ORGANISMI TRANSGENICI

Un organismo transgenico un organismo il

cui genoma stato alterato
sperimentalmente:
a) aggiungendovi un gene (esogeno),
spesso detto transgene oppure
b) modificando o distruggendo uno specifico
gene (endogeno) gi presente in

Trasmissione del transgene di generazione in generazione

Un organismo geneticamente modificato (OGM)

un essere vivente che possiede un patrimonio
genetico modificato tramite tecniche di ingegneria
genetica che consentono l'aggiunta, l'eliminazione o la
modifica di elementi genici
Cio non tramite tecniche di miglioramento
genetico classico (mutazione, incrocio e
selezione),

La Direttiva 2001/18/CE dell'Unione Europea sul rilascio

degli OGM nell'ambiente, definisce cos un OGM: "un
organismo, diverso da un essere umano, il cui materiale
genetico stato modificato in modo diverso da quanto
avviene in natura con l'accoppiamento e/o la
ricombinazione genetica naturale".

L'associazione tra i due termini (organismi

transgenici e OGM) sostanzialmente corretta,
sebbene la transgenesi si ha nel caso di
inserimento di geni esogeni all'interno di un dato
organismo, mentre risultano essere OGM anche
quegli organismi la cui modifica non prevede
l'inserimento di materiale genetico esterno, cio
proveniente da unaltra specie

Il termine OGM va applicato agli organismi nel cui

DNA sono state provocate variazioni mediante
processi diversi da incroci o ricombinazione
genetica
Gli organismi che subiscono un processo di
transgenesi sono naturalmente organismi
geneticamente modificati (OGM), ma non tutti gli
OGM sono necessariamente transgenici.

I principi legislativi di riferimento a livello internazionale in

tema di biosicurezza sono contenuti all'interno del Protocollo
di Cartagena.
Assicurare un adeguato livello di protezione nel campo del
trasporto , della manipolazione e dell'uso in sicurezza degli
organismi geneticamente modificati derivanti dalle moderne
biotecnologie i quali possano avere un effetto negativo sulla
conservazione e sull'uso sostenibile della diversit biologica,
tenendo in considerazione anche i rischi alla salute umana e
focalizzandosi specificamente sui movimenti transfrontalieri

NORMATIVA SUGLI OGM

ITALIA
Decreto legislativo 224/2003 - Attuazione della direttiva
2001/18/CE concernente l'emissione deliberata nell'ambiente di
organismi geneticamente modificati
EUROPA
Direttiva 2001/18/CE: regole base per l'autorizzazione al rilascio
nell'ambiente di un nuovo OGM;
Regolamenti 1829 e 1830/2003/CE: autorizzazione e
etichettatura/tracciabilit degli alimenti e dei mangimi (food & feed)
costituiti o derivati da OGM;
Raccomandazione 556/2003: linee guida sulla coesistenza tra colture OGM
e convenzionali.

Nel caso delle piante, il trasferimento genico nelle cellule o

nei tessuti in coltura pu consentire la produzione
immediata di un organismo modificato poich dati tali
cellule o espianti possibile far rigenerare unintera
pianta fertile.
Negli animali questa strategia impossibile perch:
1)Le cellule animali con lo sviluppo perdono le loro
potenzialit differenziative
2) In molti animali le cellule somatiche e quelle germinali si
separano precocemente, quindi per modificare la linea
germinale bisogna introdurre il DNA esogeno in cellule
totipotenti a uno stadio dello sviluppo che precede la
formazione dei gameti

Il termine TRANSGENE descrive ogni pezzo di DNA

estraneo che viene inserito nel genoma di un organismo
attraverso manipolazioni sperimentali di embrioni o cellule
germinali

Tecnologia del DNA ricombinante

Biologia molecolare

Biologia dello sviluppo

Biotecnologie della riproduzione

Gli scopi principali della transgenesi animale sono:

Studiare la funzione dei geni (era post-genomica)
Produzione di biomedicine
Modelli per la ricerca su malattie umane
Miglioramento delle produzioni animali
Xenotrapianti

