioni cloro e sodio attraverso la membrana
delle cellule epiteliali. L’alterazione di tale proteina
determina un cattivo funzionamento del trasporto ionico
cellulare, causando anomalie nella secrezione delle
ghiandole esocrine in cui è locato. Le maggiori ripercussioni
si hanno a livello del pancreas e dei polmoni dove le
secrezioni mucose risultano molto più dense e vischiose
tanto da impedire il corretto funzionamento di tali organi.

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 Caccia al gene responsabile della malattia
•Come prima cosa sono state studiate un ampio numero di
famiglie affette da fibrosi cistica.
•Tramite RFLP sono state individuate regioni associate alla
malattia che per ibridazione in situ sono state localizzate sul
braccio lungo del cromosoma 7.
• Clonaggio della regione di interesse e screening dei cloni
mediante sonde
•Isolamento dell’intera regione codificante il gene
CFÆ6000bp
• Una volta ottenuta la sequenza questa è stata confrontata
con quella wild type…

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 68% dei pazienti
una delezione di 3 pb
con la perdita di una fenilalanina

Sfortunatamente nei pazienti in cui non è presente

questa delezione sono state individuate + di 200
diverse mutazioni

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Come evidenziare velocemente tali mutazioni?
Screening prenatale
Attualmente lo screening prenatale viene effettuato con
varie tecniche che coinvolgono analisi basate sulla PCR e
l’ibridazione di sonde\mutazione specifiche che vanno a
ricercare un set di mutazioni (31-200) tipiche della regione
geografica o legate alla familiarità

Ma sistemi alternativi di analisi

SNuPE

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 SNuPE (Single Nucleotide Primer extension)
• Conoscere la sequenza esatta del sito in cui è localizzato
lo SNP
• La tecnica si basa su una reazione di primer extension
modificata
Template Primer
CCATGACTGATTCC
NNNNAGCCTGGTACTGACTAAGGANNN
Interrogation target
ddGTP + ddCTP +
ddUTP + ddATP Reazione di primer extension

dd
CCATGACTGATTCCU
NNAGCCTGGTACTGACTAAGGANNNNNNN

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I nucleotidi impiegati nella reazione di estensione del
primer sono dideossinucleotidiÆ questo determina
l’incorporazione di un solo nucleotide data l’assenza dell’OH
libero in posizione 3’
Inoltre i nucleotidi sono marcati con 4 differenti
fluorocromi. Un quinto fluorocromo è impiegato per marcare
un size-standard

ddNTP Dye Color

A dR6G Green
C dTAMRA Yellow(black)
G dR110 Blue
U (T) dROX Red

Size Std Liz Orange

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PASSAGGI della TECNICA SNuPE in DETTAGLIO:

• Amplificazione della regione contenente lo SNP di

interesse
• Purificazione del prodotto di PCRÆ rimozione dei dNTP
e dei primer
• reazione di primer extension Æ incorporazione di un
ddNTP marcato usando un primer specifico per la
regione subito a monte dello SNP
• Purificazione del prodotto per rimuovere ddNTP non
incorporati
• Elettroforesi capillare del prodotto di extension
• Lettura dei risultati Æ la posizione di ogni picco è
correlata alla lunghezza del frammento che lo
rappresenta, mentre l’altezza è correlata alla sua
quantità relativa.

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 ELETTROFORESI CAPILLARE
Il campione di DNA, miscelato con una soluzione
tampone con sostanze denaturanti, per un evento di
iniezione penetra in un capillare. Durante il percorso
il flusso è investito da un raggio la cui lunghezza
d’onda eccita i fluorocromi (che devono essere stati
precedentemente legati ai frammenti di DNA)
permettendo di individuare i frammenti.

