Stato di transizione

ed energia di attivazione

Conformazione Conformazione Conformazione

“a barca” “a semi-sedia” “a sedia”
Energia libera (G)

∆G0≠

∆G0

Angolo di rotazione (Θ)

 Gli enzimi

Sono catalizzatori biologici - accelerano (fino

a 1016 volte) la quasi totalità delle reazioni
biologicamente importanti.

Hanno in generale una elevata specificità di

reazione e di substrato.

Noti dalla prima metà dell’800; inizialmente

ritenuti proprietà esclusiva della materia
vivente

Dall’inizio del 1900 è accettato che formino

complessi fisici con i rispettivi substrati

Dal 1926 si sa che gli enzimi sono proteine

(cristallizzazione dell’ureasi in forma pura).

A partire dal 1960 circa: determinate le prime

strutture tridimensionali di enzimi.
 Gli enzimi abbassano l’energia libera di
attivazione della reazione che catalizzano

Ovvero (secondo Pauling, anni ’40): gli enzimi hanno una

complementarità (e affinità) massima non per i substrati o prodotti
di reazione ma per lo stato di transizione.

TS

∆G
ETS
E+S

ES E+P

EP
Gli enzimi hanno complementarietà
massima per lo “stato di transizione”
 Strategie generali d’azione degli enzimi

Riduzione della entropia di attivazione

Reazioni bimolecolari diventano unimolecolari quando i substrati

sono legati all’enzima.

Residui catalitici già parte dell’enzima (non sono necessarie

grosse perdite di entropia).

Orientamento favorevole dei gruppi coinvolti.

 Strategie generali d’azione degli enzimi

Catalisi acido-basica generale

Gruppi chimici capaci di cedere protoni (acidi generali) oppure di

riceverli (basi generali) possono accelerare specifiche reazioni
chimiche. Esempio: la tautomerizzazione di un chetone alla forma
enolica
 Strategie generali d’azione degli enzimi

Catalisi acido-basica generale

I siti attivi degli enzimi sono ricchi di residui ionizzabili

(preposizionati!) che possono effettuare una catalisi acido-basica.

In particolare l’istidina (pK vicino a 7) si può trovare facilmente sia

in forma protonata (acido generale) che in forma deprotonata
(base generale)
 Strategie generali d’azione degli enzimi

Catalisi elettrostatica in un ambiente poco

polare

Siti attivi normalmente poveri d’acqua e con bassa costante

dielettrica effettiva.

Interazioni elettrostatiche (tra residui carichi o cofattori metallici e

il TS) favorite.
 Strategie generali d’azione degli enzimi

Catalisi covalente

Uso di Ser, Cys o His come nucleofili, oppure uso di cofattori

organici (ad es., la tiamina pirofosfato).

‘Strain’ o deformazione del substrato (?)

E’ improbabile che una distorsione fisica del substrato possa

essere impiegata per favorirne la reattività.
Adattamento indotto (‘induced fit’):
Proposto da D. Koshland nel 1958 per spiegare la
specificità degli enzimi.

In accordo con l’osservazione che molti enzimi, come

l’esochinasi, esistono in conformazioni ‘aperte’ in
assenza di substrato e ‘chiuse’ in presenza di substrato.

Di per sé non spiega l’efficienza catalitica degli enzimi.

Probabili vantaggi: l’enzima può stabilizzare meglio lo

stato di transizione se lo ‘circonda’; la forma chiusa aiuta
a rimuovere l’acqua; il cambiamento conformazionale può
essere importante per la regolazione allosterica.
 Cinetica enzimatica:
Il modello di Michaelis e Menten

Sviluppano la prima teoria della cinetica enzimatica, basata

sull’osservazione che la velocità di una reazione enzimatica
è saturabile – cioè, non aumenta indefinitamente
all’aumentare della concentrazione del substrato.
 Cinetica enzimatica:
Il modello di Michaelis e Menten

k1 kcat
E + S E•S E +P
k-1
KS

d [P]
v= = k cat × [ES] [ES] ≈ [E][S]/K S
dt
 Cinetica enzimatica:
L’equazione di Michaelis e Menten
k cat [E]0 [S]0
v=
K S + [S]0
Più spesso scritta come:
Vmax [S]0
v=
K M + [S]0
In seguito, Briggs e Haldane ottennero un’equazione
sostanzialmente identica partendo da un presupposto diverso
(assunzione dello ‘stato stazionario’).
L’unica differenza è il significato fisico di KM. Nella trattazione
originale di Michaelis e Menten, KM=KS=k-1/k1. Nella trattazione di
Briggs e Haldane (più generale) KM=(kcat+k-1)/k1

