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DIPARTIMENTO DI BIOLOGIA

Corso di Laurea in Scienze Biologiche

APPUNTI TRATTI DALLE LEZIONI DI

BIOLOGIA DELLO SVILUPPO


Dei prof. Vignali e Andreazzoli

Studente:
MONICA PERRI

ANNO ACCADEMICO 2017-2018


Alcuni embrioni dividono lo zigote secondo un piano ortogonale al piano normale e quindi separa la semiluna
grigia in modo tale che solo un blastomero riceve le cellule della semiluna (quello dorsale): se separo i blastomeri,
quello che non ha ricevuto la semiluna grigia forma un embrione incompleto ventralizzato (è come una porzione
d’addome, non è vitale), mentre quello che ha ricevuto la semiluna è un embrione normale leggermente
dorsalizzato. Quindi la capacità regolativa non è uniforme, ma è al 100% solo in alcuni casi: il blastomero
dorsalizzato manca d alcuni determinanti per formare le strutture dorsali.

Capacità di regolazione dimostrabile anche allo stadio di gastrula, si è formato il labbro dorsale del blastoporo:
- dividendo a metà l’embrione con un
capello secondo il piano di simmetria
quindi a livello delle lebbra dorsali e
ventrali (le due metà controlaterali) ->
ognuna delle due metà da origine a un
embrione normale completo
- dividendo in modo perpendicolare al
piano di simmetria (il labbro dorsale
finisce solo da un lato) -> avremo un
embrione normale un po’ dorsalizzato,
ma regolato e uno incompleto senza
regolazione totalmente ventralizzato.

Quindi:
1. Capacità regolative non sono equivalenti in base a come dividiamo embrione
2. C’è un qualche regolatore sul labbro dorsale del blastoporo (lato dorsale presuntivo).

Spemann e Mangold:
- Prelevano la zona al di sopra della fessura del
blastoporo, ovvero il labbro dorsale da un embrione, in
particolare dal lato dorsale di una giovane gastrula e lo
inseriamo nel lago ventrale di un embrione ospite.
- Quando la gastrula va avanti nello sviluppo si forma un
secondo archenteron e un secondo embrione unito al
principale per il lato ventrale -> se togliamo embrione
in sezione trasversale vedo un organizzazione i cui ho
un asse primario: tubo neurale somiti, mesoderma,
tubo digerente, notocorda -> stessa cosa nell’asse
secondario.

Posso riconoscere le cellule che ho inserito (sono quelle


bianche) e vedere a cosa hanno contribuito: forniscono i
somiti in prevalenza e tutto il tubo neurale.

Quindi:

1. Cellule che formano il tubo neurale (struttura ectodermica dorsale, sono cellule neutralizzate)
secondario sono dell’ospite, ma la loro caratterizzazione è indotta dalla nostra inserzione; infatti
normalmente formerebbero l’ectoderma (in particolare epidermide);
2. Cellule dei somiti (mesoderma parassiale dorsale) avrebbero formato il mesoderma, in particolare
mesoderma laterale ventrale.
3. Il mesoderma viene dorsalizzato
Il tessuto trapiantato ha riprogrammato le cellule dell’embrione ospite (influenzato dalle cellule vicine):
fenomeno di INDUZIONE (in questo caso induzione primaria perché si pensava fosse il primo evento nello
sviluppo embrionale -> dorsalizzazione del mesoderma).
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Proprietà dell’organizzatore, ovvero il labbro dorsale:
A. Guida i movimenti della gastrulazione -> inizia la formazione di un secondo seno di invaginazione
B. Neuralizza l’ectoderma (induzione neurale) -> si ha la trasformazione dell’ectoderma ventarle in tubo
neurale, quindi neuroectoderma
C. Dorsalizza il mesoderma -> trasforma il mesoderma ventrale in somiti

Per queste ragioni il labbro dorsale è detto organizzatore, o organizzatore primario o organizzatore di Spemann.

100 embrioni di tritone sono stati sottoposti a questo esperimento, non c’erano antibiotici -> su embrioni vivi,
quindi subiscano infezione batterica e morivano -> solo 1 su 100 vivente.

Il territorio Dorsal dell’ectoderma diventa tessuto neurale.


Lo preleviamo a uno stadio precoce di gastrula: lo trapiantiamo generalmente non ha ancora ricevuto i segnali
induttivi perché l’organizzatore che diventerà notocorda non è ancora arrivati sotto l’ectoderma per indurlo. Allo
stadio di gastrula tardiva è già stato indotto dal mesoderma dorsale sottostante se lo inietto nell’embrione ospite
ventralmente questo darà tessuto neurale (piastra e tubo neurale) -> a questo livello quindi è già stato indotto a
essere neuroectoderma.

Labbro dorsale precoce dell’organizzatore quindi preso a livello di gastrula precoce induce la formazione di una
testa: vediamo che la gastrulazione avviene, a seguito dell’involuzione la parte da noi inserita finisce nella cavità
del blastocele nel lato ventrale dando origine a cellule dell’epidermide e inducendo il lato dorsale alla formazione
della testa.
Labbro dorsale a stadio tardivo
invece induce strutture posteriori:
quindi il primo mesoderma che
involve induce strutture anteriore,
l’ultimo mesoderma che involve V V
(mesoderma caudale) induce strutture V
V
posteriori. Ho un’informazione D
spaziale contenuta nell’organizzatore
nel labbro dorsale che cambia nel
corso dello sviluppo.

Lezione 20 Aprile

Mappe dei territori presuntivi:


Allo stadio di 2 cellule marchiamo un singolo blastomero tramite un colorante fluo; lasciamo procedere lo
sviluppo fino allo stadio di bottone caudale e ora sezionando l’embrione vediamo la posizione delle cellule
marcate e la loro funzione finale.
In questo modo costruiamo una mappa di tutti i destini cellulari.

Altro esperimento:
Isoliamo il frammento dell’embrione -> si differenzia seguendo il
destino che compete al suo stato di specificazione.

Se isoliamo un frammento specifico di tessuto allo stadio di 32


cellule il blastomero origina ectoderma -> quindi si differenzia in
modo diverso rispetto all’interno cellulare (normalmente darebbe
mesoderma).

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Possiamo rifare l’esperimento allo stadio di blastula finale (al termine della segmentazione), in cui nell’embrione
troviamo molte più cellule: isoliamo cellule animali che daranno ectoderma o isoliamo quelle vegetative che
daranno un tessuto simil-endodermico, cellule della porzione dorsale danno principalmente notocorda.

Abbiamo quindi definito lo stato di specificazione di queste cellule.

Facciamo l’esperimento per tutte le cellule della blastula definendo la mappa di specificazione.
Tutte le cellula delle parte animale sono equivalenti, cioè tutti danno ectoderma non neurale (epidermide).

MODELLO A DUE SEGNALI

Possiamo isolare la parte animale e la parte vegetativa dall’embrione, poi le mescoliamo coltivandole in un
“coniugato”: compare del mesoderma, tessuto che nessuno delle due parti isolate riuscirebbero a formare.
Quindi insieme le due parti si scambiano dei segnali e riescono a dare origine al mesoderma (rinomatamente
dalle cellule dorsali).
Se marchiamo le cellule animali il mesoderma che si originano dal coniugato vediamo che il mesoderma si forma
a spese delle cellule animali; concludiamo quindi che sono le cellule vegetative che inducono quelle animali a
formare mesoderma.

Possiamo dimostrare che la parte dorsale e ventrale vegetative hanno capacità induttive:
- Parte dorsale + animale -> mesoderma dorsale (notocorda)
- Ventrale + animale ci -> mesoderma ventrale e laterale

Quindi il mesoderma nell’embrione è il risultato dell’induzione da parte di alcuni segnali.

Il quadrante centrale è il centro di Nieuwkoop, ovvero il centro segnalatore che è in grado di indurre
l’organizzatore di Spemann.

Come si vede che è un centro segnalatore?


Se preleviamo dall’embrione donatore delle cellule allo stadio di 32 blastodermi dorsali vegetative e le
trapiantiamo nel lato ventrale di un embrione ospite vediamo la formazione di un asse secondario (embrione con
due assi e due porzioni dorsali) -> è un centro dorsalizzante con delle molecole segnale che inducono la
formazione di un altro .
Dentro il blastomero dovrà esserci qualcosa che segnala all’embrione che deve formare un secondo asse, questo
è il centro di attività dorsalizzante perché il lato ventrale diventa dorsale.

Differenze con l’esperimento di Spemann:


- Esperiemnto di Spemann è fatto allo stadio di blastula, qui a 32 cellule
- L’organizzatore induce tessuto neurale e dorsalizza il mesoderma ventrale, MA l’organizzatore in sé dà
origine alla notocorda essenzialmente = corrisponde al territorio presuntivo della notocorda, se
trapiantato dà notocorda e se isolato dà notocorda, quindi l’organizzatore è DETERMINATO.
- Per vedere a cosa da origine il centro di N prima di trapiantarlo lo marchiamo:
dalla mappa del destino allo stadio di blastula sappiamo che i blastomeri trapiantati, che corrispondono
al centro di N dovrebbero dare origine all’endoderma, in realtà determina la formazione dell’asse
secondario perché inducono un secondo organizzatore che guidi la formazione di un asse secondario e
quindi la dorsalizzine del mesoderma nel polo animale.

Questo centro organizzatore è quindi precedente a quello di Spemann: quello di Spemann è un organizzatore
secondario, indotto da uno primario che è quello di Nieuwkoop.
I primi eventi induttivi sono l’induzione di mesoderma da parte di cellule vegetative, una parte dei quali può
specificare l’organizzatore di Spemann (mesoderma più dorsale).

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Esperimento:
Inibiamo la rotazione corticale irradiando con raggi X o UV la parte vegetative di Xenopus.
La rotazione corticale normalmente porta alla formazione del centro di N e definisce il lato dorsale.
Irradiamo massimo 30min dopo la fecondazione, in questo modo possiamo inibire la rotazione:
1. Totalmente = si forma un embrione ventralizzato, senza strutture dorsali .

Però se allo stadio di 32 cellule trapiantiamo un blastomero dorsale vegetativo da un embrione normale,
l’embrione ventralizzato recupera a questo stadio un normale sviluppo dell’embrione (esperimento di “rescue”).
Concludiamo che la ventralizzazione è abolita se inseriamo un centro di Nieuwkoop, quindi l’irradiazione aveva
degradato il centro.

2. Parzialmente (ventralizzazione graduale, vedi img).

Saggio di induzione mesodermica:

Le cellule animali possono essere convertite a mesoderma se coniugate con le vegetative -> cellule animali sono
competenti a ricevere un segnale e a rispondere il mesoderma, rispetto al tipico ectoderma che dovrebbe
formarsi.
Vogliamo trovare dei fattori di crescita o molecole secrete che inducano le cellule a diventare mesoderma.
I Tipo di Esperimento: somministriamo dei fattori alle cellule animali e vediamo se si differenziano realmente in
mesoderma.
Ci serve sempre un esperimento di controllo: mettiamo le cellule animali in coltura senza fattori di crescita,
vedremo che danno origine ectoderma.
Se inseriamo i fattori di crescita singolarmente al mesoderma troviamo quei fattori che sono sufficienti, ma non
sappiamo se sono necessarie.

Come sappiamo quali molecole intervengono?


II Tipo di Esperimento: usiamo degli inibitori dei possibili induttori e usiamo un inibitore per volta -> quando
un inibitore usato realmente inibisce la formazione del mesoderma, concludo che quella molecola inibita è
coinvolta (necessaria, ma non sufficiente) nell’induzione del mesoderma.
È un esperimento di loss of function

I Tipo di Esperimento: Saggi di induzione (MOLECOLE SUFFICIENTI)

- Iniezione diretta dei fattori di trascrizione


- Microiniezione di mRNA nella parte animale dell’embrione allo stadio di 1,2, 4 o 8 cellule; poi allo stadio
di blastula (quando queste cellule sono ricche in mRNA che rimarrà soprattutto nella parte animale)
isoliamo queste cellule in saggi detti “animal camps”.

Facciamo poi dei saggi biochimici o molecolari su questi campioni isolati per vedere se si è formato del
mesoderma.
Controllo: embrioni iniettati con solo soluzione tampone, acqua o mRna neutro (come beta-galattosidasi che
serve solo per marcare le cellule) -> se isolate devono dare solo ectoderma.
Le cellule animali possono rispondere a questi segali solo in un lasso preciso di tempo: dallo studi di blastula fino
a metà gastrulazione (circa 11 settimane), perché successivamente perdono la competenza.

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Quali sono le molecole che inducono le cellule animali?

Activina: è stato dimostrato che può indurre mesoderma, è la prima classe per la quale è stata dimostrata
questa attività.

Sono molecole secrete (quindi nello spazio intracellulare) della famiglia TGF beta, legano recettori con attività
serina-treonina chinasi e inducono VARI tipi di tessuti mesodermici.
C’è un altro gruppo di molecole simili -> BMP che appartengono anche loro a questa superfamiglia.

Le molecole secrete di activina legano recettori formati da 2 tipi di monomeri diversi e ogni recettore è formato
da 4 monomeri = due di un tipo e due di un altro. Quando il legame avviene il recettore di tipo 2 determina una
fosforilazione dell’altro (tipo 1) e ciò determina l’attivazione del complesso recettoriale. Questo complesso
attivato quando arriva il ligando agisce con la sua attività chinasica fosforilando i siti serina o treonina di effettori
intracellulari = Smad 2 o 3; questi si complessano con Smad 4 e il complesso (detto anche coSmad) va nel
nucleo dove funziona come fattore di trascrizione e accende geni che rispondono in modo immediato (early
response genes).

I BMP si legano sempre a recettori di tipo 1 e 2, ma non gli stessi dell’activina: quando il ligando arriva il
complesso viene attivato e fosforila smad 1,5 che, assieme a smad 4 (condiviso dalle 2 vie di segnale) agisce su
altri geni (geni di risposta a BMP). BMP e activina sono entrambe appartenenti alla superfamiglia dei TGF beta
le vie sono simili ma non identiche -> diverse risposte biologiche.

L’activina può indurre vari tessuti mesodermici:

1) Il controllo dà epidermide;
2) Se diamo activina a basse dosi si forma mesoderma
ventrale;
3) Aumentando progressivamente otteniamo muscolare,
poi notocorda ;
4) Ad alte concentrazioni otteniamo cellule cardiache

*img di animal cap trattati con activina: A cellule di controllo, B


trattamento a basse dosi = mesenchima ed epitelio celomico
(simile a splancnopleura e alla somatopleura, quindi mesoderma
laterale ventrale), D muscolo e notocorda che possono
eventualmente agire sulle restanti epidermiche e -> C tubo neurale.

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Questo tipo di analisi era quella che veniva fatta un tempo ovvero pezzi di embrione venivano tagliati ed
esaminati i tessuti dal pt di vista istologico. OGGI si dispone di marcatori molecolari per verificare la
formazione del mesoderma: marcatori dell’organizzatore, marcatore di mesoderma ventrale e laterale
(questi due vediamo espressione allo stadio di gastrula in blu scuro), nella giovane neurula vediamo la
notocorda con il marcatore della notocorda, l’actina marca il tessuto muscolare somitico etc.

L’attività dell’activina è dose dipendente = a basse dose si accendono, per esempio, marcatori di mesoderma
ventrale e, mano a mano che aumenta la dose, si accendono quelli più dorsali (sono geni di controllo accesi
sempre = marcatori housekeeping e ci servono a capire se c’è abbastanza RNA nel campione che stiamo
analizzando) -> Northern blot con cui si va a vedere l’espressione dei geni *img con varie dosi di activina si
induce accensione di geni più dorsali o più ventrali.
FGF, membro della famiglia dei fattori di crescita dei fibroblasti, sono secreti e legano recettori tirosina-
chinasi. Possiamo accendere marcatori ventrali o pan mesodermici o parassiali MA non viene mai
prodotta notocorda, neanche aumentando la dose.

Queste 2 classi di molecole sono quindi sufficienti a indurre il mesoderma

Esperimento del secondo tipo:

MOLECOLE NECESSARIE: inibiamo le vie di segnalazione (dobbiamo ovviamente sapere come sono
strutturate).