Æ Questo è il sistema impiegato per il

sequenziamento automatico

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 ELETTROFORESI CAPILLARE
• Impiega microcapillare in silice fusa, con diametro interno
compreso fra 10 e 100 micron (sottilissimi), con lunghezza tra i 30 e
i 50 cm.
•Il capillare è riempito da una sostanza che funge da setaccio
molecolare (simile al gel), che può essere poliacrilammide,
dimetilacrilammide o altri polimeri lineari.

• I parametri che determinano la risoluzione del sistema sono:

- la % di polimero utilizzato;
- la lunghezza della corsa;
- il voltaggio;

• Questo tipo di elettroforesi può essere utilizzato solo nel caso in

cui si abbia una marcatura fluorescente:  a livello del capillare ad un
certo punto è presente una fessura attraversata da una luce laser, in
grado di eccitare i fluorocromi e indurre una risposta captabile dai
rilevatori.
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Laser light source

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 FLUSSO ELETTROSMOTICO

- - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - -
ANODO(+)

CATODO(-)
+ +++++ + + + + + + +++++ + + + + +
- - - -
- -
- -
+ +++ ++ + + + + + + +++++ + + + + +
- - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - -

-
Ioni negativi del capillare
Sali positivi del buffer
+
-
Molecole di DNA di diversa grandezza

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Laser light source

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Vantaggi:
•Il tempo necessario per la corsa si riduce fino a 14 volte.
•Il caricamento è sempre automatico (caricamento elettrocinetico)
il campione viene aspirato dalla provetta che lo contiene e portato
velocemente dentro la matrice. L’efficienza di caricamento permette
di utilizzare pure minor q.tà di campione.
• La risoluzione è migliore rispetto all’elettroforesi classica

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 Allele wt Allele mut
A C
T G

A C
T G

T G
A C
T G

T G
I I

pm pm

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SANO
T
A I
T
A
T pm

ETEROZIGOTE
A T G
T I

C
G
pm

Mutante
OMOZIGOTE G
C I
G
C
G pm

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 APPLICAZIONI
Questa tecnica ha avuto ampia applicazione nel campo della
diagnostica
ESEMPIOÆ lo screening delle mutazioni coinvolte in una
malattia genetica può essere effettuato con questo metodo.

Nello screening prenatale per la fibrosi cistica sono state

individuate tre mutazioni presenti nell’esone 17b
•R1066C CÆT 3328nt ArgÆHis 1066Aa
• R1066H GÆA 3329nt ArgÆHis 1066Aa
•L1077P TÆC 3362nt LeuÆPro 1077Aa

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Gene CFTR

Esone 17b
R1066C 3328 L1077P 3362

TA C
R1066H 3329

T(C)A(G) C(T) +
A(G)T(C) G(A)
-

Mut T T Mut Mut G

wt C C wt wt A
R1066H R1066C L1077P

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 nTTT
T(C)A(G) C(T) +
A(G)T(C) G(A)
TTT -

pm

TTT
nTTT pm

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R1066H R1066C L1077P
Wt het mut

Wt het mut
 TECNICA SNuPE

Una buona conoscenza delle potenzialità di una tecnica

permette di utilizzarla per risolvere problematiche
tipiche di settori ben diversi da quelli usuali.

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 PROBLEMATICA

Allergia al latte vaccino Necessità di sistemi

per risalire all’esatta
composizione di
Frodi alimentari prodotti del settore
(sostituzioni) lattiero-caseario

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 SOLUZIONI PROPOSTE

METODI PER L’IDENTIFICAZIONE DI

SPECIE

ANALISI DELLA ANALISI DEI

FRAZIONE TRIGLICERIDI
PROTEICA
via
via
NMR
ELETTROFORESI
BIDIMENSIONALE TECNICHE BASATE sul
DNA
via
ANALISI DELLE
VARIAZIONI NELLA
SEQUENZA DEL GENE
cytb MITOCONDRIALE Prof.
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VANTAGGGI nell’usare tecniche basate sul GENE
cytb mitocondriale
GENE cytb :