Determinazione della funzione dei geni eucariotici

(era post-genomica)
Osservazione di mutanti che esibivano fenotipi anomali
Lesistenza di geni veniva appurata attraverso il processo di mutazione casuale
Conoscere il genotipo studiando il fenotipo (genetica diretta)

Con lo sviluppo delle tecniche di clonaggio e sequenziamento stato

possibile indentificare e studiare i geni senza conoscere la proteina
codificata
Questo ha portato al sequenziamento di interi genomi e lidentificazione
di migliaia di geni la cui funzione resta ignota

Sviluppo di metodi di genetica inversa o indiretta:

Produzione di mutazioni in vitro
Studio del fenotipo dopo sostituzione dellallele wt con
quello mutante nel genoma
Topi knock-out (privati di un gene): inserimento di geni non
funzionali
Tecniche sviluppate negli anni 80:
Mario Capecchi, Universit dello Utah (USA)
Premio Nobel 2007 per la Medicina


La modificazione transgenica del fenotipo

la prova incontrovertibile che uno specifico
gene candidato sia il responsabile di un
particolare fenotipo

Esempi di animali knock-out

Knock-out del gene Pax6

Pax consente lespressione

dei geni del differenziamento
del cristallino

Il knock out di Pax6 (Pax6 -/-) non

mostra le strutture oculari
Il mutante in eterozigosi mostra
strutture oculari incomplete

+/+

+/-

-/-

La mutazione di Pax6
responsabile di una malattia
genetica dominante umana
chiamata ANIRIDIA.
Il topo eterozigote detto
anche Small Eye un buon
modello per questa
patologia

Produzione di biomedicine
Sebbene la produzione di biomolecole da parte di batteri o
lieviti sia pi economica, queste tecniche presentano alcuni
limiti dovuti alle differenze metaboliche delle cellule
batteriche rispetto a quelle animali.
Per questo motivo si sviluppato un grande interesse per lo
sfruttamento di tecniche di transgenesi per far produrre agli
animali (bioreattori) grandi quantit di molecole utilizzabili
in terapia e prevenzione, quali farmaci, anticorpi o vaccini.

La produzione di biomolecole pu avvenire attraverso

diversi liquidi biologici, di cui quello di pi facile
sfruttamento sarebbe il latte.
Biomolecole prodotte da animali transgenici: anticorpi
policlonali e lattoferrina (bovini), fattore antitrombina
III prodotto (capre) e calcitonina (conigli)


Naked human Hb from

pigs

Human lactoferrin in
cows milk

Alpha-1-antitrypsin in
sheep

HGH in mouse urine
(uroplakin promoters)

Human antibodies in
mice (H and L chain
tgenics  hybridomas)

CfTCR in goats

Tissue plasminogen
activator (TPA) in goats

Human antithrombin III
in goats

Malaria antigens in
goats (vaccine)

Alpha-glucosidase in
rabbits (Pompes
disease)

Modelli per la ricerca su malattie umane

Lo studio di alcune malattie pu essere estremamente
facilitato usando modelli animali sperimentali che
riproducano alcuni tratti del genoma umano che sono
alla base di alcune patologie.
Luso di animali da laboratorio (specialmente topi e ratti)
geneticamente modificati gi diffuso per lo studio di
una serie di malattie, principalmente il cancro

Il topo little (lit/lit)

e il modello per la
patologia umana
genetica recessiva
nanismo da
deficienza di GH di
tipo I

Microiniettando il gene del

GH nello zigote di topi
lit\lit si overesprime il gene
del GH in tutti i tessuti e si
recupera il fenotipo

lit\lit

lit\lit
+ GH gene

Oncomouse
From Wikipedia, the free encyclopedia
The OncoMouse or Harvard mouse is a type of
laboratory mouse that has been genetically modified
using modifications designed by Philip Leder and
Timothy A. Stewart [1] of Harvard University to carry a
specific gene called an activated oncogene. The
activated oncogene significantly increases the mouses
susceptibility to cancer, and thus makes the mouse
suitable for cancer research. The rights to the invention
are owned by Dupont. OncoMouse(R) is a registered
trademark. [2]

Miglioramento delle produzioni animali.