Blocco della via del FGF


Serie di eventi a catena innescati dall’attivazione del recettore dovuta all’arrivo del ligando, questi
recettori sono formati da porzione extracellulare + dominio transmembrana + porzione intracellulare
chinasica, i 2 monomeri sono identici (diverso dall’activina).
La via veniva bloccata (in xenopus) producendo recettori tronchi per la via del FGF: viene clonato il
cDNA per l’intero recettore ed introdotta mutazione che troncasse la traduzione ad un certo livello, poi
RNA iniettato negli embrioni in modo che fosse sovrabbondante = risultato era un recettore tronco
senza porzione intracellulare (sono necessari 2 domini recettoriali intracellulari per attivare la trasduzione
del segnale).
Iniettandolo in maniera sovrabbondante i recettori dell’embrione saranno prevalentemente tronchi -> o i
monomeri si complessano fra loro o si complessano con i pochi monomeri wild type presenti -> in ogni
caso non parte la trasduzione del segnale perché servono due domini.

Blocco della via dell’activina -> si genera un recettore tronco con la stessa strategia di impedimento
dell’azione dei recettori wild type usata per FGF (perdita di funzione) -> questi recettori tronchi sono
detti dominanti negativi (dominano il wild type e producono mancanza di trasduzione).

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Brachyury è generalmente acceso dall’activina ed è panmesodermico
(=tutto il mesoderma) -> si inietta mRNA solo in uno dei 2 blastomeri
e poi si fa un’ibridazione in situ per brachyury per vedere se è acceso
normalmente (*img embrioni di controllo = forma un bel cerchio
intorno al blastoporo) -> il gene NON c’è, l’espressione è limitata a una
metà dell’embrione (quella dove non è stato iniettato RNA), per cui
possiamo impedire induzione del mesoderma.

Modello a due segnali:


Si può presumere che un segnale sia l’activina (che induce anche l’organizzatore) e
l’altro FGF (che induce il mesoderma ventrale e laterale), oppure possiamo combinare
i due segnali *img con un gradiente di activina più concentrata nel lato dorsale e FGF
distribuito in modo costante (sembra essere così nell’embrione di xenopus) -> con
questo modello si cerca di spiegare l’induzione di mesoderma nella parte equatoriale
distinto fra in organizzatore della parte dorsale (O) e mesoderma ventrale laterale
(MVL) O.

Queste molecole (activina e FGF) ci sono nell’embrione?


Si, alcune sono materne e altre prodotte da geni zigotici.

Centri di attività dorsalizzante: centro di Nieuwkoop e organizzatore di Spemann.

Lo Xenopus ha consentito di isolare molecole in grado di riprodurre l’attività dorsalizzante di questi centri ->
proviamo a iniettare RNA, nel lato ventrale dell’embrione, per geni che presumiamo possano avere attività
dorsalizzante -> se si ha la formazione di un secondo asse, allora possiamo concludere che questi RNA hanno
attività dorsalizzante e forse mimano l’attività del centro di Nieuwkoop o dell’organizzatore.

Larva di xenopus: effetto mRNA di activina in dose


sufficiente (ricorda, activina in dose sufficiente induce
notocorda) -> è come se trapiantassimo l’organizzatore, si
induce asse secondario.

Se ora iniettiamo RNA che mima il centro di Nieuwkoop: ci si


aspetta la formazione di un asse secondario. Una molecola di questo
tipo è Wnt8 è un omologo di Wingless (nei vertebrati ce ne sono
tanti) ed è stato il primo per cui è stato dimostrato il suo effetto
dorsalizzante MA non è in grado di indurre mesoderma, non è
come l’activina -> possiamo pensare che faccia parte della via che
porta alla specificazione dell’organizzatore.

È un ligando che funziona attraverso una via di trasduzione del segnale ->
Wnt lega Frizzled e attiva via di trasduzione con molte componenti
citoplasmatiche fra cui Dsh, che inibisce l’azione del complesso in cui si
trova GSK3 = inibita degradazione della molecola beta catenina che può
funzionare come fattore di trascrizione -> entra nel nucleo e con l’ausilio
cofattori accende i geni ad attività dorsalizzante. In assenza del ligando, la
GSK3 determina fosforilazione della beta catenina e questa è degradata.

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La beta catenina si trova nel lato dorsale dell’embrione *img nuclei con beta catenina, oggi sappiamo che la sua
azione dipende dalla rotazione corticale.
Dsh è nella parte vegetativa all’inizio dello sviluppo e Wnt11 materno sta al polo vegetativo -> queste due
componenti con la rotazione corticale vanno sul lato dorsale e iniziano attivazione della via della beta catenina =
dorsalizzazione.
Sul lato opposto = assenza attivazione, GSK3 attiva, niente dorsalizzazione = lato ventrale.

Esperimento:
Eliminiamo la beta catenina materna (mRNA) -> si bersaglia con oligonucleotidi a RNA antisenso, si ibridano
alle molecole e all’interno dell’embrione le molecole, con questi eteroduplex di doppia elica, sono degradate =
eliminato contributo materno del RNA di beta catenina = no proteina, conseguenza?
Si forma mesoderma ventrale anche se presenti activina e FGF, non viene specificato organizzatore perché
necessaria beta catenina.

MODELLO SINERGISTICO:
nel lato dorsale dell’embrione l’azione della beta catenina si complementa agli
induttori del mesoderma (ricorda, senza beta catenina niente mesoderma
dorsale anche se ci sono FGF e activina), nella zona dove si ha
sovrapposizione di localizzazione fra activina/FGF e beta catenina si ha la
specificazione dell’organizzatore.
In termini molecolari la sinergia di queste 2 vie è mostrata *img -> gene
goosecoid (ma anche altri geni dell’organizzatore possono essere attivati in
questo modo):

- Può essere attivato perché la beta catenina (+ fattore Tcf-3) attiva un


gene per una proteina (Siamois) che a sua volta attiva il gene di
goosecoid (fattore trascrizionale che lega la regione regolatoria).
- Nella regione regolatoria di goosecoid agiscono anche le molecole
della via di trasduzione di TGF beta, cioè le activine.

Quindi le due vie convergono sulla stessa regione regolatoria determinando


l’accensione del gene dell’organizzatore. La specificazione dell’organizzazione,
in termini molecolari, vede la sinergia fra la via di Wnt attraverso Siamois e della via di activina e TGF beta.

Lezione 2 Maggio

Massimiliano Andreazzoli: massimiliano.andreazzoli@unipi.it


Ricevimento: lunedì h 12-13

Riprendiamo:
Le cellule vegetative producono segnali di induzione mesodemica.
Drosophila -> ha permesso comprensione dello sviluppo embrionale con generale.
Anfibi -> ha permesso la comprensione dello sviluppo embrionale tipico dei vertebrati.

Anfibi e pesci hanno sviluppo esterno a differenza dei mammiferi -> per questo riusciamo a fare studi
embrionali avanzati.

Nieuwkoop si domandò come si formasse il mesoderma: vediamo territori presuntivi su anfibio diviso a metà ->
zona marginale darà mesoderma (muscolatura, cuore, sangue ossa), zona vegetale da endoderma (darà tubo
digerente primitivo nei vertebrati da cui i formerà il tubo digerente definitivo dell’adulto e tutti gli organi annessi
come fegato pancreas e polmoni) e polo animale darà ectoderma (tessuto neurale, epidermide).

Domanda di Nieuwkoop: come si forma il mesoderma?


N.B. Mesoderma dorsale è quello che va incontro a epibolia.
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Nieuwkoop capì che era l’endoderma ad indurre il mesoderma: prese la massa vegetativa di un embrione e lo
mise a contatto con l’ectoderma di un altro embrione e lasciano il tutto per più di un giorno vide che l’ectoderma
era diventato mesoderma -> ora usiamo marcatori specifici per mesoderma con ibridazione in situ, mentre
Nieuwkoop usava all’epoca sistemi istologici (implicano tempi più lunghi).
Vediamo che il mesoderma is forma nella regione intermedia di contatto fra polo animale e vegetativo, è quindi
una regione di confine. Se lasciamo il tutto a contatto per più di un gg tutto il polo animale si convertiva in
mesoderma.

Come siamo sicuri che siano le cellule endodermiche e non quelle ectodermiche ad indurre il mesoderma?
Marchiamo le cellule ectodermiche e vediamo che sono quelle che si trasformano in mesoderma, quindi deve
essere l’endoderma ad indurre il cambiamento. Possiamo usare organismi albini di Xenopus e wild type (che
hanno calotta animale di colore marrone scuro (in modo da distinguere le due porzioni embrionali) o usiamo
marcatori specifici (con GFP o coloranti vitali -> iniettiamo un mRNA messaggero codificante per la GFP
anche allo stadio di una cellula in modo che nelle divisioni successive sarà espresso e tutta la calotta animale sarà
di colore verde fluorescente).

Esperimento: Induzione del mesoderma di Dale e Slack

Usano un embrione più precoce alo stadio di 32 cellule -> a questo stadio in cui possiamo ancora fare una
mappa del destino si chiedono se c’è una differenza fra il mesoderma indotto dai blastomeri dorsali, ventrali o
intermedio vegetativo.
Quindi si procede mettendone a contatto l’ectoderma con i singolo blastomeri separati del polo vegetativi:
vediamo il blastomero D1, il blastomero più dorsale, il D2 e D3 , sono quelli intermedi, e D 4 che è il più
ventrale -> valutiamo non solo l’induzione, ma anche il tipo di mesoderma indotto.
Dividiamo tre tipi di mesoderma: dorsale, intermedio e ventrale.

- Ricombinando D1 con polo animale nel 77% dei


casi otteniamo mesoderma di tipo dorsale e 23%
dei casi con mesoderma intermedio e 05 die casi
on mesoderma ventrale.
- Se uso D2 (intermedio più vicino a quello dorsale)
nel 61% dei casi ho mesoderma intermedio, 28 %
mes ventrale e 11 % mes intermedio .
- Se uso D3 , intermedio più vicino. Ventrale, 55%
dei casi ho mesoderma ventrale, 45 % intermedio e
5% dorsale.
- D4, blastomero vegetativo ventrale ottengo 42%
intermedio, 42% vetrate e 16% dorsale -> caso più
strano.

Deduciamo che la posizione dei diversi blastomeri vegetativi determina il tipo di mesoderma lungo l’asse dorso
ventrale che si formerà quando vengono messi a contato con la calotta animale. Vediamo che non ho una
separazione netta dell’induzione, ma è una situazione di sviluppo piuttosto plastica.
Quando ho un problema complesso non studio l’embrione intero, ma divido in protoni e studio
separatamente le varie parti.

N.B. Mentre la ascidie hanno uno sviluppo molto selettivo d tipo a mosaico, gli anfibi sono molto più vicini a
uno sviluppo di tipo regolativo, quindi sono più plastici.

ROTAZIONE CORTICALE

Avviene nella fecondazione, ho una rotazione del citoplasma corticale, detto cortex, che ruota rispetto al
citoplasma più interno -> in seguito alla rotazione viene definitivo l’asse dorso ventrale -> il pt di entrata dello
spermatozoo è il lato ventrale, quello opposto darà il lato dorsale.
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Rotazione è determinata dal citoscheletro, ovvero dalla polimerizzazione dei micro tubuli.

Esperimento:

Irradiamo con UV la parte vegetava (usiamo questa parte per convenzione), raggi UV bloccano la
polimerizzazione die microtubuli e in base alla quantità di UV irradiati o alla durata del trattamento posso avere
un blocco parzialmente o completo della rotazione corticale -> l’embrione manca di strutture anteriori e alcune
dorsali per trattamenti basi o intermedi, con forte trattamento invece l’embrione avrà solo strutture di tipo
ventrali.

Trapianto dal centro di Nieuwkoop:

Trapiantiamo blastomero vegetativo da embrione normale in embrione irradiato con UV.


È stato visto che se prendiamo un blastomero vegetativo dorsale e lo sostituiamo in un blastomero vegetativo
dell’embrione tratta con UV, si formerà una larva normale.

Altro saggio: trapiantiamo blastomero vegetativo dorsale in un embrione normale in cui viene eliminato un
blastomero vegetativo ventrale -> l’embrione formerà due labbra del blastoporo, quindi avremo due principi
della gastrulazione e si formeranno due assi corporei.

Quindi il blastomero dorsale vegetativo deve avere qualche particolare caratteristica che gli permette di
recuperare un embrione di formare un asse dorso ventrale: è il blastomero che induce il mesoderma dorsale.

Esistono due tipi segnali:


1. Uno induce mesoderma generale;
2. Un altro induce mesoderma inviato da cellule dell’endoderma dorsale -> quindi viene indotto il labbro
dorsale (che è l’organizzatore).

Molecole coinvolte in questi due segnali devono avere dei requisiti:


- Espressione nell’endoderma;
- Espressione nel blastula precoce (molto prima della gastrulazione);
- Deve avere l’attività di induttore mesodermico, mimando dli effetti dei trapianti di cellule endodermiche
(indurre secondo organizzatore).

Per vedere l’espressione nell’endoderma usiamo anticorpi, con la tecnica dell’immunostained, o ibridazione in
situ; per vedere espressione al momento della blastula precoce facciamo una RT-PCR o Western Blot, se
vogliamo seguire la proteina.
Per saggiare l’attività da induttore mesodermico: facciamo saggio di induzione mesodermica o saggio degli
animal caps che consiste nel prelevare la calotta animale, metterla su piastra Petri in soluzione fisiologica (senza
fattori di crescita o altri ormoni -> questi vanno invece aggiunti nel caso dei mammiferi) .
Passiamo poi ad aggiungere nel terreno un fattore specifico per vedere se quella molecola riesca a indurre o
meno il mesoderma (se si allora ha l’attività di induttore mesodermico)-> se lasciamo animal cap nella sola
soluzione fisiologia darà ectoderma, mentre nell’embrione la parte darebbe sistema neurale e epidermide.
Quindi le animal cap son cellule pluripotenti che in base al contesto riescono a sviluppare diverse tipologie
cellulari -> sono plastiche.
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Usando questi criteri ora sappiamo che i fattori coinvolti sono:
- Zigotici: proteine sintetizzate dallo zigote dopo la blastula transition in cui si attiva la trascrizione zigotica
come TGF-beta, tra cui le Xenopus Nodal Related (Xnr1, Xnr2,Xnr 4) che sono simili all’activina (stessa
famiglia) e derrier;
- Materni: come TGF-beta -> sia fattori secreti quale Vg-1 che fattori di trascrizione come Veg-T ->
depositati nella parte vegetativa dell’oocita, sono sia mRNA che proteine.

Veg T e Vg 1 sono ereditati come messaggeri: Vg 1 nella parte vegetativa dell’ovocita, visto con ibridazione in
situ di un embrione sezionato (spiega tecnica di ibridazione in situ) -> simile situazione per Veg T.
Vg 1 e Veg T riescono ad attivare brachiuri, un fattore trascrizione che a sua volta un FGF particolare, eFGF
(FGF embrionale) -> eFGF è una proteina secreta che ha come effetto un’ulteriore attivazione di brachiuri (è un
feedback positivo sull’espressione di brachiuri).

Con ibridazione in situ vediamo espressione di brachiuri (in img


vediamo lato vegetativo, stadio di una blastula precoce, segno nero
apicale è l’inizio della gastrulazione con le cellule a bottiglia ):
distribuzione ad anello, in sez trasversale è espresso in punti specifici
(marcati in rosso) marginali sul lato vegetativo che corrisponde al
mesoderma.

Brachiuri non solo è un marcatore, ma è un gene fondamentale ne l’induzione mesodermica perché è i primo
gene mesodermico ad essere attivato (poi espressione mantenuta con feedback) e brachiuri attiverà a sua vota
tutti gli altri geni mesodermici.

*rivedi cascata di segnalazione TGF-beta e BMP

Un secondo segale è quello inviato dal centro di Nieuwkoop-> induce mesoderma dorsale grazie alla beta-
catenina. È una molecola di adesione che permette l’interazione fra cellule, in particolare la beta catenina ha
anche una fx di elemento di traduzione finale, ovvero un effettore di Wnt.

Via di trasduzione del segale:


Wnt sono proteine secrete, bene distinte da TGF. Beta perché hanno un loro proprio recettore, frizzled.
Wnt interagisce con frizzled e si attiva nella cascata di attivazione al proteina disheveled che inibisce la
formazione del complesso che comprende anche una chinasica, la GSK-3, quindi viene inizia la fosforilazione di
questa chinasi sulla beta-catenina -> se fosforilata a la beta catenina viene inibiate verso la degradazione. Quando
non viene degradata, la beta catenina può entrare nel nucleo e associarsi al cofattore LEF/TCF e attivare la
trascrizione di geni specifici. LEF/TCF in realtà quando non c’è la beta catenina si trova legata ai promotori di
geni specifici, inibendone le trascrizione, l’arrivo della beta catenina per la formazione di un complesso che attiva
la trascrizione.