9E’ubiquitario nelD N A eucariotico

9H a un buon tasso dim utazione

9E’presente in alto num ero dicopie

NOI ABBIAMO FOLCALIZZATO LA NOSTRA ATTENZIONE SULLE

SEQUENZE DEL GENE cytb APPARTENETI ALLE 4 SPECIE DI
MAGGIOR INTERESSE:

Bos, Ovis, Capra, Bubalus

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 Metodi tradizionali di identificazione di specie
basati sull’analisi PCR-RLFP:
1. Amplificazione via PCR di una regione centrale del
gene cytb
2. Digestione con enzimi di restrizione
3. Analisi del pattern di restrizione ottenuto mediante
elettroforesi su gel d’agarosio

LIMITI :

Non è sempre semplice La copresenza di più

riconoscere il pattern
Il gel d’agarosio specie all’interno dello
specifico di una specie presenta una stesso campione rende
bassa risoluzione i pattern praticamente
indecifrabili
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 STRATEGIA

• Progettazione di due primer per amplificare una

regione centrale del gene cytb per aumentare la
specificità dei primer già esistenti

• Messa a punto di un sistema di identificazione

di specie basato sulla tecnica SNuPE

non si tratta però di evidenziare un polimorfismo allelico,

ma una differenza di sequenza tra specie diverse

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 RECUPERO DAL DATABASE DI TUTTE LE SEQUENZE
DISPONIBILI DEL GENE cytb APPARTENENTI ALLE QUATTRO
SPECIE DI INTERESSE

Bos Capra Bubalus Ovis

13 seq 11 seq 21 seq 18 seq

Allineamento multiplo
(ClustalW) delle 63
sequenze del cyt b

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 INDIVIDUAZIONE DEI PRIMER UNIVERSALI

Una sequenza Capra gD84201 CTCCCAACCCCATCAAACATCTCATCATGATGAAACTTTGGATCCCTCCTAGGAATTTGC 120

campione Ovis gAF034730
gD34635
CTCCCAGCTCCATCAAATATTTCATCATGATGAAACTTTGGCTCTCTCCTAGGCATTTGC
CTTCCAGCCCCATCGAACATTTCATCATGATGGAATTTCGGTTCCCTCCTGGGAATCTGC
120
119
rappresentante Bos
Bubalus
gD88629 CTCCCTGCTCCATCAAATATCTCATCATGATGAAACTTTGGCTCTCTCCTAGGCATCTGC
** ** * ***** ** ** *********** ** ** ** ** ***** ** ** ***
120

ciascuna specie è stata gD84201 CTAATCTTACAAATCCTGACAGGCCTATTCCTAGCAATACACTATACATCCGACACAATA 180

confrontata con le
gAF034730 TTAATTTTACAGATTCTAACAGGCCTATTCCTAGCAATACACTATACACCTGACACAACA 180
gD34635 CTAATCCTACAAATCCTCACAGGCCTATTCCTAGCAATACACTACACATCCGACACAACA 179

altre per individuare

gD88629 CTAATTCTGCAAATCCTCACCGGCCTATTCCTAGCAATACACTACACATCCGACACAACA 180
**** * ** ** ** ** *********************** *** * ******* *

due regioni ben gD84201 ACAGCATTTTCCTCTGTAACTCACATTTGTCGAGATGTAAATTATGGCTGAATCATCCGA 240

conservate su cui gAF034730
gD34635
ACAGCATTCTCCTCTGTAACCCACATTTGCCGAGACGTGAACTATGGCTGAATTATCCGA
ACAGCATTCTCCTCTGTTACCCATATCTGCCGAGACGTGAACTACGGCTGAATCATCCGA
240
239
disegnare un set di gD88629 ACAGCATTCTCCTCCGTCGCCCACATCTGCCGAGACGTGAACTATGGATGAATTATTCGA
******** ***** ** * ** ** ** ***** ** ** ** ** ***** ** ***
240

