Documenti di Didattica
Documenti di Professioni
Documenti di Cultura
Gli esperimenti si fanno in vitro in cellule che sono sincronizzate e vanno in apoptosi nello stesso
momento in apoptosi. Ci sono metodiche che riescono a mettere in evidenza la frammentazione a
livello di singole cellule: la frammentazione del Dna (prodotta da CAD attivate da caspasi) ha
permesso di mettere a punto una tecnologia basata sul fatto che le terminazioni libere 3' possono
essere substrato di un enzima, il TdT. Se si usa il TdT marcato...copiare
slide
Mediatori dell'apoptosi
Tre grandi classi di molecole:
molecole che inducono l'apotposi perch si legano al loro recettore di membrana, l'apoptosi
dovuta al legame con il recettori producendo variazioni del contenuto intracellulare
interazioni con il sistema immunitario: le cellule vanno incontro ad apotposi in seguito a
cambiamenti del contenuto intracellulare indotti dall'interazioni con cellule citotossiche
condizioni avverse: ipertermia, ipotermia, ischemia, radiazioni, deprivazione di fattori di
crescita (ad esempio androgeni nella prostata), farmaci, tossine, agenti chimici
Nella apoptosi c' una fase di esecuzioni in cui avvengono modificazioni morfologiche tipiche
dovute ad eventi a cascata proteolitici e nucleolitici e una fase di induzione in cui si innesca il
processo in conseguenza del recepimento di segnali extracellulari e segnali endogeni. La finalit
dell'apoptosi predisporre l'eliminazione della cellula; questo deve impedire la fuoriuscita di
materiale, c' l'attivazione di trans-glutaminasi che provocano la formazione di legami crociati che
formano una rete che costringe la cellula a rimanere compatta ed impedire la fuoriuscita di
materiale potenzialmente pro-infiammatorio. Gli stadi istologicamente visibili sono la fase 3 e 4.
Il processo apoptotico pu essere attivato da:
via di trasduzione del seggnale
vie di danno cellulare ( radiacali,anosssia, calcio, perforine)
Danno al DNA (p53) in alcuni casi il danno al DNA pu essere compatibile con la vita
della cellule. Esistono dei guardiani del genoma come p53 che in caso di danno cerca di far
riparare il DNA (perch se il danno resta e coinvolge geni delle proliferazione pu essere
trasmesso ad una progenie di cellule e dar luogo allo sviluppo di tumori); p53 blocca il
cliclo cellulare dando tempo agli enzimi di riparazione di riparare il danno, ma se il danno
non riparato induce la cellula in apoptosi. P53 uno degli oncosoppressori: molto spesso
pu mutare oppure possono essere ereditate mutazioni che determinano una riduzione della
protezione del genoma.
Danno della membrana (ceramide): le ceramidi sono molecole idrofobe che possono
neosintetizzate oppure possono derivare da sfingolipidi di membrana che vengono
idrolizzati da sfingomielinasi che si possono attivare e produrre le ceramidi. Se aumentano
le ceramidi intracellulare queste avviano reazioni a cascata che determinano una serie di
effetti biologici. Nell'apoptosi avviene un aumento consistente della concentrazione
intracellulare di ceramidi. La produzione di ceramidi avviene per attivazione di una
particolare sfingomielinasi acida che si attiva pH acido. L'inibizione delle produzione di
ceramidi, in alcuni modelli cellulari in cui sono coinvolte le ceramidi nell'apoptosi, blocca
l'innesco del processo apoptotico.
Le vie di induzione possono essere:
Via recettoriale o estrinseca o extracellulare: stimoli che innescano vie di trasduzione del
segnale comportando la soprressione o induzione dei programmi di morte (non detto che
portino sempre ad apotposi). Vie di morte attivate dal legame di appropiati ligandi con
recettori appartenenti alla superfamiglia dei TNFR (recettori del fattore di necrosi tumorale).
Via intrinseca: segnali intracelullari...slide
VIA ESTRINSECA
L'interazione recettore ligando determina l'interazione di pi procaspasi con alcune proteine
adattatrici. Il recettore FAS costituito da un dominio extracellulare per interazioni con ligando, un
dominio trasnmentmbrana e un dominio di morte (DD) che organizzato in alfa eliche. Il fas
presente sulla membrana di tutte le cellule. Quando si legano i ligandi avviene sempre la
trimerizzazione del recettore che ha delle proteine adattatrici che interagiscono con le
procascaspasi.
Integrare con slide.
Recettore del TNF
Prodotto dai linfociti T e attiva i macrofagi in risposta ad un processo infettivo. Legando il recettore
il TNFR1 il TNF pu avere diversi effetti, dipendono dal tipo di cellula e dal tipo di recettore. Il
legame comporta l'attivazione di geni pro-infiammatori ed immunomodulatori in alcune cellule,
mentre in altre induce apoptosi. Il TNF induce la trimerizzazione dei recettori ed anche in questo
caso ci sono delle proteine adattrici che interagiscono con i DD e che reclutano la procascapasi 8.
Nel caso in cui TNF induce effetti infiammatori la proteina adattatrice non recluta la procaspasi 8
ma determina una cascata di chinasi che determina una attivazione di NfkB (in condizioni basali
inattivato da IkB) sopravvivenza.
La fase di iniziazione avviene fino al reclutamento della caspasi 8. Nella fase di esecuzione si ha
l'attivazione delle caspasi 3 che determina il clivaggio di substrati di morte e altre substrati. La via
mitocondriale non separata dalla via estrinseca, le due vie convergono solamente nella fase di
esecuzione, nella fase di iniziazione sono separate. Il mitocondrio sempre in qualche modo
interessato, si attiva la caspasi 9 grazie a fattori che fuoriescono dal mitocondrio come il citocromo
C; il processo mediato da una serie di fattori che hanno effetti contrapposti (pro- e antiapoptotici).
VIA INTRINSECA
Si attiva la caspasi 9 che ha un dominio regolativo CARD (serie di alfa eliche) media interazioni
proteina proteina riconoscendo domini simili CARD presenti su altre proteine. Il gene cruciale che
attiva le caspasi APAF-1 che contiene un dominio CARD che pu interagire con il CARD della
procaspasi 9. Affinch APAF-1 leghi la caspasi 9 deve avvenire un cambiamento di conformazione
di APAF-1 grazie al citocromo c: si forma cos un complesso molecolare proteolitico che ha la
forma di una ruota e viene detto apoptosoma. Se non ci fosse il citocromo C non si formerebbe
l'apoptosoma. Inizialmente il citocromo c reclutato da APAF-1, successivamente APAF-1 lega la
caspasi 9.
La regolazione affidata alla proteine della famiglia Bcl-2 che controllano il rilascio delle proteine
mitocondriali come citocromo C:
pro-apoptotiche: come BAX e BAK e BH13
antiapoptotiche: BCL-2 che d il nome alla famiglia e Bcl Xl prodotta dallo spilicing
alternativo di Bcl X.
L'interazione tra queste proteine modula il processo.