Lezione 3 Maggio

ATTIVAZIONE DELLA BETA-CATENINA

Avviene solo nel lato dorsale dell’embrione precoce -> vediamo la sua localizzazione tramite esperimenti di
immunostaining (anticorpi che legano beta-catenina).
In img abbiamo immunostaining in cui evadiamo che nel lato dorsale abbiamo il centro delle cellule in marrone,
è la beta-catenina espressa nel nucleo.

Perché attivazione è solo dorsale?


Dovuto alla rotazione corticale -> dovuta all’arrivo dello spermatozoo che rilascia non solo il proprio dna, ma
anche un centriolo, ovvero un elemento essenziale per l’organizzazione dei microtubuli -> dopo la fusione con
la cellula uova il centro riorganizza i microtubuli è portata alla rotazione corticale).
61
Dopo la rotazione abbiamo delle vescicole nella cortex contenenti disheveled, Wnt11 e GBP (un’altra proteine
che inibisce GSK-3) che rilasciano il loro contenuto nella loro nuova posizione dorsale. Il contenuto può
diffondere, perché abbiamo ancora un sincizio e si forma quindi un gradiente di concentrazione di queste
proteine.

- Disheveled: attivata da Wnt che si lega con frizzled, va ad inibire GSK-3 quindi permette la
stabilizzazione della beta catenina -> interagisce con TCF -> attiva geni specifici.
- Wnt11 agisce come disheveled, ma più a monte ovvero fornisce uno dei componenti della famiglia Wnt
che si legherà a frizzled e attiverà la cascata fino ad attivare geni specifici nel nucleo.
- GBP: in maniera indipendente da disheveled inibisce la GSK-2.

Sono dei meccanismi ridondanti che agiscono sulla stessa via metabolica per evitare che una mutazione su una
delle tre proteine causi problemi troppo gravi.

Avremo quindi un gradiente cdi beta catenina che entra nei nuclei: gradiente max nella parete dorsale e
diminuisce molto rapidamente spostandoci verso il lato ventrale.

Meccanismi molecolari dell’induzione dell’organizzatore:

- Vg 1 è una proteina secreta per cui fx anche a una certa distanza


dalle cellule in cui viene prodotto. Quindi la formazione del
mesoderma dorsale deriva sia dall’azione di Vg1, ma anche
dall’attivazione di beta catenina che a sua volta attiva vari geni
come siamois. Siamois è un fattore di trascrizione

- Beta catenina si ritrova in tutto il lato dorsale, arriva fino al


mesoderma: in base alla zona in cui si ritrova troverà vari recettori
e quindi attiverà geni differenti.
Siamois interagisce con smad che interagisce con Vg1 e Nodal e
agiscono sullo stesso promotore attivando goosecoid
nell’organizzatore.

- VegT è espresso insieme a Vg1, ma è un fattore di trascrizione,


non una proteina secreta che ha la fx di inibire che i geni
dell’organizzatore vengono accesi nell’endoderma.

Nel corso dello sviluppo sarà fondamentale l’attivazione o lo spegnimento


di determinati geni per il differenziamento cellulare.

Goosecoid:
Il nome deriva dalla fusione di due geni di Drosophila: goosberry e bicoid; perché l’omeodominio di questo gene
in goosecoid sembrava una via di mezzo fra gli omeodomini di questi due geni i drosophila.
Espresso nel mesoderma che formerà labbro dorsale del blastoporo.
Per vedere la sua attivazione e funzione con l’organizzatore di Spemann esperimento:
Iniettiamo un mRNA di goosecoid nella parte ventrale di embrione di Xenopus allo stadio di 4 cellule
(normalmente goosecoid è espresso nella parte dorsale) vediamo che si formeranno due labbri dorsali, quindi
due assi neurali quindi si sono formati due assi corporei. Se facciamo sviluppare fino allo stadio di girino
vediamo (con bassa frequenza)organismi con due assi corporei, così come si vedeva facendo il trapianto del
labbro rosale del blastoporo.
Quindi è un gene espresso nel labbro rosale precoce che ha una fx nell’attivare l’organizzatore.
L’attività dell’organizzatore di Spemann viene indotta da una serie di geni che interagiscono fra loro, fra cui
goosecoid: azione sinergica.

62
Nodal:
Azione sinergica di Vg1 e beta catenina inducono anche un gradiente di geni Nodal (Xnr 1, 2 o 4)
nell’endoderma: basse concentrazioni nel lato ventrale che mano a mano aumentano raggiungendo il loro
massimo nel alto dorsale

Xnr sono geni della famiglia TFG-beta e contribuiscono ad indurre il mesoderma.


Capiamo la fx di induzione con saggi di animal caps, come avevamo fatto per l’activina:
Porzioni trattati con nodal tendono ad allungarsi, quinDi sono cellule del mesoderma soprattutto dorsali (quelle
dorsali si invaginano di più di quelle ventrali).
Se sezioniamo gli animal caps di controllo e quelli trattati vediamo che quelli di controllo mostrano epidermide,
quelli trattati con Nodal presentano cellule allungate, vacuolate tipiche della notocorda e del mesenchima, quindi
anche qualche parte di mesoderma ventrale.

Usiamo Marcatori molecolare per vedere la presenza di mRNA specifici, facendo Northern Blot.
Iniettiamo vari embrioni con concentrazioni crescenti di mRNA di Nodal, sempre tenendo un embrione di
controllo iniettato con la sola soluzione fisiologica.

Vediamo se questi mRNA attivano geni specifici per cui inseriamo:


o Marcatori specifici del mesoderma come actina muscolare, che deriva dal mesoderma intermedio
(dal miotomo dei somiti), ma anche brachiuri e goosecoid;
o ODC che insieme all’actina citoscheletrica sono geni housekeeping; ODC è un enzima
decarbossilasi presente in tutte le cellule.

I Geni housekeeping sono marcatori di controllo positivo (per vedere se il nostro esperimento fx perché queste
proteine dovrebbero esprimersi sempre) ≠ Controllo negativo = sono gli embrioni non trattati.
Housekeeping sono anche detti errori di caricamento, che in caso di errori di caricamento della sonda nel
pozzetto possono normalizzare la differenza nella quantità di campione inserita.
ODC permettono un’analisi densitometrica.

1 pg = non si accende nulla


10 pg = si attiva brachiuri e in parte l’actina muscolare, non è acceso goosecoid
100 pg = aumento brachiuri, actina muscolare espressa allo stesso modo
1 nm = aumenta brachiuri, aumenta actina e si accende anche goosecoid

Quindi i geni nodal sono induttori mesodermici; Nodal è quindi un morfogeno, una sostanza espressa secondo
un gradiente dorso-ventrale che in base alla concentrazione attiva geni differenti.
Tecniche moderne: micro-arrays e RNA seq (sequenziamento del RNA -> ci sequenzia tutti gli mRNA presenti
nel campione trattato e in quello di controllo).

Quindi:
Gradiente di Veg T e beta catenina genere il gradente dorso ventrale di Nodal; nelle regioni con alte
concentrazioni di Nodal avremo mesoderma dorsale con organizzatore di Nieuwkoop, concentrazioni
intermedie inducono mesoderma intermedio e basse concentrazioni inducono mesoderma ventrale.

BMP4:
La regionalizzazione dorso-ventrale del mesoderma stabilita dal gradiente di Nodal, viene poi mantenuta dal
gene BMP4 in tutto il periodo della gastrulazione.
BMP4 forma anch’esso un gradiente dorso-ventrale (max in porzione ventrale, diminuisce nella zona dorsale).
Possiamo ipotizzare che BMP4 abbia un’azione ventralizzante.
Esperimento:
o Se iniettiamo mRNA di BMP4 avremo una sovraespressione del gene che si esprimerà anche
nella parte dorsale perché non abbiamo più il gradiente: osserviamo un embrione ventralizzato.
o Girino di controllo : nessuna iniezione, ho ancora il gradiente di BMP4, girino normale.

63
Esperimenti di sovraespressione sono esperimenti di gain of function che ci permette di vedere se determinati
geni sono sufficienti ad avere una determinata azione sull’embrione.

È anche necessario? Facciamo esperimento di lost of function eliminando il gene o bloccandolo.


Per bloccare BMP4 possiamo inibire la sua via di segnalazione: BMP ha una via di trasduzione simile a quella di
TFG beta, in cui abbiamo il legame con un recettore che dimerizza, in seguito a fosforilazione intervengono poi
le smad 1,5 e successivamente smad 4 che entrano nel nucleo e attivano la trascrizione di determinati geni.
Quindi possiamo inibire la dimerizzazione del recettore creando un recettore tronco (detto tBR) che ha un
effetto dominante negativo: in questo caso le BMP4 vengono comunque legate, ma non si attiva la cascata di
fosforilazione e quindi di trasduzione del segnale. Possiamo generare un cDNA in vitro che codifica per un
recettore tronco e iniettarlo in alte concentrazioni nell’embrione senza necessariamente eliminare il recettore
wild type (se è in alte concentrazioni quello tronco avremo maggiori prob che BMP si leghi ai recettori non
funzionali). Altro esperimento è vedere se trattando con UV, in seguito al quale si genera un embrione
vetralizzante, e successivamente con tBR (che nitrisce la ventralizzaione) si può inibire la ventralizzazione: in
effetti si forma un embrione quasi normale. Quindi BMP4 non solo è sufficiente, ma è anche necessaria per la
ventralizzazione (infatti se lo eliminiamo avremo una dorsalizzazione).

Lezione 9 Maggio

Rispetto a Spemann ora abbiamo individuato i geni, quindi le molecole che sono induttori neurali.
Noggin, Chordin e Follistatin non innescano una via di segnalazione, ma sono dei recettori per inibire l’azione di
BMP4.

Quindi per formare delle strutture più posteriori serviranno anche altre molecole specifiche, non solo queste tre
che vanno solo a inibire un’induzione di BMP4.

Esperimento:

- Sappiamo che normalmente l’animal cap espiantato e messo in coltura si richiude e dopo un paio di gg
da origine ad epidermide (ectoderma ventrale).

- Se invece gli animal cap vengono prima dissociati in singole cellule e poi messi in coltura questi
differenziano in tessuto nervoso (ectoderma dorsale) -> osservazione fatta già prima di scoprire noggin,
follistatin e chordin.

- Se prendiamo l’ectoderma come quello dell’animal cap che non ha ancora ricevuto i segnali
dell’organizzatore, lo espiantiamo e lo mettiamo in coltura queste cellule non saranno ancora
neutralizzate e hanno BMP4 legati ai propri recettori.

N.B. BMP4 è espresso in tutto l’embrione, a inizio gastrulazione poi tutta la parte dorsale dei tre foglietti
embrionali comincia a spegnere la traduzione di questa proteina -> questo esperimento è fatto quando è ancora
presente in tutto l’embrione) -> queste cellule in coltura danno epidermide.

Esiste un feedback positivo: BMP4 si lega al proprio recettore, dalla via di trasduzione del segnale vengono
attivati vari geni fra cui lo stesso BMP4 (il recettore è tradotto on modo costituitivi) -> attivazione da prodotto.
BMP4 prodotto verrà diffido nelle cellule vicine -> ho un’amplificazione del segnale di ectoderma ventrale.

Se invece agli animal cap aggiungono noggin, follistatin o chordin: BMP4 no si lega al recettore, quindi non parte
al via di segnalazione e la produzione dello stesso BMP4 si blocca -> non ho più un segnale ventralizzante,
quindi animal cap diventano tessuto nervoso (differenziazione stabile).

Nell’ectoderma dell’animal cap dissociati:

64
Protocollo di dissociazione della calotta animale implica trattare le cellule con EGTA o EDTA (chelanti di ioni
bivalenti positivi) -> è necessario chelare Ca2+ perché in questo modo si inibiscono le molecole di adesione fra
cellule, come le cadenine -> le cellule tendono a separarsi nel tessuto.
Poi abbiamo dei passaggi di lavaggio delle cellule in modo da eliminare le molecole come Ca2+, i chelanti e
BMP4 (perché legame con il suo recettore è un’integrazione ionica debole).
Avremo quindi cellule ectodermiche separata che esprimono il recettore, ma non hanno BMP4 -> non ho
segnale ventralizzante, si forma tessuto nervoso.
N.B. Non è la dissociazione fondamentale, ma il fatto che è stato lavato via BMP4, ovvero il segnale
ventralizzante.

Si è capito che se l’ectoderma non riceve nessun segnale (ne BMP4, ne noggin, chordin o follistatin) questo
diventerebbe sempre tessuto nervoso.

Organizzatore rilascia queste molecole che diffondono in tutti e tre i foglietti; BMP4 acceso ovunque, poi
quando sono accesi i geni dell’organizzatore, viene inibito per il meccanismo di feedback positivo.
Se facciamo ibridazione in situ con mRNA di BMP4 allo stadio di blastula vedremo che p acceso
ovunque, stesso esperimento a livello della gastrula vedremo che compare solo nella porzione ventrale.

Southern Blot, come cercare un determinato gene in una specie ancora poco studiata (conservazione del gene):
Ad esempio vediamo se un gene di Drosophila si ritrova anche nei mammiferi, in cui l’organismo modello è il
topo. Ora è un processo di confronto computerizzato, con BLAST, un programma che infranta la sequenza da
noi inserita con tutte le sequenze presenti in questa banca dati online.
Se la porzione genica di interesse non è mai stata sequenziata o clonata, perché magari è un nuovo gene,
facciamo un Southern blot quindi:
1. prendiamo il gene di Drosophila;
2. lo digeriamo per frammentarlo,
3. Corsa elettroforetica,
4. Lo denaturiamo mettendolo su un filtro di nitrocellulosa con pH alcalino,
5. Ibridiamo con sonde marcate,
6. Autoradiografia in cui vediamo le bande del gene.
Il controllo è trovare delle bande Drosophila (da cui abbiamo preso il gene da esaminare), vediamo che le
ritroviamo anche nel coleottero (ce lo aspettiamo perché è un insetto come Drosophila), ma lo ritroviamo a
anche nel pollo, e nel topo. Nel topo ho elle bande eno amracate, qudni non ho una ibridazione tiratela con al
sonda, quini la sequenza nel corso dell’evoluzione avrà subito delel muatzioni, ma fondamentalmente il gene è
conservato. Soutehrn con confronto far specie è detto Zoo Blot.

Come isoliamo la sequenza per clonarla?


Facciamo uno screening di una libreria genomica o di cDNA del topo, che poi cloniamo in vettori plasmidici o
fagici ognuno dei quali avrà un proprio cDNA, quindi un clone di una determinata sequenza.
Trasferiamo su un filtro di nitrocellulosa la piastra petri con batteri (se abbiamo fagi avremo placche di lisi
laddove ho avuto l’infezione dei fattori fagici), faccio poi una library su questa piastra: solo nelle repliche in cui
ho la sequenza omologa avrò l’ibridaziione della nostra sonda marcata, visibile poi con autoradiografia.
Poi quando ho esaminato i cloni positivi, p torno sulla piastra madre e prelevo i batteriofagi che so essere
positivi per quel gene che cerco e lo faccio crescere per ottenere molti cloni.

Esperimento Geoffroy: nel 1822 guardando un artropode nota che la distribuzione di alcun organi dorso
ventrale sia opposta a quella di alcuni vertebrati.
Il sistema circolatorio è dorsale (normalmente è ventrale), sistema digerente in posizione centrale, mentre il sis
nervoso è ventrale (solitamente è dorsale). Si è visto che alcuni geni coinvolti nella formazione asse dorso

65
ventrale in Drosophila e nei vertebrati, come Dorsal (interiorizzato solo nei nuclei ventrali) e altre proteine
secrete come sog (short gastrulation) e dpp (decapentaplegic).

- Dorsal = internalizzato solo nei nuclei ventrali e crea un gradiente discendente verso il dorso, è
ventralizzante
- Short gastrulation (sog) = proteina secreta che blocca dpp
- Decapentaplegic (dpp) = dorsalizzante, secreto nella parte dorsale all’esterno delle cellule -> raggiunge
anche cellule distanti, per una normale regionalizzazione questo non deve raggiungere le cellule ventrali per
questo la diffusione è bloccata da sog. Questo somiglia un po’ all’azione di N/C/F su BMP4, infatti dpp non è
altro che l’omologo di BMP4 e sog è l’omologo di Chordin, MA mentre dpp è dorsalizzante BMP4 è
ventralizzante e mentre sog è un inibitore di un dorsalizzante, Chordin è un inibitore di un ventralizzante.