primer universali gD84201 TACATACACGCAAACGGAGCATCAATATTCTTTATCTGCCTATTCATACATATCGGACGA 300

gAF034730 TATATACACGCAAACGGGGCATCAATATTTTTTATCTGCCTATTTATGCATGTAGGACGA 300
gD34635. TACATACACGCAAACGGAGCTTCAATGTTTTTTATCTGCTTATATATGCACGTAGGACGA 299
gD88629 TACATACACGCAAACGGAGCTTCAATATTTTTCATCTGCTTATATATACACGTAGGACGA 300

Questi primer
** ************** ** ***** ** ** ****** *** ** ** * ******

consentono di
gD84201 GGTCTATATTATGGATCATATACCTTTCTAGAAACATGAAACATTGGAGTAATCCTCCTG 360
gAF034730 GGCCTATACTATGGATCATATACCTTCCTAGAAACATGAAACATCGGAGTAATCCTCCTA 360

amplificare un
gD34635 GGCTTATATTATGGGTCTTACACTTTTCTAGAAACATGAAATATCGGAGTAATCCTTCTG 359
gD88629 GGCATATACTACGGATCATATACCTTTCTAGAAACATGAAACATCGGAGTAATTCTATTA 360
** **** ** ** ** ** ** ** ************** ** ******** ** *
frammento di 275
bp a partire da gD84201
gAF034730
CTCGCGACAATGGCCACAGCATTCATAGGCTATGTCCTACCATGAGGACAAATATCATTT
TTTGCGACAATAGCCACAGCATTCATAGGCTATGTTTTACCATGAGGACAAATATCATTC
420
420
ogni specie gD34635.
gD88629
CTCACAGTAATAGCCACAGCATTCATAGGATACGTCCTACCATGAGGACAAATATCATTC
TTCGCAGTAATAGCCACAGCATTTATAGGATACGTACTGCCATGAGGACAAATATCATTC
419
420
considerata * * *** *********** ***** ** ** * ********************
 DNA di DNA di
DNA di CAPRA MUCCA DNA di
BUFALO PECORA

PCR con i
primer
universali

elettroforesi su gel
d’agarosio

B G C S - m

275 bp

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 SNuPE

9 Permette di distinguere tra le specie grazie a

differenze “puntiformi” tra le sequenze che non
devono necessariamente essere in un sito di
restrizione

9 Rapida esecuzione

9 Semplice interpretazione dei risultati

 Specie 1 Specie 2

amplificazione con
i primer universali

• Individuazione di una “mutazione” puntiforme discriminante

•Desegno di un primer immediatamente a monte del polimorfismo
•Primer extension
T G
A C
T G

Elettroforesi capillare

T G
I I

pm pm

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 FORWARD
G giD84201 CTCCCAACCCCATCAAACATCTCATCATGATGAAACTTTGGATCCCTCCTAGGAATTTGC 120
S giAF034730 CTCCCAGCTCCATCAAATATTTCATCATGATGAAACTTTGGCTCTCTCCTAGGCATTTGC 120
C giD34635. CTTCCAGCCCCATCGAACATTTCATCATGATGGAATTTCGGTTCCCTCCTGGGAATCTGC 119
B giD88629 CTCCCTGCTCCATCAAATATCTCATCATGATGAAACTTTGGCTCTCTCCTAGGCATCTGC 120
***** ** ** *********** ** ** ** ** ***** ** ** ***
giD84201 CTAATCTTACAAATCCTGACAGGCCTATTCCTAGCAATACACTATACATCCGACACAATA 180
G
giAF034730 TTAATTTTACAGATTCTAACAGGCCTATTCCTAGCAATACACTATACACCTGACACAACA 180
S
giD34635. CTAATCCTACAAATCCTCACAGGCCTATTCCTAGCAATACACTACACATCCGACACAACA 179
C
giD88629 CTAATTCTGCAAATCCTCACCGGCCTATTCCTAGCAATACACTACACATCCGACACAACA 180
B
**** * ** ** ** * ******** ******** ** ** *** * ** *** *
giD84201 ACAGCATTTTCCTCTGTAACTCACATTTGTCGAGATGTAAATTATGGCTGAATCATCCGA 240
G
giAF034730 ACAGCATTCTCCTCTGTAACCCACATTTGCCGAGACGTGAACTATGGCTGAATTATCCGA 240
S
giD34635. ACAGCATTCTCCTCTGTTACCCATATCTGCCGAGACGTGAACTACGGCTGAATCATCCGA 239
C
giD88629 ACAGCATTCTCCTCCGTCGCCCACATCTGCCGAGACGTGAACTATGGATGAATTATTCGA 240
B
****** * **** ** * ** ** ** ** ** ** ** ** ** ***** ** ***