KM
Il grafico dei doppi reciproci
 Reazioni multisubstrato:
meccanismo sequenziale ordinato

E+A EA + B EAB EPQ E+P+Q

 Un enzima prototipo:
la chimotripsina

Struttura primaria Struttura terziaria

La ‘triade catalitica’
 Le proteasi a serina (come la chimotripsina)

Catalizzano l’idrolisi di un legame peptidico.

R1
H2O
R1 R1 O
O O N C C +
N C C N C C H H O
H H H H
R1 O
H N C C
Reazione non catalizzata: estremamente H H
lenta, avviene presumibilmente per attacco
diretto dell’acqua sul carbonio del legame
peptidico.

R1 O R1 O
R1 R1 O
N C C N C C
O H N C C
H H H H N C C +
H H H
OH H O

Ser195
Acylenzime adduct

Le proteasi seriniche utilizzano invece un meccanismo di

catalisi covalente: attacco di un nucleofilo interno (un
residuo serinico) sul legame, con formazione di un addotto
acilenzima e rilascio di un primo prodotto
 Le proteasi a serina

In seguito l’addotto (che normalmente è molto instabile)

viene idrolizzato
R1
O H R1
N C O
C O H
+ N C C
H H O
OH H H O-

Acylenzime adduct Ser195

Prima parte della reazione: attacco nucleofilo favorito per motivi

entropici rispetto alla soluzione.

Inoltre il gruppo alcolico della serina è specificamente attivato. Fa

parte di un un sofisticato sistema di tre amminoacidi orientati
(‘triade catalitica’)

O
O H N N H O C

Ser 195 His 57 Asp 102

L’istidina funge da acido-base generale. Attiva la serina

deprotonandola.
La funzione del carbossile è meno certa: orienta l’anello
imidazolico e stabilizza la carica positiva che si forma sull’anello
stesso.
 Le proteasi a serina

Un’altra struttura importante delle proteasi seriniche è la tasca

ossianionica: una piega del sito attivo in cui l’O del legame
peptidico del substrato può formare due legami H con gruppi
ammidici della proteina.

Nel complesso ES: i legami H sono deboli (per distanza,

geometria e cariche in gioco), ma si rafforzano nello stato di
transizione.

Tasca
ossianionica

R1
O
R1
H
C C N
H
H
O
O H N N H O
C

Si forma una specie tetraedrica transiente che decade con la

cessione del protone dalla His al gruppo amminico uscente.
L’idrolisi dell’intermedio acilenzima procede in modo
assolutamente speculare - l’istidina in questo caso attiva
dapprima la molecola d’acqua deprotonandola, poi trasferisce il
protone alla serina.
Alcuni enzimi usano cofattori organici,
derivati dalle vitamine

NH 2 O

+
N
N N S

N OH N N O

Thiamine (Vit. B1) HO

OH
HO
NH 2
CH2OH
O
Riboflavin (Vit. B2)
HN NH

Nicotinamide
O
S
OH
O
Biotin
OH O
HO N
HN NH

N
H2N N N
Pyridoxal (Vit. B6)

O
OH Folic Acid HN
O OH
OH
HO O O

OH
Pantothenic Acid
O
(part of Coenzyme A)
 Enzimi allosterici:
importanti per la regolazione metabolica
Esempio: l’aspartato transcarbamilasi
 Aspartato transcarbamilasi:
cooperatività e regolazione

O COO- COO-
C O OH
O CH2 CH2 P
H2N C
+HN C H H2N HN
+ O-
O
O-
P 2 C H
O- O-
O
COO- COO-

Carbamyl Carbamyl
phosphate L-Aspartate aspartate
 Molti enzimi sono regolati
tramite modificazioni covalenti
Esempio: la glicogeno fosforilasi
 (Forma T)

(Bloccata in forma
R dalla fosforilazione )