Essendo dpp una proteina secreta che si diffonde formando un gradiente possa raggiungere cellule intermedie o
più ventrali, quindi potrebbe dorsalizzare l’embrione: interviene sog che inibisce la diffusione di dpp legandola
(come noggin, follistatin, chordin verso BMP4).
Infatti dpp di Drosophila è l’omologo di BMP4 negli anfibi, mentre sog è l’omologo di chordin.
Mentre dpp è un dorsalizzante in Drosophila, il suo omologo negli anfibi/vertebrati è un ventralizzante; chordin
è un dorsalizzante, mentre sog è un ventralizzante.

Quindi si pensa che nell’evoluzione che ha portato a mammiferi ci sia stato un rovesciamento dell’asse
dorsoventrale -> stesse molecole ma con un rovesciamento.
I vertebrati è come se fossero degli artropodi rovesciati -> definizione alla buona, ma sicuramente nel corso
dell’evoluzione c’è stato un rovesciamento nella fx di queste molecole.
Scienziati hanno visto che l’omologia non è solo funzionale, ma anche strutturale (circa 80% di omologia nel
sequenziamento). Per vedere omologia funzionale iniettiamo:
- dpp di drosophila in Xenopus; si comporta come BMP4, quindi avrà un’azione ventralizzante;
- iniettando sog in Xenopus, mima chordin quidni avrà un’azione dorsalizzante;
- BMP4 in Drosophila avrà un’azione dorsalizzante come dpp;
- chordin in Drosophila si comporta come sog, quindi azione ventralizzante.

Tornando all’organizzatore:
Continuando a cercare nell’organizzatore geni specifici si è scoperto che abbiamo altre molecole coinvolte nello
sviluppo dell’embrione.
Ricorda Xwnt8 (ottavo gene scoperto della famiglia wnt), allo stadio di gastrula precoce è espresso “a ferro di
cavallo” in tutto il mesoderma, eccetto in quello dorsale, quindi manca nell’organizzatore.
Iniettando mrna di Xwnt8 in posizione ventrale di un embrione di anfibio allo stadii 2 cellule vediamo
che is forma un asse secondario; ricorda che staio iniettando un gene che si accende solitamenet molto
dopo, allo stadio di gastrula precoce! Per cui non è detto che l’iniezione a quetso stadio rappresenti la sua
reale fx nell’embrione (mentre Wnt11 ad esempio è espresso molto prima -> migra ella rotazione
corticale). A quetso stadio precoce wnt8 va a mimare l’azione Wnt11, che agisce come dorsalizzante
dopo la rotazione corticale stabilizzando la beta catenina -> ricorda che fanno paret della stessa famiglia,
per cui on strutturalmente simili!

Come studiare allora l’azione di Wnt8?

Lo facciamo esprimere più o meno quando è espresso normalmente (a gastrula precoce abbiamo già circa 4000-
5000 cellule molto piccole, per cu non sono facilmente iniettabili.
Altra strategia: iniettiamo a 4-8 cellule non mRna, ma il suo cDNA in un plasmide con un promotore (in questo
caso dell’actina citoscheletrica > mettiamo cDNA e non sequenza di dna perché non avendo introni è più facile)
per cui la sua trascrizione sarà attivata solo quando si attiva la trascrizione dei geni zigotici, quindi al livello della
Mid Blastula Transition.
A livello della blastula tardiva avremo accumulato abbastanza tradotto di Wnt8 affinché possa agire -> molto
vicino alla gastrula precoce, ovvero al momento della sua normale espressione.
66
Da questo esperimento vediamo che manca quasi tutta la testa, manca delle parte anteriori -> embrione
posteriorizzato. Capiamo che la reale fx di Wnt8 non è indurre l’asse secondario (che è invece la fx di Wnt11),
ma avere una fx nell’indurre organi posteriori (quindi agisce su un asse corporeo diverso -> su asse antero-
posteriore, mentre Wnt11 agisce su asse dorso-ventrale).

Nierhs scopre che per formare le regioni anteriori non deve essere inibito. solo BMP4, ma anche wnt8.
Nel saggio di induzione dell’asse secondario in cui avevamo inserito solo noggin e chordin avevamo visto c he si
formava n asse secondario che maniaca delle porzioni più anteriori: dovuto al fatto c he inibito BMP4, ma non
wnt8 che quindi va ancora ad agire con azione posteriorizzante.
Nierhs rifece il saggio di induzione iniettando sia un recettore tronco di BMP4, che un allele dominante negativo
per Wnt8 -> inibendo entrambi si forma un secondo asse corporeo completo.
Facciamo un esperimento di controllo inibendo solo Wnt8: vediamo che l’organo adesivo anteriore è molto più
slargato rispetto al normale.

Lezione 11 Maggio

NICE SUNTO
Gli assi si vanno a definire in tempi diversi:
- l’asse dorsoventrale al momento della fecondazione,
- l’asso dx-sx con la prima divisione cellulare in cui si passa da zigote ad embrione a 2 cell -> una sarà
metà dx e una la metà sx.
- l’asse antero posteriore alla gastrulazione non è ancora definito, si definisce verso la fine.

Abbiamo visto che Wnt-8 favorisce la posteriorizzazione ed è stato ipotizzato che per formare strutture più
anteriori sia necessario non solo bloccare i BMP ma anche Wnt.
*esperimento visto la scorsa volta -> se bloccati si ha la formazione della testa.
Esistono molecole naturali che inibiscono gli Wnt?

Cercando nuove molecole nell’organizzatore e nelle regioni vicine (endoderma dorsale che è molto vicino, un
po’ più interno) e saggiandole sono stati isolati nuovi fattori che agiscono come inibitori

Frzb-1:
fattore secreto che, se sovraespresso, provoca mancanza delle strutture
posteriori (tronco e coda), e le strutture anteriori si espandono =
agente anteriorizzante.

Dove è espresso?
Nell’endoderma anteriore, appurato mediante utilizzo di sonda in
stadio di gastrula precoce (*img visione vegetativa, la parte scura
indica l’ibridazione).

Via di segnalazione:

Ricorda che frizzled non è l’unico recettore di Wnt (è


quello classico), ma serve anche un corecettore che è
LRP5/6 che fa partire la trasduzione = quando arriva
Wnt (generico) secreto si lega sia con Frizzled che con
LRP -> fa come da ponte fra queste due strutture
avvicinandole e questo fa sì che parta la trasduzione
del segnale. Frzb lega Wnt prima che possa
raggiungere Frizzled ed LRP (come per Noggin e
Chordin che legano BMP prima che leghi il recettore),
la struttura 3D di Frzb è simile/identica a Frizzled.

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Dkk-1:

proteina secreta inibitrice con meccanismo differente


rispetto a Frsb (isolato prima in Xenopus, poi in topo), va a
legare il corecettore LRP e in questo modo, anche se Wnt
lega Frizzled, non c’è trasduzione perché non si forma il
complesso trimerico.

Ripetendo quindi l’esperimento utilizzando inibitori naturali:


*img a_ le regioni più posteriori sono ridotte in lunghezza e
quelle anteriori allargate. Il saggio permette di verificare
l’attività anteriorizzante.
*img c_ Dkk è coiniettato con il recettore tronco di BMP
induce assi secondari completi = strutture che contengono
anche la testa.
*img e_ coiniettati mRNA di topo Dkk e Noggin = asse
secondario completamente formato.

Cerberus:

da sola è sufficiente ad indurre una testa (*img girino iniettato


con cerberus -> seconda testa).
È una molecola secreta espressa soprattutto nell’endoderma
dorsale allo stadio di gastrula precoce, regione che quindi
emerge come correlata all’organizzatore -> questo deve
comprendere l’endoderma anteriore perché ci sono molecole
con attività anteriorizzante.

Stefano Piccolo -> analizza dal punto di vista biochimico la


funzione di cerberus dimostrando che è un triplo inibitore che
da solo lega Wnt + BMP + Nodal.

N.B. Il gradiente di Nodal si forma a livello di endoderma e serve a regionalizzare il mesoderma che sta sopra ->
Nodal deve essere bloccato per evitare induzione di mesoderma quando non deve più avvenire; infatti se le
regioni di endoderma sono esposte artificialmente a Nodal tornano mesoderma = siamo ancora in una fase
plastica.
Quindi l’organizzatore di Spemann, fondamentalmente produce inibitori: inibitori BMP e di Wnt, estendendo un
pochino l’area considerata organizzatore = va a comprendere endoderma adiacente.
Schema:
Follistatin è espresso nel mesoderma della notocorda
Noggin e Chordin nel mesoderma precordale che eseguirà i movimenti di involuzione (parte anteriore)
Dkk e Frzb sono espressi nell’endoderma anteriore (diventerà endoderma faringeo) + nella piastra precordale. Si
vede un po’ di sovrapposizione nell’espressione del mesoderma e dell’endoderma.

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IGF:
sembra un’eccezione perché è prodotto dall’organizzatore e dalle cellule dell’endoderma anteriore ed è un fattore
di crescita (NON un inibitore) che negli stadi precoci promuove lo sviluppo anteriore = segnale positivo! Pur
essendo un segnale positivo attiva geni che vanno ad inibire BMP e Wnt.

Tempistiche della regionalizzazione:

Neuwkoop fece tutta una serie di esperimenti (serie di trapianti) fece molte
deduzioni che lo portarono a proporre il modello di attivazione
trasformazione (attualmente confermato). Questo modello in base ad
esperimenti di trapianto propone che l’ectoderma dorsale (stiamo parlando di
regionalizzazione di SN) sia inizialmente indotto ad essere un sistema nervoso
di tipo anteriore (caratteristiche prosoencefaliche) e sono con il passare del
tempo una parte viene posteriorizzata = con tempistica precisa arrivano
segnali che posteriorizzano una parte di SN che origina romboencefalo e
midollo spinale.

I segnali posteriorizzanti hanno un gradiente di diffusione retro-anteriore = agiscono solo nella parte posteriore,
invariata quella anteriore.

Il segnale ATTIVANTE = segnale che specifica SN come anteriore + TRASFORMANTE = quello che
modifica il destino cellulare da anteriore a posteriore.
Ricorda saggio animal cap con C/N/F -> SN era SOLO prosoencefalico.

L’animal cap è un sistema riduzionistico rispetto all’embrione completo -> la situazione è più complessa perché
arrivano anche Wnt8 (che nell’animal cap non c’è) con attività posteriorizzante + embrioni di Wnt 8.
Per cui il modello proposto da N è considerato valido: primo segnale neuralizza ectoderma + determina
caratteristiche prosoencefaliche, successivamente membri della famiglia Wnt prodotte nelle regioni posteriori
danno un gradiente postero anteriore e fino a dove questo arriva induce caratteri più posteriori
(dipendentemente dalla concentrazione).

Interessante verificare gli effetti di Wnt e inibitori durante lo stadio di girino-> *img con embrione
posteriorizzato = sovraespressione di XWnt8.

Per vedere se c’è posteriorizzazione allo stadio di gastrula tardiva -> si utilizzano marcatori = geni espressi negli
stadi precoci dei territori presuntivi di prosoencefalo +
romboencefalo + midollo :
1. Bf1 marcatore di telencefalo
2. Otx 2 marcatore di telencefalo (Bf1 lo copre) e
mesencefalo
3. Marcatore di 2 rombomeri 3 e 5

Vediamo embrione di controllo a confronto con:


- Embrione con Wnt8 >> in cui mancano una
fascia di Bf1 e Otx 2 minore, si vede che c’è un
effetto posteriorizzante perché represse regioni
anteriori ed espanse quelle posteriori.
- Embrione con frzb >> , Bf1 posteriore >>
mentre le due bande superiori ridotte =
espansione strutture anteriori a discapito di
quelle posteriori. Quindi frzb è già presente e
inizia il lavoro di anteriorizzazione.

69
Esiste un gradiente di Wnt durante lo sviluppo?
Allo stadio iniziale della gastrulazione si prelevano regioni lungo l’asse antero posteriore a diversi livelli (*img A
regioni da 1 a 8) -> si trova tanta beta catenina = significa che è arrivato tanto Wnt e ne ha inibito la
degradazione da parte di GSK. Si osserva che le future regioni posteriori (1 e 2) hanno i livelli più alti di beta
catenina che va diminuendo.

NOTA_ si fa il saggio con animal cap per capire in generale cosa fa una molecola ma è importante anche vedere
nell’embrione integro quale è la situazione.

Acido retinoico

RA = acido retinoico, essenzialmente identificato come agente importante per lo


sviluppo della retina -> prima dello sviluppo della retina agisce a livello dello
stabilirsi dell’asse anteroposteriore = posteriorizzante.
Diversamente dagli altri non è una proteina ma deriva dalla Vitamina A quindi
deriva da vie metaboliche; è liposolubile e quindi diffonde attraverso le membrane
plasmatiche ed è trasportato nel sangue fino a cellule bersaglio tramite carrier ->
rilasciato dalle proteine carrier passando attraverso la membrana.

Lega un recettore intracellulare che va ad agire come fattore di trascrizione.


*img l’acido retinoico ha attività posteriorizzante nel girino.
È un morfogeno espresso dalla notocorda secondo un gradiente posteroanteriore,
trovandosi subito sotto il tubo neurale -> le regioni posteriori del tubo neurale
ricevono un diverso gradiente.
Essendo un agente posteriorizzanti questo rinforza il modello di attivazione
trasformazione di Neuwkoop.

Fondamentalmente quindi per formare SN servono diverse molecole secrete


dall’organizzatore generalmente inibitrici di BMP (Chordin, Noggin, Follistatin) e
Wnt (Dkk, Cerberus, Frzb).

La teoria di neuwkoop è quella più accreditata perché presenti gradienti di agenti posteriorizzanti: Wnt, RA,
alcuni FGF. I diversi segnali possono avere azione diversa a seconda dello stadio in cui agiscono.

*img riassuntiva con gradienti di Wnt e BMP a inizio gastrulazione (viola e verde).
*neurula precoce (il bordo è quello della piastra neurale) il gradiente di Wnt (in blu) è postero anteriore mentre
BMP è ventrodorsale (specie di mezzaluna).

70
Lezione 16 Maggio

POLLO

Saurospide= rettili e uccelli, come esempio di saurospide usiamo il pollo.


È facile mantenerlo in laboratorio (dobbiamo solo avere un incubatore che mantiene una detraminata T di circa
37°, meno costoso rispetto a. Topo o Zebrafish) , e ha vantaggi dal pt di vista dell’osservazione -> già Aristotele
osservava ad occhio nudo l’uovo; anche ai giorni d0oggi il pollo rimane un sistema modello molto studiato ->
*nome razza pura.

Sviluppo:
Si parte dall’uovo fecondanto, fecondazione interna -> si avvolgono l’albume e il guscio intorno all’uovo.
Alla deposizione dell’uovo siamo già in uno stadio avanzato di
segmentazione, dopo la deposizione avviene l’incubazione della
chioccia con il mantenimento a T costante -> poi gastrulazione e
organogenesi, dopo 21 gg abbiamo la schiusa dell’uovo, con il
pulcino che è già in grado di muoversi.

Embrione molto studiato non solo perché è uno sviluppo ben


visibile, ma anche perché in molte fasi assomiglia al lo sviluppo dei
mammiferi. Viene usato anche oggi come modello soprattutto per
lo studio dell’organogenesi dei mammiferi.

Per vedere lo sviluppo iniettiamo una sostanza fra tuorlo e


embrione che fa da contrasto: su sfondo scuro vediamo le
caratteristiche embriologiche dell’embrione in chiaro.

- Embrione in sviluppo usa una grande quantità di turno -> inizialmente si sviluppa come una struttura
planaria piatta sul tuorlo, detta cicatricula -> diametro molto più ampio dello spessore.

Cicatricula = Dischetto bianchiccio presente nelle uova di uccelli alla superficie del tuorlo, sotto la membrana
vitellina, in cui è raccolto il citoplasma, con il nucleo o vescicola germinativa. È detta anche disco germinativo e
da essa si sviluppa l’embrione.

- Intorno al tuorlo abbiamo diversi tipi di albume: uno più liquido e uno semi-solido -> tuorlo viene
mantenuto nello posizione centrale grazie alle connessioni con le parti dell’albume semi-salito che si
volgono a spirale e sono dette calaze.
- Nella porzione più acuta del guscio abbiamo poi una camera d’aria
- Esternamente abbiamo il guscio calcareo, con una membrana interna
- Al livello del vitello abbiamo vari starti concentrati perché il tuorlo viene deposto gradualmente
nell’oogenesi e questo forma degli strati.

Fecondazione interna nell’ovidotto -> nel passaggio nell’ovidotto l’uovo viene rivestito dall’albume e dalla
membrana del guscio (subito sotto il guscio), e infine dal guscio stesso.
Alla deposizione si è in uno stadio che va dalla 20mila alle 60mila cellule -> segmentazione avanzata.