G giD84201 TACATACACGCAAACGGAGCATCAATATTCTTTATCTGCCTATTCATACATATCGGACGA 300

S giAF034730 TATATACACGCAAACGGGGCATCAATATTTTTTATCTGCCTATTTATGCATGTAGGACGA 300
C giD34635. TACATACACGCAAACGGAGCTTCAATGTTTTTTATCTGCTTATATATGCACGTAGGACGA 299
B giD88629 TACATACACGCAAACGGAGCTTCAATATTTTTCATCTGCTTATATATACACGTAGGACGA 300
** ***** ***** ** ** ***** ** ** ** *** *** ** ** * *****
giD84201 GGTCTATATTATGGATCATATACCTTTCTAGAAACATGAAACATTGGAGTAATCCTCCTG 360
G
giAF034730 GGCCTATACTATGGATCATATACCTTCCTAGAAACATGAAACATCGGAGTAATCCTCCTA 360
S
giD34635. GGCTTATATTATGGGTCTTACACTTTTCTAGAAACATGAAATATCGGAGTAATCCTTCTG 359
C
giD88629 GGCATATACTACGGATCATATACCTTTCTAGAAACATGAAACATCGGAGTAATTCTATTA 360
B
** **** ** ** ** ** ** ** ************** ** ******** ** *

G giD84201 CTCGCGACAATGGCCACAGCATTCATAGGCTATGTCCTACCATGAGGACAAATATCATTT 420

S giAF034730 TTTGCGACAATAGCCACAGCATTCATAGGCTATGTTTTACCATGAGGACAAATATCATTC 420
C giD34635. CTCACAGTAATAGCCACAGCATTCATAGGATACGTCCTACCATGAGGACAAATATCATTC 419
B giD88629 TTCGCAGTAATAGCCACAGCATTTATAGGATACGTACTGCCATGAGGACAAATATCATTC 420
* * *** *********** ***** ** ** * *****************

REVERSE Prof.
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INDIVIDUAZIONE DI DIFFERNZE PUNTIFORMI CARATTERIZZANTI
CIASCUNA SPECIE
CAPRA
PECORA
MUCCA e BUFALO

C giD84201 G
CTAATCTTACAAATCCTGACAGGCCTATTCCTAGCAATACACTATACATCCGACACAATA 180
P giAF034730 A
TTAATTTTACAGATTCTAACAGGCCTATTCCTAGCAATACACTATACACCTGACACAACA 180
M giD34635.
C
CTAATCCTACAAATCCTCACAGGCCTATTCCTAGCAATACACTACACATCCGACACAACA 179
B giD88629 CTAATTCTGCAAATCCTCACCGGCCTATTCCTAGCAATACACTACACATCCGACACAACA 180
**** * ** ** ** C * ******** ******** ** ** *** * ** *** *