I metodi della riproduzione selettiva rappresentavano
lunico metodo per migliorare le caratteristiche degli
animali domestici, ma richiedono parecchie generazioni
e accoppiamenti selettivi
La transgenesi animale pu aumentare la redditivit
dellallevamento puntando sulla modificazione
genetica volta a:
migliorare la qualit di alcune produzioni (ad esempio
latte, lana),
ad aumentare la produzione di carne, la prolificit o la
resistenza alle malattie.

Xenotrapianti.
Trapianti di organi da una specie non umana alluomo
Il suino considerato la specie pi adatta a questo scopo,
perch presenta delle somiglianze dal punto di vista
anatomico
Problema immunologico: lorganismo ricevente rigetta il
trapianto producendo anticorpi contro lorgano trapiantato.
Gli approcci transgenici puntano a inibire le reazioni
anticorpali responsabili del rigetto.

I vettori possono essere:

-piccole molecole circolari di DNA, i plasmidi che
possono accogliere frammenti fino a circa 15 kb
-strutture derivate da virus, in grado di contenere fino a
circa 70 kb
-veri e propri cromosomi artificiali ad esempio in lievito
(noti come YAC, dall'inglese Yeast Artificial
Chromosomes) o in batteri (BAC, Bacterial Artificial
Chromosomes) che permettono l'inserimento di oltre
300 kb - cio oltre lo 0,01% del genoma di un
mammifero.

Creazione di animali transgenici:

1. Microiniezione della cellula uovo fecondata
3. Manipolazione di cellule embrionali staminali (ES)

I primi a dimostrare la fattibilit del trasferimento genico mediante

microiniezione del pronucleo
La trasformazione genetica degli embrioni di topo mediante microiniezione di
DNA purificato
Gordon et al., PNAS 77:7380-84,1980
Lespressione somatica della timidina chinasi dellherpers a seguito di
microiniezione di un gene di fusione nelle uova
Brinster et al., Cell 27:223-231, 1981

1. Microiniezione
della cellula
uovo fecondata
Dal 5 al 40% degli
animali risulter
transgenico

Mediante
accoppiamenti, si
stabilisce quali topi
portano il transgene
nella linea germinale.
Si identificano cos i
fondatori transgenici

Probalit di successo
Non pi del 5% delle uova microiniettate produce animali
transgenici vivi
Circa il 25% degli zigoti reimpiantati si sviluppa a
termine
Circa il 25% dei nati risulta transgenico
Il DNA si inserisce nel genoma in siti casuali:
In alcuni casi il gene non pu essere espresso
o pu risultare overespresso con conseguenza
sulla fisiologia dellanimale
Nonostante tutto questo ancora il metodo di routine

Si infettano gli embrioni in clivaggio

mediante un retrovirus difettivo che
trasporta il transgene.
Le femmine che hanno subito limpianto
(madre adottive) generano topi transgenici.
Mediante accoppiamenti, si stabilisce quali
topi portano il transgene nella linea
germinale.
Si identificano cos i fondatori transgenici

METODO DELLE CELLULE STAMINALI EMBRIONALI

In coltura le ES si possono manipolare senza alterarne
la totipotenza
Ovviando allinserimento casuale del metodo
precendente, possibile integrare un transgene
funzionale in un sito specifico
Poi si potr selezionare e coltivare le cellule
manipolate geneticamente
Dopo la trasformazione alcune cellule avranno
il DNA intergrato in siti non prescelti (spuri),
mentre altre lo conterranno nel sito bersaglio
(corretto).
Nella maggior parte delle ES il DNA non si
integra affatto

Animali transgenici
Organismi portatori di nuovi geni integrati nel proprio genoma

Trasmissione del transgene di generazione in generazione

UOMO
Sindrome X

in vitro

pool di geni coinvolti

fenotipo X
animali transgenici

in vivo