*riepilogo tipo di uova -> Uova saurospide sono telolecitiche, ricche di vitello.

La distribuzione e la quantità del vitello determina il tipo di segmentazione -> solco di divisione non procede
totalmente nell’embrione, per cui la segmentazione avviane solo a livello animale quindi superficiale dove
troviamo tutto il citoplasma).

71
SEGMENTAZIONE

Aprendo una finestrella sul guscio e usando sostanze a contrasto vediamo che l’embrione ha una struttura a
disco, presenta un anello più periferico più scuro che è detto area opaca e una regione più interna detta area
pellucida, che risulta più trasparente e rifrangente.
Sull’area opaca si forma il primo solco di divisione, seguito dagli altri solchi; al procedere dei solchi verso la parte
più esterna si incontra il vitello per cui abbiamo un’asincronia nella segmentazione: nella parte più interna
cellularizza più velocemente, mentre le divisioni saranno più lente nella porzione esterna.
Se eseguiamo un taglio perpendicolare all’area opaca e vediamo nello spessore di questa area vediamo che le
cellule formate sono in continuità con il vitello che si trova subito sotto.

Se guardiamo blastodisco dall’alto: le prime divisioni cono sempre perpendicolari all’area pelllucida e sono dette
divisioni verticali.

Dopo una serie di divisioni verticali, questo ben visibile in sezione -> l’embrione ha eseguito anche delle
divisioni equatoriali per cui si formano due strati cellulari, in questo stadio si parla di blastoderma.
Successivamente si forma una piccola cavità che comincia a separare le cellule dal tuorlo sottostante, almeno
nella parte più centrale -> la cavità si ingrandisce poi perché le cellule del blastoderma secerno l’acqua che
avevano assorbito inizialmente dall’albume -> per il rigonfiamento questa cavità aumenta in dimensioni e ora è
detta cavità germinale.

Area opaca = punto in cui la cavità germinale incontra il vitello, dall’alto sembra un anello.
Area pellucida = è quella più rifrangente, trasparente se irradiata con luce -> ben visibile allo stadio di
blastoderma, corrisponde due alla regione del blastoderma che si trova subito al di sopra della cavità germinale -
> se la illuminiamo il blastoderma risulta molto trasparente.

Segmentazione termina quando le cellule più profonde, quelle più vicine alla cavità germinale muoiono per
apoptosi (morte programmata), si staccano e il blastoderma torna ad essere formato da un unico strato cellulare
che ora è detto epiblasto.

PREGASTRULAZIONE

Nella parte posteriore dell’area opaca ho una zona marginale posteriore con una massa di cellule -> sono in fase
di pre-gastrulazione, le cellule nella zona marginale cominciano ad allungarsi e a proliferare nella cavità germinale
-> formano uno strato di cellule che si allunga.

72
Contemporaneamente dall’epibalsto (area lucida) cominciano a
staccarsi delle cellule e “galleggiando” nella cavità germinale
cominciano ad unirsi a gruppo -> sono dette isole di poli-
invaginazione o ipoblasto primario.

Le cellule della zona marginale incontrano nella cavità queste


isole di poli-invaginazione, le incorporano e formano un unico
tessuto -> infine raggiungeranno anche la porzione anteriore
dell’area marginale, si forma un nuovo strato cellulare subito al
di sotto epiblasto.
Questo strato percorre in senso postero-anteriore la cavità
germinale -> è detto ipoblasto secondario o semplicemente
ipoblasto.

L’ipoblasto divide la cavità germinale in due parti:


- la parte fra epiblasto e ipoblasto, l’unica che rimane,
corrisponde al blastocele di altre specie
- una fra ipoblasto e vitello, questa si obliterà, ipoblasto si
adagerà sul vitello.

Mappa del destino:


- Epiblasto darà origine a tutto l’embrione, quindi ai tre foglietti definitiva

Se osserviamo l’embrione dall’alto, mentre avvengono questi movimenti di formazione dell’ipoblasto a livello
dell’epiblasto si osservano dei movimenti cellulari -> nella parte posteriore si osserva un accumulo di cellule a
livello della zona marginale posteriore in cui anche più internamente troviamo una massa che darà origine
all’ipoblasto. Abbiamo un accumulo anche più superiormente, nell’epiblasto.

Questa massa è detta “falce di Koller” -> inizialmente è accumulata in una struttura a cono, successivamente il
cono si restringe e si allunga, quindi le cellule fanno intercalazione medio-laterale (movimento convergente)
ovvero le cellule più laterali convergono medialmente in una struttura corta e larga(è il cono) -> è detta stria
primitiva, che continua ad allungarsi fino a raggiungere la parte più anteriore.

È un movimento contemporaneo a quelle che nella cavità germinale andranno origine all’ipoblasto.
Sono cellule molto più unite fra di loro rispetto agli anfibi o ricci di mare -> devono secernere una sostanza per
muoversi nello spazio cellulare, quindi si ha una sorta di digestione della matrice cellulare.

A livello della stria primitiva si forma poi un solco centrale detto solco primitivo: è un sito di ingressione delle
cellule -> inversione è un movimento di singole cellule che si incanalizzano passando all’interno del blastocele.
All’estremità più anteriore del solco abbiamo una struttura a imbuto detta nodi di Hensen in cui le cellule
entrano (cellule dell’epiblasto si portano internamente) -> analogo del blastoporo.

73
GASTRULAZIONE

A livello della stria primitiva le cellule che devono essere internalizzate (formeranno endoderma e mesoderma) si
spostano in gruppo in una porzione mediana che è il solco, partendo dalle regioni laterali -> a livello del solco
invece le singole cellule, non sono più adese in un tessuto continuo, migrano all’interno della cavità del
blastocele con riarrangiamenti citoscheletrici indotti da specifici segnali biochimici -> migrazione ordinata, non
causale.
In sezione: Epiblasto, blastocele, ipoblasto.

Il passaggio da un tessuto contro a singole cellule che migrano separatamente è un fenomeno detto transizione
epitelio-mesenchima (mesenchima di tipo di mesodermico soprattutto embrionale che sono cellule più lasse fra
loro che ricordano le cellule del connettivo) -> transizione che avviene con lo stesso meccanismo anche nella
cancerogenesi.
A differenza di pesci e anfibi, in questo caso ho proliferazione durante
la gastrulazione.

Img con embrione di anfibio a stadio di bottone caudale (fine


gastrulazione, dopo neurulazione, non ancora organi)-> è uno stadio
in cui possiamo ben confrontare i vari vertebrati, sezione trasversa:
- Mesoderma si è già differenziato: quello più dorsale ha dato
origine alla notocorda (struttura assile portante che appare
come un bastoncello pieno in sezione), circondata da somiti
(strutture metameriche ripetute che danno origine a vari
tessuti dell’adulto come muscolatura striata, vertebre ecc). In
continuità dai somiti, ma distinti abbiamo le lamine laterali che
sono mesoderma di tipo laterale e scendono verso il basso
abbiamo mesoderma ventrale -> venarle e dorsale da origine a
sangue, muscolatura, endoteli
- Tubo neurale più appiattito (in azzurro)
- Epidermide (in rosso)
- Creste neurali fra tubo neurale e ectoderma (in verde scuro)
- Centralmente abbiamo il tubo digerente in formazione, con
organi annessi (in giallo)

A livello del nodo di Hensen le cellule migrano internamente, ma


quando entrano non migrano lateralmente come nel caso delle cellule
dell’ipobalsto primitivo -> migrano anteriormente, verso il nodo
stesso, formeranno le strutture più anteriori. Le cellule che entrano
sono quelle che formeranno endoderma e mesoderma..

Abbiamo varie ondate migratorie di cellule,


Ondate nella stria primitiva:
1. Migrano in profondità, fanno un movimento o verso il solvo primitivo dalla porzione più laterale
dell’ipoblasto, migrano in profondità fino ad arrivare a livello dell’ipoblasto -> spostano le cellule
dell’ipoblasto lateralmente (in giallo abbiamo cellule che hanno spinto l’ipoblasto lateralmente in verde).
Quindi tutte le cellule dell’ipoblasto verrano sostituite da queste della stria primitiva -> quelle migrate
dalla stria daranno origine all’endoderma e a delle membrane extraembrionali (servono per aiutare
l’embrione a svilupparsi, ma non fanno parte dell’embrione vero e proprio).
2. Cellule migrano, entrano ma non migrano in profondità, ma si fermano nel blastocele -> si trovano fra
epiblasto e ipoblasto, saranno cellule mesodermiche embrionali (formeranno mesoderma
assiale=notocorda, parassiale=somiti e laterale) e n parte le membrane extraembrionali.

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Contemporaneamente entrano altre cellule nel nodo di Hensen divise in ondate anche queste:
1. Cellule che migrano in profondità, raggiungano l’ipoblasto che viene sostituito _> formeranno
endoderma anteriore, perchè le cellule del nodo di Hensen successivamente migrano anteriormente ->
formano endoderma faringeo.Le cellule dell’ipoblasto spostate danno origine alla semilunare germinale,
una struttura che formerà le cellule germinali.
2. Cellule che si posizionano fra epiblasto e ipoblasto+endoderma, anche qui in posizione intermedia nel
blastocele -> daranno mesoderma anteriore, quindi mesoderma precordale (prima della notocorda su
una linea assile) e mesenchima della testa (mesoderma più lasso).
3. Cellule che migrano sempre in posizione centrale nel blastocele e formeranno la posizione più anteriore
della notocorda.

A fine di queste ondate, se osserviamo l’embrione esternamente notiamo che il nodo di Hensen comincia a
retrocedere, spostandosi più posteriormente.

Durante questa regressione osserviamo una struttura stretta è allungata che si forma durante la regressione: è la
notocorda. Le cellule lateralmente della stria primitiva si uniscono a mano a mano centralmente ->
condensazione cellulare che da origine alla notocorda.
La notocorda anteriore si forma dall’ingressione di cellule attraverso il nodo di Hensen; la notocorda posteriore
si forma per condensazione di tessuto mesodermico che ha fatto ingressione dalla stria primitiva

Mano a mano che il nodo procede anteriormente si cominciano ad osservazione le porzioni anteriori del nodo di
Hensen che sono in uno stadio di sviluppo più avanzato rispetto alle regioni più posteriori -> si forma la plica
cefalica, una piega che darà origine alla testa, sistema nervoso centrale e più posteriormente i somiti. Ho un
gradiente di sviluppo antero-posteriore.

*Linea tratteggiata in rosso è la linea di sezione


sagittale mediana effettuata per osservare sul lato
dorsale lo sviluppo -> siamo in uno stadio di
regressione del nodo oltre la metà dell’organismo.
75
Plica cefalica (head fold) -> embrione più anteriore si solleva dal vitello (fino ad ora planare, appoggiato sul
vitello), nel corso dello viluppo tutto l’embrione si solleverà rimane
collegato con strutture specifiche.
*img sezione trasversale -> a livello delle regioni anteriori si sta
formando la plica cefalica = l’embrione si sta piano piano sollevando dal
vitello (fino ad ora era adagiato), posteriormente ci sono la notocorda
già formata e la notocorda che si sta condensando (mesenchima).

La notocorda anteriore che si condensa è detto processo cefalico.

Risultati della gastrulazione:


- Endoderma ha sostituito l’ipoblasto, spingendolo esternamente
- Mesoderma si è posizionato fra ectoderma e endoderma, con cellule che notarono sia dalla stria primitiva
che dal nodo di Hensen
- Ectoderma ha circondato il vitello per movimento di epibolia (intercalazione radiale) e proliferazione
cellulare (negli anfibi invece non avevamo proliferazione, solo epibolia -> qui abbiamo molto vitello
quindi necessitiamo di più cellule -> processo che richiede un paio di gg) -> da quelle cellule che non
sono migrate internamente e sono rimaste nell’epiblasto.

18/5/18

Lo sviluppo del pollo è un sistema modello principale, abbiamo visto le fasi principali di segmentazione e
gastrulazione -> strutture peculiari che sono la stria primitiva ed il nodo.

ESPERIMENTI degli embriologi sperimentali quando ancora non si conoscevano i geni: quello che veniva fatto
erano trapianti/espianti di frammenti specifici per capire a cosa danno origine.

Capacità induttive di Nodo e stria_

Il Nodo di Hensen, se trapiantato da UN embrione di quaglia ad


embrione di pollo ricevente (perché specie con diversa
pigmentazione), dà origine ad un intero asse corporeo -> il nodo ha
attività organizzatrice (paragonato all’organizzatore di Spemann).

Un’altra funzione specifica del labbro dorsale del blastoporo


importante è quella di indurre SN -> quindi ci si pone la domanda
se anche il nodo è in grado di indurre neuroectoderma: esperimento
importante fatto mettendo insieme animal caps di Xenopus (si
usano questi perché non c’è una struttura paragonabile nel pollo
formata da cell pluripotenti che può essere espiantata) e frammenti dell’embrione di pollo.
Si sfruttano quindi i vantaggi offerti da una specie come lo Xenopus, questa cross contaminazione è molto
importante in biologia dello sviluppo.

Si mette una parte dell’embrione di pollo fra due animal caps (chicken sandwich) -> si fa sia con diverse
porzioni del pollo = epiblasto laterale + stria + nodo per capire se qualche frammento rilascia sostanze
neuralizzanti. Si va a verificare l'espressione di marcatori specifici = geni espressi
specificatamente nel tessuto nervoso -> NORTHERN BLOT (ma si poteva usare
anche RT-PCR che usa cDNA di partenza), il Northern dà informazioni in più
rispetto ad RT perché sono sottoposti ad elettroforesi TUTTI gli RNA -> oltre a
sapere se c’è il messaggero cercato ci dà anche informazioni sulla lunghezza (se fosse
un mRNA nuovo -> informazione importante).

N.B. tecnica = NORTHERN, strategia sperimentale= esperimento messo a


punto.
76
Quindi con il Northern si cerca di rilevare la presenza di 2 marcatori specifici che sono NF-3 e N-CAM, *img
ogni striscia è una pista dove sono stati fatti correre RNA estratti dai sandwich, poi trasferimento su
nitrocellulosa e infine ibridazione con 3 sonde (in contemporanea perché gli RNA hanno peso molecolare
differente) + c’è un gene housekeeping per il controllo per assicurarci sempre un risultato anche se gli RNA
cercati non ci sono.
N.B. la presenza di una pista di controllo in cui sappiamo essere presenti i fattori -> per il controllo
positivo, in questo caso sono embrioni di Xenopus allo stadio 30 (RNA totale da embrioni allo stadio di
girino precoce).

Risultato:
solo il Nodo di Hensen mostra presenza dei fattori (ovviamente anche il controllo positivo presenta i fattori, per
cui sappiamo che dal punto di vista tecnico è tutto corretto).
Il nodo di Hensen è in grado di indurre le cellule ectodermiche, anche se di Xenopus, in tessuto nervoso.

Il fatto che vengano saggiati anche stria ed epiblasto laterale e che i risultati siano negativi ci dice che -> è il
Nodo di Hensen effettivamente che rilascia le sostanze, non sono presenti in maniera generica nell’embrione di
pollo.

Capacità induttive di altre regioni_


Analizzando le capacità induttive di altre regioni dell’embrione è stato visto dagli embriologi sperimentali è che la
zona marinale posteriore, se trapiantata in regione ectopica in un altro embrione, è in grado di indurre una stria
primitiva per cui è ANALOGA al centro di Neuwkoop.

NEURULAZIONE

Avviene contemporaneamente all’organizzazione del mesoderma che si è formato nella


gastrulazione.
La neurulazione risulta essere la stessa in tutti i vertebrati:
- Nella neurulazione primaria la cresta neurale appiattita si invagina, forma una
doccia, e si alzano i bordi -> vanno a fondersi e formano un tubo.
*cell in rosso sono alla giunzione fra le cellule di tessuto nervoso ed epidermide sono
quelle che, quando il tubo neurale si chiude, si vanno a trovare nella parte dorsale del
tubo neurale e sotto l’epidermide = cellule della cresta neurale -> originano tutta la parte
craniofacciale.
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Questa cresta neurale è considerata da alcuni come una quarto foglietto embrionale per la grande capacità di
originare tipi cellulari diversi (ecto, endo e meso invece hanno capacità più ristrette).

La differenza con gli anfibi è che l’embrione di pollo si forma disteso sul vitello; le due conformazioni sono
comunque estremamente simili e infatti se sperimentalmente l’embrione di pollo è tagliato *img B e C -> si
ricongiunge ventralmente -> struttura come quella dell’anfibio.