MUCCA BUFALO
CAPRA, PECORA, CAPRA, PECORA,
BUFALO MUCCA

C giD84201 C C
ACAGCATTTTCCTCTGTAACTCACATTTGTCGAGATGTAAATTATGGCTGAATCATCCGA 240
P giAF034730 C C
ACAGCATTCTCCTCTGTAACCCACATTTGCCGAGACGTGAACTATGGCTGAATTATCCGA 240
M
B
giD34635.
giD88629
T C
ACAGCATTCTCCTCTGTTACCCATATCTGCCGAGACGTGAACTACGGCTGAATCATCCGA
ACAGCATTCTCCTCCGTCGCCCACATCTGCCGAGACGTGAACTATGGATGAATTATTCGA
239
240
****** * **** ** * **C** ** ** ** ** ** ** **A***** ** ***

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 PROGETTAZIONE DEI PRIMER

CAPRA
PECORA
Primer A
C/T
G giD84201 G
CTAATCTTACAAATCCTGACAGGCCTATTCCTAGCAATACACTATACATCCGACACAATA 180
S giAF034730 A
TTAATTTTACAGATTCTAACAGGCCTATTCCTAGCAATACACTATACACCTGACACAACA 180
CW giD34635.
C
CTAATCCTACAAATCCTCACAGGCCTATTCCTAGCAATACACTACACATCCGACACAACA 179
B giD88629 CTAATTCTGCAAATCCTCACCGGCCTATTCCTAGCAATACACTACACATCCGACACAACA 180
**** * ** ** ** C * ******** ******** ** ** *** * ** *** *

MUCCA BUFALO
Primer B T Primer C
A
G giD84201 C C
ACAGCATTTTCCTCTGTAACTCACATTTGTCGAGATGTAAATTATGGCTGAATCATCCGA 240
P giAF034730 C C
ACAGCATTCTCCTCTGTAACCCACATTTGCCGAGACGTGAACTATGGCTGAATTATCCGA 240
CW
B
giD34635.
giD88629
T C
ACAGCATTCTCCTCTGTTACCCATATCTGCCGAGACGTGAACTACGGCTGAATCATCCGA
ACAGCATTCTCCTCCGTCGCCCACATCTGCCGAGACGTGAACTATGGATGAATTATTCGA
239
240
****** * **** ** * **C** ** ** ** ** ** ** **A***** ** ***

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STEP SPERIMENTALI:
1. Amplificazione con i primer universali primers (previa
estrazione del DNA da formaggio)
2. Reazione di primer extension sul prodotto di
amplificazione con ddNTP marcati T A
G C

ELETTROFORESI CAPILLARE
Rivela quale ddNTP è stato incorporato e quindi
quale specie è stata analizzata

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ANALISI SNuPE di MUCCA

SPECIE BASE
INCORPORATA
Primer A: G
MUCCA Primer B: A
Primer C: G

A
Primer B

G
Primer C

G
Primer A

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ANALISI SNuPE di PECORA

SPECIE BASE
INCORPORATA
Primer A: T
PECORA Primer B: G
Primer C: G

Primer B G

G
Primer C

Primer A
T

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ANALISI SNuPE di CAPRA

SPECIE BASE
INCORPORATA

Primer A: C
CAPRA Primer B: G
Primer C: G

Primer B

G
Primer C

Primer A C

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ANALISI SNuPE di BUFALO

SPECIES INCORPORATED
BASE
Primer A: G
BUFALO Primer B: G
Primer C: T

Primer B G

T
Primer C

Primer A

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SPECIES BASE
IDENTIFICATIVA

SHEET Primer A: T

SPECIES BASE
IDENTIFICATIVA

GOAT Primer A: C E’ POSSIBILE

IDENTIFICARE LE
QUATTRO SPECIE DI
SPECIES BASE INTERESSE NEL
IDENTIFICATIVA SETTORE LATTIERO
COW Primer B: A CASEARIO

SPECIES BASE
IDENTIFICATIVA

BUFFALO Primer C: T

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