La differenza è legata fondamentalmente alla quantità di vitello, è “apparente”.


*img visione dorsale e sezione trasversa -> “tondino” è la notocorda e ai lati si trovano somiti e lamine laterali.

Il gradiente di sviluppo è anteroposteriore, le parti anteriori presentano una chiusura o quasi del tubo, mentre
posteriormente il tubo è sempre più aperto.

- Lo sviluppo prosegue con la differenziazione morfologica del tubo neurale: si osserva uno stadio a 3
vescicole encefaliche (rigonfiamenti e strozzature a livello dell’encefalo) -> la vescicola anteriore è il
prosencefalo, la seconda il mesencefalo, e la terza allungata è romboencefalo e dietro inizia il midollo
spinale.

- La regionalizzazione procede e si passa allo stadio a 5 vescicole encefaliche: il prosenecefalo ha


originato telencefalo e diencefalo, il secondo ha protrusione laterali che origineranno le vescicole ottiche
(non otiche) e ciò ci ricorda che la retina non è un organo di senso periferico ma fa proprio parte del
SNC -> mantiene laminazione simile a quella della corteccia infatti; romboencefalo ha originato
metencefalo e mielencefalo.

NOTA questo schema vale per TUTTI i vertebrati.

REGIONALIZZAZIONE DEL MESODERMA

Contemporaneamente alla neurulazione, avviene allo stesso modo in tutti i vertebrati (mammiferi, sauropsidi,
pesci etc). Le strutture mesodermiche sono notocorda (mesoderma assiale), somiti (mesoderma parassiale) che
sono metamerici ed in continuità con le lamine laterali -> sono 2, quella esterna è la somatopleura mentre quella
interna è la splancnopleura.
I somiti si osservano bene anche dall’esterno -> striature trasverse.
La notocorda andrà a costituire una struttura portante dell’embrione.
I somiti iniziano ad assumere morfologie diverse e formano propaggini che origineranno varie strutture,
fondamentalmente si vede una porzione interna dei somiti = miotomo.
Il miotomo originerà:
- la muscolatura striata,
- la parte esterna che è il dermatomo che originerà il derma
- la ripiegatura interna che è lo sclerotomo che originerà la cartilagine delle vertebre e le vertebre stesse
- sempre a livello dei somiti la porzione laterale a confine con le lamine forma il mesomero che formerà il
sistema urogenitale
Le lamine laterali scendono arrivando a pieno contatto fra loro -> la splancnopleura originerà la muscolatura
liscia + miocardio + endocardio + endotelio, la somatopleura originerà la muscolatura viscerale nella testa e al
pericardio.

SOLLEVAMENTO

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L’embrione di pollo si sviluppa come una struttura planare, ad un certo punto inizia a sollevarsi dal vitello ->
dalla parte più anteriore con la plica cefalica = rialzo che prosegue posteriormente; successivamente si forma una
tasca anche posteriormente -> una tasca sotto-caudale = ripiegamento che fa si che anche la parte posteriore
inizia a staccarsi e sollevarsi. La regione di contatto fra embrione e vitello quindi si restringe sempre più fino a
formare una specie di peduncolo che mantiene l’embrione in contatto con il tuorlo.

ORGANOGENESI

Annessi Embrionali:
Embrione allo stadio di 5 vescicole, è fondamentale per lo sviluppo dell’embrione la presenza di membrane
extraembrionali (annessi embrionali) -> servono alla sopravvivenza dell’embrione nell’uovo.
Durante la sostituzione dell’ipoblasto le cellule sono spinte esternamente + anche il mesoderma mano a mano
che entra dentro non si ferma ma continua a migrare

*img A e B_ foglietti embrionali vanno OLTRE l’embrione -> ectoderma ha un epibolia per cui ricopre il
vitello, ma una cosa simile avviene anche per endoderma e mesoderma che procedono ventralmente fino a
fondersi e costituiscono delle strutture. NOTA il mesoderma di rivestimento costituirà SIA splancnopleura che
somatopleura ma anche strutture ulteriori.
*img D_ strutture in blu e rosso (ecto e meso) oltre a scendere verso il basso vanno anche in direzione opposta -
> specie di ali che procedono dorsalmente, e vanno a fondersi medialmente.
*img E_ la situazione finale comporta embrione centrale vero e proprio, ricoperto da una membrana detta
amnios e subito sotto invece l’endoderma e il mesoderma rivestono il vitello = involucro detto sacco vitellino.

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Il sacco vitellino si ripiega e origina una struttura morfologicamente separata che è l’allantoide. Infine,
l’involucro più esterno di tutti (circolare) è il corion.
Amnios è costituito da mesoderma (somatopleura) ed ectoderma (blu) interno; il corion è composto da
ectoderma int e somatopleura ext; il sacco e l’allantoide hanno splanco ext ed endoderma int.

La presenza dell’amnios viene usata nella classificazione dei vertebrati che li divide fra Amnioti =con amnios
(rettili, mammiferi e uccelli) e Anamni = non hanno l’amnios (pesci e anfibi), questo è legato al fatto che pesci e
anfibi crescono in ambiente acquoso mentre gli altri no:
il problema principale è la disidratazione
altro problema è anche che lo sviluppo all’interno della madre necessita di scambi gassosi (in acqua
scambio libero fra embrione ed acqua)
problema dell’eliminazione dei rifiuti
nutrizione

Tutti questi problemi sono risolti dagli annessi:


- L’amnios secerne liquido (amniotico) che impedisce la
disidratazione e protegge dagli urti meccanici + impedisce
eventuali aderenze fra parti diverse dell’embrione.
N.B. le cellule dell’amnios hanno capacità contrattili
per cui il liquido amniotico è mantenuto in
movimento.
- Il corion aderisce al guscio calcareo dell’uovo dei sauropsidi -
> il guscio è permeabile ai gas per cui nel corion avvengono
gli scambi gassosi.

- L’allantoide, nei sauropsidi, serve per accumulare le sostanze di rifiuto che sarebbero tossici per
l’embrione + ha la funzione di permettere lo scambio di gas (contribuisce insieme al corion) perché
riccamente vascolarizzato + favorisce la mobilitazione del calcio dal guscio (quando esce il pulcino il
guscio è molto più sottile perché durante lo sviluppo il calcio è mobilitato -> utilizzato dall’embrione più
il pulcino riesce a romperlo facilmente).

Il sacco vitellino avvolge il vitello e utilizza le fosfoproteine e i lipidi presenti necessari per la crescita
dell’embrione; è in continuità con il tubo digerente che si sta sviluppando nell’embrione -> è in formazione, non
è in grado di digerire mentre le cellule del sacco vitellino sono in grado di digerire e inviano le sostanze digerite
all’embrione.

MAMMIFERI
TOPO

Vantaggi_

Come tutti i sistemi modello presenta vantaggi fra cui


1. la capacità di svilupparsi in maniera rapida veloce raggiungimento della maturità sessuale per cui si usa
per esperimenti di genetica classica ed esperimenti di genetica inversa (modificazione genica come
inattivazione del gene) -> importante passare velocemente da una generazione all’altra per vedere gli
effetti).
2. E’ possibile eseguire esperimenti di genetica classica e di modificazione genica: mutazioni casuali non
mirati ai soggetti e si osservano i risultati fenotipici nella generazione successione, da qui si capisce quale
è il gene che è stato colpito

80
FASI dello sviluppo : classiche, segmentazione + gastrulazione + neurulazione + organogenesi

Svantaggi_

1. Lo sviluppo è interno alla madre


2. L’uovo è MOLTO piccolo (1000 volte più piccolo di quello di Xenopus)
3. Vengono prodotte poche uova.

FECONDAZIONE

È interna, la fecondazione avviene in un punto specifico della


tuba = ampolla, regione vicino all’ovario. Dopodiché lo zigote è
spostato verso zone più prossimali fino a raggiungere l’utero, qua
prende contatto con la mucosa uterina ed annidarsi (altrimenti
viene perso).

SEGMENTAZIONE

Le prime divisioni in genere (anfibi, pesci etc) sono secondo piani


meridiani che passano attraverso polo animale e vegetativo.
Nei mammiferi invece si trovano differenze:
1. Il primo piano è meridiano MA il secondo è diverso nei 2
blastomeri formati: uno dei due si divide secondo un piano
equatoriale mentre l’altro secondo un piano meridiano e
perpendicolare al primo = SEGMENTAZIONE
ROTAZIONALE.
Questa è una caratteristica peculiare dei mammiferi che differenzia
la segmentazione dei mammiferi rispetto alle altre, non è l’unica.

2. Le divisioni sono molto lente, fra una e l’altra possono passare da 12 a 24 ore a seconda della specie in
osservazione.

3. Le divisioni ad un certo punto diventano asincrone, i blastomeri normalmente invece sono pari perché le
divisioni sono sincrone.

4. Il genoma zigotico è attivato molto precocemente (questo avviene anche nei pesci, non così
precocemente però= probabilmente perché non c’è un grande contributo materno = l’embrione non
eredita dall’oocita ututto il materiale necessario per le prime fasi della segmentazione e quindi deve
attivare precocemente il DNA per produrli esso stesso (ipotesi), questo spiegherebbe anche la lentezza
delle divisioni -> devono sottostare alla velocità di sintesi del materiale necessario.

Allo stadio di 8 cellule l’embrione si chiama morula -> i blastomeri protrudono verso l’esterno, prima che
avvengano divisioni successive l’embrione passa alla fase di compattazione = i blastomeri non protrudono più
ma sembra che l’embrione sia “livellato” a formare una superficie più liscia -> si formano tutta una serie di
giunzioni serrate che avvicinano molto i blastomeri fra loro e sigillano l’interno della morula.

Fino allo stadio di 8 cellule tutte le cellule sono identiche fra loro e hanno la stessa potenzialità (totipotenti), a 16
cellule invece l’embrione va incontro ad una prima divisione perché le cellule assumono specificazione diversa, la
situazione non è più compatta e omogenea come era nella morula ma si vedono due gruppi di cellule distinte:
- Cellule interne = massa cellulare interna (MCI). MCI hanno potenzialità diversa di generare cellule
embrionali allo stadio avanzato -> sono pluripotenti e non più toti, originano TUTTE le cellule

81
dell’embrione vero e proprio + 3 delle membrane extraembrionali o annessi = sacco vitellino + amnios
+ allantoide.
- Cellule che circondano l’embrione = cellule del trofoblasto. Il corion è formato dal trofoblasto e
formerà la parte fetale della placenta.

Nel frattempo, dallo stadio di morula compattata, inizia a formarsi una piccola cavità all’interno: sono pompati
ioni sodio nella parte centrale che richiamano acqua = si allarga sempre di più fino a formare il blastocele. Qua
non si trova MCI che è eccentrica = all’estremità, e il trofoblasto sta intorno. Questo stadio è detto blastocisti.

Zona pellucida = membrana costituita da matrice extracellulare che l’embrione si porta dietro fino allo stadio di
blastocisti, utilità: l’embrione percorre l’ovidotto durante tutta la segmentazione, al momento in cui è una
blastocisti ha raggiunto l’utero e qua o si annida o si perde; in condizioni patologiche l’embrione si può annidare
nelle tube, sembra che la zona pellucida sia presente proprio per evitare questa eventualità/questo contatto, ma
ovviamente se questa continua ad esserci quando l’embrione arriva a contatto con la mucosa uterina si ha
l’effetto inverso e l’embrione si perde.

Quindi quando l’embrione arriva nell’utero produce una proteasi chiamata Strypsin che produce un foro nella
membrana pellucida -> è rimossa, le cellule sono libere e possono prendere contatto con la mucosa uterina.
Di fatto il primo contatto è con la matrice extracellulare che riveste la mucosa uterina stessa, le proteine della
matrice sono digerite mediante produzione di proteasi e il trofoblasto arriva a contatto con le cellule: inizia
annidamento vero e proprio.

Annidamento -> la blastocisti piano piano entra nello spessore stesso della mucosa uterina.
*img
A primo contatto, embrione inizia ad essere proiettato verso l’interno, nota ci sono capillari materni che
saranno fondamentali.

B una parte del trofoblasto che riveste MCI assume forma sinciziale = sincizio trofoblasto, si distingue
dal trofoblasto normalmente cellularizzato in prossimità dell’embrione, penetra nella mucosa uterina e
“apre la strada” all’embrione perché. È formato da cellule particolari che producono grandi quantità di
proteasi che digeriscono i tessuti e separano le cellule dell’endometrio fra loro permettendo l’invasione.
Mentre questo avviene sono rilasciate anche altre sostanze (fattori di crescita fondamentalmente) che
hanno la funzione di rimodellare i vasi materni = cambiano di struttura (rimodellamento) e anche di
numero. I vasi che arrivano hanno una forma diversa da quella dei capillari iniziali perché il loro
diametro è più grande + procedendo nello sviluppo cambia la loro permeabilità.

MCI inizialmente era un gruppo di cellule non morfologicamente differenziate, adesso forma 2 strati che sono
epiblasto ed ipoblasto + comincia per schizocelia comincia a formarsi una cavità -> originerà l’amnios (cavità
amniotica).

C come conseguenza dell’invasione del sincizio trofoblasto che si porta dietro il trofoblasto che si porta
dietro l’embrione, si vede che l’embrione si inserisce sempre di più. Il calibro dei vasi continua ad
aumentare e diventano sempre più fenestrati -> il sangue che arriva si disperde e si riversa in quelle che
sono chiamate lacune sanguigne. L’embrione stesso comincia ad avere una struttura ancora più
differenziata -> la cavità amniotica si è allargata e si delineano bene gli strati di ipo ed epiblasto.
82
L’ipoblasto prolifera e va piano piano a rivestire tutto il blastocele = rivestono il lato interno del
trofoblasto andando a rivestire il blastocele stesso.

D la struttura che si forma quando l’ipoblasto ha rivestito tutto il blastocele è detta sacco vitellino.
Struttura come quella dei sauropsidi, oltre a questa analogia, anche la gastrulazione avverrà esattamente
come avviene nei sauropsidi (Nodo, stria etc etc), una piccola differenza è che nel topo le cellule della
notocorda inizialmente migrano più profondamente (nei sauropsidi rimangono in posizione intermedia)
e si trovano sullo stesso piano delle cellule endodermiche, questa fase è transiente perché le cellule della
notocorda si staccano poi dall’endoderma e migrano subito al di sotto dell’ectoderma, l’endoderma
riempie lo spazio lasciato dalla notocorda.

Nelle fasi successive troviamo ancora situazioni simili a quelle viste nei sauropsidi: tasca, sollevamento
dell’embrione dal vitello etc.

A_ l’embrione umano ha una struttura molto simile a quella dei sauropsidi, l’embrione è come quello di pollo
con la differenza che non c’è vitello.

B_ ripiegamento, l’embrione si rialza, si forma anche una piega sottocaudale. Si inizia definire l’intestino. La
separazione del sacco vitellino procede come nei sauropsidi e la regione che unisce la parte intestinale con il
sacco vitellino si stringe ancora di più e l’embrione va avanti nell’organogenesi

C_ si vede che si formano polmoni, cuore, fegato e altri annessi al tubo digerente

83
D_ peduncolo ristretto che unisce il sacco vitellino con il tubo intestinale, il sistema nervoso si sta
regionalizzando.

La gastrulazione avviene prevalentemente come nel pollo.

ANNESSI EMBRIONALI

Simili come struttura e modalità di formazione a quelli dei sauropsidi, ma le funzioni sono diverse:
- Corion origina la porzione embrionale della placenta, in particolare presenterà tutta una serie di
estroflessioni = villi coriali, contengono vasi e la loro funzione è quella di aumentare la superficie di
scambio. I villi coriali sono tantissimi -> si dice anche corion frondoso.
- Amnios riveste l’embrione, ha come nei sauropsidi la funzione di mantenere l’embrione idratato +
protegge dagli urti meccanici.
- Sacco vitellino vestigiale
- Allantoide vestigiale

Questi 2 non hanno più le funzioni come nei sauropsidi dove erano strutture riccamente vascolarizzate, questa
ricca vascolarizzazione è mantenuta -> di fatto questi organi vestigiali fondamentalmente non sono altro che
strutture vascolarizzate quindi contribuiscono alla vascolarizzaizone della placenta.

Il sincizio trofoblasto è anche un organo endocrino che produce ormoni *img

*img analogie fra sauropsidi e mammiferi: si vedono cavità amniotiche, sacco vitellino, allantoide, corion
(funzioni molto diverse).

VILLI CORIALI

*img in grigio l’endometrio con il quale prende contatto l’embrione -> si vedono sincizio trofoblasto e
trofoblasto, seguito da mesoderma extraembrionale (quello che nei sauropsidi straborda dalle regioni che
originano embrione vero e proprio): VILLO PRIMARIO
Quando il sincizio trofoblasto ha preso contatto con la mucosa uterina e il citotrofoblasto prende contatto
anch’esso : VILLO SECONDARIO.
Si vengono a formare vasi generati dal mesoderma extraembrionale: VILLO TERZIARIO.

PLACENTA

Nella madre, in ALCUNI casi, si ritroveranno cellule di origine embrionale e nel feto cellule di origine materne
(generalmente non ci sono scambi di cellule), si cerca di capire quale è l’impatto di tutto questo -> si pensa che le
cellule embrionali, staminali, possano aiutare l’organismo materno a riparare tessuti danneggiati.
84
Dall’altro lato sono cellule geneticamente diverse con antigeni diversi, per cui potrebbe scatenare episodi
autoimmunitari.
*img normalmente non ci sono scambi fra sangue materno e sangue fetale, quindi come avvengono gli scambi di
gas e sostanze?
C’è una situazione particolare per cui i vasi materni sono molto fenestrati e riversano il sangue nelle lacune -> il
sangue materno arriva tramite vasi modificati e si riversa nelle lacune in cui sono inseriti i villi coriali = sono
immersi, per cui avviene lo scambio gassoso.

25/5/18

Meccanismi molecolari:
Quando l’embrione arriva allo stadio di 8 cellule subisce una compattazione e, nella fase successiva a 16 cellule -
> morula che inizia a differenziarsi e origina la blastocisti. La blastocisti presenta due tipi cellulari distinti =
prima decisione dal punto di vista cellulare che l’embrione prende dal punto di vista dello sviluppo.

Cosa fa sì che nel passaggio da morula a blastocisti avvenga questa diversa specificazione cellulare fra MCI e trofoblasto?
Partendo da cellule fondamentalmente indistinguibili, si vede che entrano in gioco tutta una serie di meccanismi
finemente coordinati -> si osserva che alcune cellule della morula si spostano più internamente (*rosso nell’img)
mentre le altre restano passivamente all’esterno (*blu). Le cellule in rosso si muovono perché presentano un
citoscheletro particolare per cui i filamenti di actina e miosina determinano la capacità motoria cellulare = le
cellule hanno un sistema contrattile. Le cellule che migrano sono quelle che formeranno la MCI, mentre quelle
che rimangono all’esterno formano il trofoblasto.

La via di segnalazione necessaria che entra in gioco è chiamata Hippo: via di segnalazione che porta
all’attivazione di chinasi specifiche e , fra le altre cose, controlla anche la presenza di un certo fattore di
trascrizione chiamato Yap.
Yap, allo stadio di 8 cellule, si trova in TUTTE le cellule sia in nucleo che citoplasma; allo stadio di morula
avanzata (dopo il movimento) invece si osserva che Yap si ritrova all’interno dei nuclei soltanto all’interno delle
cellule esterne.
La migrazione specifica di Yap nel nucleo dipende da Hippo:
*img cellula esterna blu che originerà il trofoblasto + cellula interna rosa dell’ICM
HIPPO OFF_ Yap (TF) nelle cellule esterne permette la trascrizione di geni specifici che indirizzano le
cellule verso il destino di trofoblasto, il gene chiave è CDX2 = altro TF -> si crea una cascata di TF
specifica che determina il destino cellulare.

HIPPO ON_ le cellule di ICM contattano le cellule dello strato esterno mediante caderine, il fattore
AMOT interagisce sul lato citoplasmatico con la caderina -> questa interazione determina l’attivazione
della via di trasduzione di hippo che porta, come risultato finale, all’attivazione di una chinasi LATS che
fosforila Yap = non entra nel nucleo.

Viene trascritto OCT4 = fondamentale per la pluripotenza cellulare (uno dei 4 geni trovati da Yamanaka per
riprogrammare le cellule somatiche adulte in cellule pluripotenti indotte, è il più importante perché fa partire
anche gli altri 3 geni), pluripotenza = origina tutti e 3 i foglietti embrionali dell’embrione.

EMBRIOLOGIA SPERIMENTALE:

Una delle domande fondamentali riguarda il capire quale è la potenzialità cellulare nelle prime fasi dello sviluppo.
Le pietre miliari sono_
Seidel 1952: allo stadio di due blastomeri ci si chiede se questi sono o no identici dal puto di vista delle
potenzialità, lavorando con embrioni di coniglio si vede che se viene eliminato uno dei due blastomeri
quello residuo origina comunque un embrione normale.

85
Gardiner e Rossant 1976: iniettate cellule di ICM di un embrione nella blastocisti di un altro embrione
(sempre marcando le cellule per poterne seguire il destino), si vede che le cellule dell’ICM riconoscono le
cellule dell’ICM che ha subito il trapianto e si vanno a mescolare -> embrione normale.

Nell’uomo non si possono fare esperimenti specifici, ci si rifà a casi naturali come quelli dei gemelli
monozigotici, si ottengono perché un unico embrione si divide in 2 parti geneticamente identiche:
Monozigotici con amnios separati_ separazione precedente alla formazione del trofoblasto (quindi allo
stadio di morula), se la morula si divide in 2 = 2 morule indipendenti, si sviluppano 2 blastocisti separate
e ogni trofoblasto formerà una propria placenta.
Monozigotici con unica placenta ma amnios distinti_ separazione successiva alla formazione del
trofoblasto = embrione va avanti normalmente fino alla formazione della blastocisti e poi si separano le
cellule dell’ICM -> circondate dallo stesso trofoblasto = unica placenta ma le ICM sono differenti quindi
annessi embrionali distinti (ogni embrione ha il suo amnios)
Monozigotici con unico amnios e unica placenta_ l’embrione di divide successivamente alla formazione
dell’amnios, le cellule che vanno a formare l’embrione avranno quindi annessi embrionali e placenta in
comune.
Questi casi ci dicono che anche l’embrione umano presenta buone capacità regolative.

Per il TOPO =
Esperimento importante:
si prendono due morule di topi diversi (uno a pelo bianco e uno a pelo scuro), si elimina la membrana pellucida
mediante un enzima (proteasi) = a questo punto le due morule non presentano più la zona pellucida e possono
avere contatto cellulare diretto -> accade che le cellule si mescolano, si riconoscono dal punto di vista di
molecole di adesione che esprimono.
Il risultato è una morula più grande del normale, composta da due tipi di cellule.
Si formerà la blastocisti che viene poi iniettata in una madre adottiva (indotta ad ovulare o già gravida = utero
pronto ad accogliere la blastocisti) -> nascono topolini chimerici (topi mosaico) = pelo a chiazze e dimensioni
normali (anche se la morula era più grande = questo mostra le capacità regolative).

Se si analizzano le cellule degli organi -> si vede che ogni organo è formato da cellule di tipo diverso.
Sono stati realizzati topi chimerici anche da 3 morule diverse: pelo bianco + pelo nero + pelo rosso, se incrociati
con maschi bianchi recessivi viene originata progenie di topi totalmente bianchi + totalmente rossi + totalmente
neri. Questo perché anche gli oociti prodotti saranno di tutti i tipi.

La possibilità di mescolare cellule diverse ci dice che l’embrione di mammifero è regolativo, queste capacità
regolative ha permesso di sviluppare la tecnica della ricombinazione omologa -> topi KNOCK OUT, per
studiare i geni durante lo sviluppo.

*ricapitolo knock out = studio del gene per perdita di funzione, ci fa capire cosa fa normalmente (NOTA da
sapere per l’esame). L’idea finale è inserire 2 copie di gene mutato nel topo:
1. Il primo livello a cui si va ad agire è in vitro -> si deve avere il gene fisicamente a disposizione in vitro,
clonato, usando PCR o enzimi di restrizione si va ad interrompere questo gene (con PCR si deve usare
gene già interrotto, mentre ER va a tagliare il gene), si introduce un pezzo di DNA esogeno e si riunisce
il tutto mediante ligasi. In pratica in questa prima parte si manda il gene fuoriframe e il gene è totalmente
non funzionante.
2. Adesso si va a lavorare in colture cellulari (quindi sempre in vitro e non nell’embrione), si usano le
cellule della MCI (chiamate cellule ES quanto tenute in vitro) che devono mantenere la loro
pluripotenza (è facile che in vitro inizino a differenziare, mentre a noi servono pluripotenti) -> questo si
fa utilizzando mezzi di coltura particolari. Si trasferisce il gene modificato nelle cellule, questo entra e
passa nel nucleo -> con una frequenza molto bassa avverrà ricombinazione omologa, RARO (tipo
1/1000000000, per questo si formano esclusivamente eterozigotici e mai omozigoti). Può avvenire
ricombinazione grazie alla perfetta omologia di sequenza per regioni estese = quelle non modificate del
gene.

86
3. Il frammento di DNA che abbiamo inserito porta alla resistenza per antibiotici specifici, grazie a questa
resistenza si possono identificare le cellule ricombinate -> si seminano le cellule in piastre con
antibiotico = metodo di selezione veloce.
4. Adesso si può passare a lavorare sull’embrione = si vanno a trasferire le cellule ricombinate in una
blastocisti. Queste cellule ES iniettate si rimescoleranno con ICM dell’ospite (come nell’esperimento
detto prima). La blastocisti è poi iniettata in femmina gravida -> partorirà topolini mosaico.
5. Essendo topi mosaico questi avranno SIA cellule modificate che NON. Quindi si incrocia il topo
mosaico con wild tyope -> si ottengono topi wild type e e topi totalmente eterozigoti (sempre come
nell’esperimento visto prima).
6. Dall’incrocio fra gli eterozigoti fra loro si otterrà circa un 25% della progenie che sarà omozigote per la
mutazione.

NOTA_ la colorazione del pelo diversa è dovuta NON al gene in questione ma al fatto che le blastocisti
utilizzate vengono da topi diversi -> chiari e scuri.

GENI OMEOTICI

Omologhi degli omeotici di Drosophila si ritrovano anche nei vertebrati. A livello del romnboencefalo in
particolare vi sono combinazioni di geni hox accessi -> questa è mantenuta da cellule della cresta neurale che
migrano ventralmente = questo porta a dare un’identità anteroposteriore a tutte le regioni che si trovano dopo il
romboencefalo.

Knock out di geni Hox danno fenotipi interessanti, ex -> se si elimina un gene Hox posteriore come Hoxc8, la
prima vertebra lombare sarà trasformata in una vertebra toracica. Questo ricorda il gene bithorax di Drosophila.

A volte, facendo il knock out del gene Hox, si arriva in fondo e non si ha nessun fenotipo, perché?
Rispetto a Drosophila, che ha un unico complesso di Hox, nel topo ci sono 4 gruppi = c’è ridondanza .
Eliminando un gene su un complesso (*img per esempio c9) potrebbe essere funzionante comunque un gene
paralogo di un altro complesso (ad esempio b9).
Il paralogo di un certo gene, in generale, è il più vicino dal punto di vista strutturale e sarà espresso allo stesso
modo dal punto di vista spazio-temporale. Quindi, nell’esempio del topo, eliminando c9 -> ci sono comunque
altri 3 paraloghi, se ne togliamo più di uno probabilmente si inizia a vedere il fenotipo, altrimenti rimane
fenotipo wild type.
La ridondanza è un fenomeno molto comune, in modo che se un gene è colpito da una mutazione, si può
comunque preservare la funzionalità dell’organismo (infatti i geni fondamentali sono spesso presenti in duplice
copia).

NOTA: i geni Hox riguardano


la regionalizzazione posteriore,
mentre nella regione anteriore
non ci sono (hanno una
regolazione differente) ->
all’inizio si pensava che ci fosse
una anteriorizzazione per
default mentre poi sono stati
scoperti geni specifici per la
specializzazione anteriore
(identificati prima in Drosophila
-> empty spiracles, buttonhead
etc, poi nel topo e anche
nell’uomo).
87
CENTRI ORGANIZZATORI DEL TOPO

Oltre al nodo di Hensen, come nel pollo, è fondamentale anche l’endoderma anteriore detto endoderma
viscerale anteriore (anterior visceral endoderma, AVE).
Nel topo si ha una situazione planare simile a quella degli uccelli, che poi diventa concava -> rosso =
mesoderma, la parte gialla è l’endoderma e in blu = ectoderma.

L’endoderma è il primo che si forma -> AVE, esprime geni importanti. Con una serie di esperimenti si vede che,
nel topo, il nodo serve per la specificazione antero posteriore. Ma poi in particolare AVE e nodo interagiscono
per formare la testa = AVE serve per specializzazione anteriore.
Nodo: esprime Chordine e Noggin
AVE: esprime Cerberus e Lefty (inibiscono Nodal e Wnt).
Quindi questi due centri interagiscono, non ancora chiarissimo ma ci dà un’idea.
*img topo con sonde per Chordin e Noggin -> Chordin è espresso prima.

Cosa succede se si inattivano geni dell’AVE?


Il topo knock out manca di tutta la testa = ci indica che AVE è fondamentale, se manca anche solo uno dei geni
le strutture anteriori non si formano.

Cosa succede eliminando Noggin e Chordin?


Senza Chordin gli effetti non sono così rilevanti -> problemi nello sviluppo della vescicola otica; questo non
sorprende così tanto perché n topo knock out omozigote per Chordin ha comunque Noggin che ha funzioni
simili.
Per cui se si effettua anche il knock out di Noggin e si incrocia con il knock out per Chordin -> embrioni doppi
knock out = seri problemi di sviluppo:
- ciclopia = unico occhio centrale
- presenta proboscide = accenno di formazione del naso che si viene a trovare sopra l’occhio
- agnatia = mancanza della mandibola.

Si parla di una condizione di oloprosoencefalia ->


mancanza di segnali che dividono bene metà destra e
metà sinistra = per questo unico occhio e altri
problemi.

88
Per capire più precocemente quando sono iniziate questa serie di aberrazioni:
si vanno a utilizzare marcatori specifici = si prende un embrione precoce, sia wild type sia doppio knock out, e si
vanno a testare per vari marcatori come:

- six 3 (fattore di trascrizione importante per lo sviluppo della retina e dell’encefalo)


- krox 20
- shh = proteina secreta importante per una via di segnalazione per lo sviluppo delle strutture mediane
(coinvolto differenziamento fra lato dx e sx).

[*img Nel doppio knock out non c’è proprio six 3, si trovano krox 20 ed espressione ridotta di shh]

Esiste un terzo gene inibitore di BMP: follistatin, ma non si sa bene dove viene espresso nel topo.
Fare il knock out complicato perché sarebbe triplo, per questo si va a studiare nello Xenopus -> si possono
inattivare tutti e 3 i geni Chordin + Noggin + Follistatin.

- Follistatin si accende nel labbro dorsale del blastoporo che si sta formando.
- Chordin e Noggin si accendono più precocemente (allo stadio 9, non ho ancora follistatin), nella regione
dorsale del mesoderma.

Tecnologia rapida: usiamo come mRNA antisenso Morpholino, prodotto sinteticamente e indirizzato verso uno
specifico acido nucleico specifico. Rispetto a un acido nucleico normale, Morpholino ha delle modifiche per cui
quando si lega con mRNA specifico si forma un ibrido che non viene riconosciuto da nessun enzima cellulare (è
sintetico!) -> l’appaiamento non può essere sciolto, quindi mRNA a cui Morpholino si è legato non potrà essere
tradotto.

Se eliminati uno per uno non si hanno effetti visibili, se si eliminano 2 alla volta si inizia a vedere un fenotipo
mutato -> si testano per il marcatore che delinea tutta la piastra neurale sox 2.
Follistatin e Noggin: eliminerà una parte di gastrulazione (not sure!)
Chordin e Noggin: espressione di sox2 ridotta rispetto al controllo
Chordin e follistatin: sempre riduzione della piastra neurale

Se eliminati TUTTI e 3: le espressioni dei vari geni sono notevolmente ridotte (sox 2 -> marcatore piastra
neurale) o assenti (marcatori del muscolo, della notocorda es myf5 o shh -> shh che è espresso a livello della
notocorda e nella parte mediana del tubo neurale -> nella MID).
Quindi guardando sox vediamo che non si è formato tessuto nervoso, guardando i marcatori not e somiti
vediamo che non si è formato il sistema parassiale -> manca notocorda quindi nemmeno le struttur più dorsali
non si sono formati.
Questi esperimenti in Xenopus confermano che il triplo blocco degli inibitori di BMP non si ha dorsalizzazione.
Se si elimina BMP4 l’embrione recupera uno sviluppo quasi normale = riprova della specificità di Morpholino.

Lezione 27 Aprile

Sviluppo Embrionale ZEBRAFISH (Danio Rerio)

Zebrafish è un vertebrato utilizzato come modello ideale per lo studio non solo in biologia di sviluppo, ma
anche di patologie umane.

Usato perché:
- Facile da mantenere in laboratorio, è di piccola taglia (2-3 cm); inoltre un organismo resistente alle
variazioni di T, pH e salinità; Ambiente naturale sono fiumi Indiani.
- Alta proliferazione : 100-200 uova da ogni incrocio
- Fecondazione esterna, quindi è facile studiare le uova
89
- Nelle prime fasi della segmentazione l’uovo fecondato è trasparente, quindi è possibile osservare le
strutture dello zigote in sviluppo
- Ha uno sviluppo molto rapido, in 24 h già vediamo la circolazione sanguigna, l’occhio e somiti nella
larva, dopo 5 gg possiamo già osservare le larve che nuotano nella piastra.

Per quanto riguarda l’utilizzo come modelli di patologie umane:


- Omologia in alta % in sequenza nt con l’uomo -> circa il 70% di omologia nelle sequenze nucletodiche
- Genoma totalmente sequenziato.
- Facilmente manipolabile tramite metodi di ingegneria genetica.

Inizialmente per studiare questo organismo si utilizzavano strategie di mutagenesi per identificare dei geni
coinvolti nel controllo dello sviluppo di zebrafish -> è stata creata una collezione di mutanti usati come modelli
per le patologie umane.

Immaginiamo un maschio su cui applichiamo un mutageno che crea mutazioni nella via germinale (mutazione
recessiva), poi incrociamo con femmina wild type:
F1 è eterozigote per alcuni geni, dovuto all’allele + della madre e quello mutato (m) del padre.
F2: Incrocio fra eterozigote +/m con +/+, avremo 50% +/+ e 50 % +/m
F3, con autoincrocio della F2:
Vediamo che l’incrocio fra +/m con +/m da luogo a un 25% di embrioni m/m, quindi la mutazione viene ora
espressa anche fenotipicamente.

Questo lavoro ha portato all’osservazione di embrioni fenotipicamente diversi, ora si è passato alla
caratterizzazione della mutazione espressa -> quindi studi genici sui fenotipi mutanti e caratterizzazione dal pt di
vista molecolare dei geni coinvolti nello sviluppo e Zebrafish.

Embrione possiede uno sviluppo molto rapido nelle prime 24 ore


- Riconosciamo occhio, proencefalo, mesencefalo, romboencefalo, abbozzino di intestino, perché la bocca
di zebrafish si apre dopo 4 gg dalla fecondazione, larva già riesce a muoversi nella membrana in cui si
ritrova (coreon).
- È un uovo telolecitico, quindi molto tuorlo.

Due fasi nello sviluppo:

1. Segmentazione dello zigote


2. Intervengono dei meccanismi legati alla migrazione cellulare -> gastrulazione
90
SEGMENTAZIONE

Avviene in maniera simmetrica, segmentazione oloblastica (quindi parziale) discoidale, perché solo il blastodisco
formerà l’embrione. Le prime 12 divisioni sono sincrone e rapide con una durata di circa 15 minuti ciascuna.
Nella blastula le cellule mantengono le connessioni l’una con l’altra con uno scambio di molecole fino a 17kDA
-> quindi si ha una distribuzione di fattori che regolano lo sviluppo.

Rna messaggeri materni e proteine nell’uovo non fecondato hanno un ruolo fondamentale; ruolo identificato nei
mutanti materni, ovvero quei mutanti nei geni materni non erano in grado di procedere in una corretta
segmentazione e sviluppo.
In queste prime fasi infatti vengono utilizzati solo mRna e proteine materni.
Allo stadio di blastula abbiamo poi una MBT (midblastula transcription) in cui vengono attivati i geni zigotici e si
riduce l’utilizzo dei geni materni.

Quindi da questo stadio di blastula fino a quello di gastrula conteranno gli alleli zigotici, non più quelli materni,
nello sviluppo embrionale.

Oltre alle proteine materne, che sono quelle del citoscheletro, giocano un
ruolo fondamentale gli ioni Ca2+: abbiamo una strizzatura dello zigote
con il raggiungimento del citoplasma che nella fase della zigote è
mescolato con i nutrienti del turno -> lo strizzamento fa si che lo zigote
(blastodisco) si concentri e continui a formarsi nel polo animale
dell’embrione, mentre nel polo vegetale rimane la cellula York, ovvero
quella del vitello che contiene tutti i nutrienti necessari allo sviluppo
dell’embrione.
Ioni Ca2+ creano un gradiente che sarà fondamentale anche in altre fasi.

Fino a MBT abbiamo eventi di proliferazione.


Dopo questi eventi di divisioni cellulari rapide, da MBT intervengono eventi di movimento cellulare.
Abbiamo varie strati:
A. Lamina superficiale, nello strato più esterno -> darà luogo al periderma, un rivestimento
extraembrionale esterno.
B. Cellule profonde -> danno luogo al vero e proprio embrione
C. Strato sinciziale del vitellino di tipo interno e esterno

91
Abbiamo un’invaginazione del blastoderma (cellule profonde) a formare una sorta di calotta, è un movimento di
“epibolia”: le cellule profonde al centro dell’uovo si spostano in direzione del polo animale, poi dal polo animale
si muovono lateralmente in direzione del polo vegetale (questo secondo movimento è l’epibolia vera e propria).
Queste cellule che per epibolia scorrono verso il polo vegetale, si intercalano alle cellule esterne.

La capacità di spostarsi verso il polo vegetativo dipende dalla capacità di queste cellule profonde di aderire allo
strato di rivestimento esterno (sopra blastoderma) e allo strato sincinziale vitellino (sotto blastoderma): si
ancorano ai due strati che li circondano per cominciare a scorrere tramite una trazione.
Osservando l’embrione in sviluppo vediamo che è caratterizzato per il 50% di epibolia, perché questo
movimento ricopre il 50% dell’embrione.

GASTRULAZIONE

In una prima fase l’epibolia è simmetrica nei due lati dell’embrione, successivamente uno dei due lati, all’inizio
della gastrulazione avremo il tuorlo molto più rivestito del blastoderma e inizia un movimento di involuzione
delle cellule all’interno dello strato delle cellule profonde in entrambi i lati dell’uovo, ma un lato ha
un’ispessimento maggiore, perché abbiamo un maggiore movimento. Quindi possiamo riconoscere la zona che
darà luogo alla parte dorsale dell’embrione, ovvero la parte in cui ho un ispessimento più pronunciato.

All’inizio della vera e propria gastrulazione cominciano le differenze in termine di aree di sviluppo, con il
movimento di involuzione si rompe la simmetria con una primo ispessimento che darò origine alle cellule dorsali
dell’embrione.
Questo ispessimento è detto “anello germinativo”, due strati:
1. Epiblasto, più superficiale
2. Ipoblasto, più profondo -> da luogo a precursori del mesoderma e endoderma

Dopo epibolia e involuzione, abbiamo un terzo movimento che è la Convergenza e Estensione.

92
Ipoblasto si crea attraverso un’onda sincrona di involuzione (embolia) e uno di
convergenza, che p un momento di delaminazione quindi un trasferimento delle
cellule da uno strato più superficiale e uno più interno, avviene in maniera
sincronizzata: cellule si staccano insieme e passano dalla porzione più esterna a
quella più interna.

Distinguiamo:

- I precursori del mesoderma che migrano verso il polo vegetativo e


proliferano
- Invece i precursori dell’endoderma migrano in maniera casual del tuorlo

I movimenti di convergenza ed estensione ordinata portano le cellule dell’epiblasto e


ipoblasto nella parte dorsale a formare un rivestimento detto Shield (scudo
embrionale).

A partire dallo shield abbiamo poi un’estensione dell’ipoblasto e un restringimento lungo la linea mediale
dorsale, formata da tre zone cellulari:
A. Cordomesoderma o mesoderma assiale, che è il precursore della notocorda
B. Mesoderma parassiale, adiacenti al cordomesoderma, precursore dei somiti mesodermici (somiti daranno
muscolatura)
C. Chiglia o Piastra neurale, che presenta una larga fascia di precursori neurali che si estendono sopra il
mesoderma parassiale e assiale.

93
Abbiamo poi una chiusura dell’embrione a partire dall’epibolia, in cui quindi il tuorlo non sarà più visibile a
causa proprio della convergenza e chiusura dell’anello dello scudo embrionale.

FORMAZIONE DELL’ASSE DORSO VENTRALE

Esperimento con trasferimento del centro di N che determina l’asse antero posteriore -> stesso esperimento
fatto in zebrafish trasferendo lo scudo embrionale, dettante per la parte ventrale, in un embrione ricevente in
fase di blastula in una regione che invece dovrebbe dare luogo alla zona ventrale: dopo l’esperimento l’embrione
possiede due porzioni dorsali, senza alcuna porzione ventrale.
Dal punto di vista funzionale lo scudo embrionale è equivalente al labbro dorsale del blastoporo degli anfibi: è in
grado di organizzare un asse embrionale secondario quando viene trapiantato in un embrione accettore.

94
Altri mediatori:
- Proteine Wnt, prodotte come le BMP dalle regioni ventrali e laterali dell’embrione e con un meccanismo
simile son inibite nella futura regione dorsale (inibizione a livello trascrizionale).
- Fattori FGF, sono prodotti dalle regioni dorsali ed inibiscono l’espressione genica di BMP
- Fattori IGF (insuline growth Factor), aumentano la trascrizione di cordino e goosecoid, inibitori di BMP
-> IGF si lag sulla membrana esterna delle cellule attivando una cascata di trasduzione del segnale che
aumenta la produzione dei due inibitori. Durante la gastrulazione i recettori dell’IGF sono
prevalentemente espressi nella porzione anteriore.
- Beta catenina, deriva dalla traduzione di mRNA materni che si accumula nello strato sincinziale del
tuorlo che sta al di sotto delle cellule che diventeranno lo scudo embrionale. Regola vari geni come
cordino e goosecoid -> quindi ancora aumenta la traduzione degli inibitori di BMP.
- Acido retinoico (RA) è un fattore che porta all’espressione di due proteine che determinano il
differenziamento in senso posteriore l’embrione. L’acido retinoico è sintetizzato a partire dalla vitamina a
grazie a un enzima che è attivato da FGF (fattore) e Wnt (mediatore cellulare). Gli stessi fattori FGF e
Wnt hanno un ruolo nell’inibizione di due geni, cyp26 e Otx2, che differenziano l’embrione in senso
anteriore, in particolare cyp26 inibito è a sua volta un inibitore di RA.
Nella regione anteriore invece cyp26 e Otx non vengono inibiti, RA è degradato e si ha il differenziamento in
senso anteriore dell’embrione.

FORMAZIONE DELL’ASSE DESTRO SINISTRO

In zebrafish abbiamo delle asimmetrie, come il cuore sul lato sx e cervello di dx e sx differenti.
Il coordinatore dell’asimmetria dx e sx è un organo transitorio contenente un fluido, la vescicola di Kupffer,
derivante da un gruppo di cellule dorsali vicino allo scudo embrionale.
Attraverso il movimento ciliare si forma una corrente di ioni Ca2+ che attiva geni come Notch, Nodal e Pitx2
nella parte sinistra, mentre la parte dx è esposta ai segnali IGF.

ZEBRAFISH NELLA RICERCA BIOMEDICA

Uno dei vantaggi è l’omologia di sequenza nucleotidica con l’uomo (70%), si è anche osservato come il grado di
conservazione fra uomo e Zebrafish possa essere estesa anche alla fisiologia -> ad esempio fx del cuore.
A livello del metabolismo abbiamo una conservazione delle sostanze metaboliche e quindi target di farmaci.

Nel caso di tumori si sta cercando di caratterizzare le variazioni nucleotidiche nei vari pazienti oncologici ->
nella sperimentazione in lab si ha una Genetica di tipo:
- Forward, con esperimenti di mutagenesi si ottengono embrioni in cui ho un’alterazione dello sviluppo e
si cerca di caratterizzare molecole che possano migliorare/riportare il fenotipo alterato al wild type.
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- Reverse, a partire da un gene che sappiamo essere alterato in una patologia si crea un modello di malattia
utilizzano Zebrafish con metodi di Knockdown (riducendo l’espressione del gene) oppure un Gene
Editing, per la creazione di modelli Knock out.

Approccio per modificare in modo transiente l’espressione genica è l’utilizzo degli mRNA antisenso detti
“morpholino”, questa è una molecola che lega mRNA immatura quindi che contiene ancora introni.
Morpholino lega gli mRna immaturi a livello delle giunzioni introni-esoni, il cosiddetto splice blocking
morpholino che inibisce un corretto splicing di quegli mRNA oppure può legarsi a livello della regione
contenente l’ATG, la regione di inizio della traduzione (translation blocking morpholino) che per ingombro
sterico blocca la traduzione.
Quindi in un modo o nell’altro altero l’espressione di quel mRNA.

Un approccio più utilizzato per visualizzare anche l’effetto di mutazioni negli adulti è quello di creare delle
mutazioni o dei knock out con un approccio stabile che prevede l’utilizzo della tecnica del CRISP/Cas9 o delle
TALENs. Sono approcci che creano un taglio a doppio filamento in modo che le cellule di Zebrafish
rispondano al danno attivando meccanismi di riparo: vogliamo attivare un sistema error prone, ovvero che tende
a creare errori quindi creiamo organismi mutati con delezioni e inserzioni.
Un altro sistema usato non in Zebrafish, ma nel topo o negli umani è quello di ricombinazione omologa che
permette invece esperimenti di knock in, quindi inserire in determinati pt dei geni di interesse -> in questo modo
si possono eliminare delle porzioni mutate e inserire dei geni corretti (riparazione sequenza).

Zebrafish è adatto anche alla produzione di transgenici, ovvero organismi in cui inseriamo un gene di interesse,
ad esempio una GFP (in modo da osservarla poi al microscopio a fluorescenza), il gene viene messo sotto il
controllo di un promotore specifico per determinati tessuti. *img con larva transgenica osservata con
microscopio a fluorescenza con GFP inserita in un promotore attivo solo nelle cellule endoteliali -> vediamo i
vasi sanguigni.

CRISP: prevede il coinvolgimento dell’attività dell’enzima Cas9, responsabile del taglio a doppio filamento sul
DNA; è coinvolto anche un RNA guida che contiene una sequenza scaffold, ovvero strutturale, che prende
interazione con la Cas9 e una regione spacer che riconosce una sequenza specifica di 20 nt nel gene di interesse.
Si forma quindi un complesso fra il gene di interesse, rna guida e l’enzima Cas9 che attività l’enzima che quindi
effettua il taglio a doppio filamento -> si creano mutazioni frameshift, delezioni o inserzioni e noi vogliamo
creare dei codoni di stop che terminano la traduzione in modo precoce e quindi inattivano l’attività del gene di
interesse.

Esempio di esperimento CRISP in cui il gene da inattivare era codificante per la tirosinasi, un enzima
coinvolto nella produzione di melanina, quindi quando il gene è inattivato è bene visibile
fenotipicamente perché la larva perde la sua colorazione.

Esempio con molecole in cui vediamo le connessioni dei neuroni, sotto forma di cambio del potenziale
di membrana, in vivo nella larva (il vedere gli esperimenti in vivo è uno dei vantaggi di zebrafish)
Esempio GFP in cui mettiamo in evidenza non solo i vasi, ma anche in modo diverso neutrofili e
macrofagi -> è un transgene multiplo.
Si utilizza zebrafish anche nello screening di farmaci/tossicologia proprio perché uomo e zebrafish
hanno in comune molti processi fisiologici. *un farmaco che non capisco
Usato in campo oncologico perché possiamo indurre lo sviluppo di tumori e studiarne poi la sequenza o
l’effetto fisiologico delle cellule tumorali in modo da trovare molecole in grado di bloccare la metastasi.
Modello per lo studio della distrofia muscolare.
Nel loro lab fanno studi sull’autismo: hanno ricreato in zebrafish una mutazione in un gene specifico che
agisce a livello neurologico e si mostra nei primissimi anni dello sviluppo -> visibile anche negli adulti di
zebrafish che normalmente come comportamento sociale nuotano insieme, mentre gli organismi mutati
perdono la capacità di nuoto di gruppo. Lo scopo è sempre quello di cercare molecole in grado di
bloccare o migliorare gli effetti di questa patologia.

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