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IDENTIFICAZIONE BATTERICA

Dopo aver isolato un microrganismo per identificarlo procediamo con la


sua caratterizzazione andando a valutare:

 morfologia: forma, struttura e organizzazione cellulare. Importanti


sono anche le caratteristiche morfologiche delle colonie: l’aspetto di
una coltura, forma e pigmentazione;
 capacita’ biochimiche e metaboliche: capacità di utilizzare o
attaccare alcune sostanze dando origine a particolari prodotti chimici
che possono essere individuati;
 patogenicità: essere causa di particolari malattie, è un carattere
distintivo;
 caratteristiche sierologiche;

 caratteristiche genomiche.
VALUTAZIONE DELLE CAPACITA’ BIOCHIMICHE E
METABOLICHE DEI MICRORGANISMI

I microrganismi modificando l’ambiente in cui vivono


utilizzando sostanze chimiche per produrre energia e
costituenti cellulari, e producendo cataboliti. Tutte queste
attività cellulari vengono mediate da enzimi.

Saggiando la produzione e la scomparsa nel terreno di


coltura di particolari substrati o prodotti del metabolismo
microbico, i microbiologi indagano il profilo enzimatico
di un microrganismo.

Il profilo metabolico che ne risulta è caratteristico di un


dato microrganismo e può essere utile nella
differenziazione e identificazione dei microrganismi.
DEGRADAZIONE DEI CARBOIDRATI

Gli acidi organici (acido acetico, acido lattico) e


i gas (CO2 e H2) sono tra i comuni prodotti di
degradazione (cataboliti) dei carboidrati.

La capacità di un microrganismo di degradare


diversi carboidrati può essere valutata indagando
la produzione qualitativa e quantitativa di questi
cataboliti durante la crescita microbica.
ANALISI PRODUZIONE ACIDI E GAS

 La produzione di acidi organici è evidenziata


aggiungendo un indicatore di pH nel terreno di coltura.
 La produzione di gas viene determinata usando tubi
Durham.
Terreno con glucosio e con rosso fenolo (rosso sopra pH 8,5 e giallo
sotto pH 6,8) + tubo Durham

Nel tubo Durham


è visibile il gas
formatosi

a sinistra, controllo non inoculato;


al centro campione positivo per la produzione di acidi ma non di gas;
a destra campione positivo per la produzione sia di acidi che di gas.
Caratteristiche fermentative di batteri Gram-negativi enterici
Fermentazione glucosio Fermentazione lattosio Fermentazione saccarosio
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

- A A - A - A - - A - A A - -
G G G G

Organismo glucosio lattosio saccarosio


• Control - - -
• S.aeureus A A A A = acidi
• P. vulgaris A/G - A/G
• P aeruginosa - - - G = gas
• E. coli A/G A/G -
L’UTILIZZO DEL CITRATO
La capacità di utilizzare citrato come unica fonte di carbonio e di
energia distingue tra loro alcune batteri Gram-negativi a bastoncello.
Questi batteri, in presenza di citrato come unica fonte di C e di
NH4(H2PO4) come unica fonte di N, provocano un aumento di pH del
terreno (dovuto all’utilizzo dell’ammonio fosfato deidrogenato) e
causano il viraggio da verde a blu dell’indicatore blu di bromotimolo
presente nel terreno.
Agar citrato di Simmons

Enterobacter Escherichi
aerogenes a coli

+ -
CAPACITÀ AMILOLITICA

Alcuni microrganismi producono amilasi e riescono a


idrolizzare l’amido producendo destrine, maltosio e
glucosio.
In presenza di soluzioni di iodio il terreno contenente
amido è colorato di blu; la degradazione dell’amido
viene evidenziata dalla decolorazione.

Microrganismo B Microrganismo A
non-produttore di - + produttore di
amilasi amilasi
CAPACITÀ PROTEOLITICA
Molti batteri producono proteasi che rendono possibile
l’idrolisi di proteine.

La caseina, principale proteina del latte e che gli


conferisce il suo colore bianco opaco, viene
idrolizzata dalle proteasi formando derivati più
solubili e trasparenti.
Le colonie di batteri proteolitici saranno
circondate da aloni chiari, le aree in cui la
caseina non è stata attaccata resteranno opache.

La gelatina è una proteina che si ottiene


_
dall’idrolisi del collagene, un componente del
tessuto connettivo e dei tendini degli animali.
Questa proteina viene utilizzata per saggiare +
l’attività proteolitica nei microrganismi.
LA DEGRADAZIONE DEL TRIPTOFANO E LA
PRODUZIONE DI INDOLO
Gli aminoacidi possono essere utilizzati dai microrganismi come fonte di
energia oppure essere degradati ad una varietà di prodotti finali (NH3,
indolo, H2O) ed eventualmente essere trasformati in componenti cellulari.

Alcuni batteri degradano il triptofano, presente nel terreno di coltura


durante la crescita, formando indolo.
.
+ -
triptofano + H2O indolo + ac. piruvico + NH3

Se dopo la crescita aggiungiamo il reattivo di Kovacs


(soluzione alcolica acida di para-dimetilamminobenzaldeide)
e mescoliamo, quando le fasi alcolica e acquosa si separano,
si svilupperà un colore rosso nella fase alcolica che indica
la presenza di indolo.
PRODUZIONE DI IDROGENO SOLFORATO

Alcuni batteri sono in grado di degradare gli aminoacidi solforati


liberando H2S.
L’H2S reagisce con metalli, come il bismuto e il ferro, formando
il solfuro del metallo, un precipitato insolubile e scuro.
La produzione di H2S da parte di colture batteriche può essere
dimostrata in laboratorio coltivando i batteri su terreni contenenti
sali di questi metalli.

- +
L’IDROLISI DEI LIPIDI

Alcuni lipidi, trigliceridi e fosfolipidi, vengono


comunemente decomposti dai batteri.

La capacità di idrolizzare lipidi è anche un fattore di


virulenza; tutte le cellule viventi hanno fosfolipidi
tra i loro componenti.
TEST DELL’UREASI
Alcuni microrganismi producono grandi quantità dell’enzima ureasi, che
catalizza l’idrolisi dell’urea presente nel terreno di coltura, producendo
ammoniaca e CO2. L’ammoniaca, alcalina, causa un aumento di pH e,
quando il pH > 8, l’indicatore presente nel terreno vira al rosso.

Differenziazione di Enterobatteriacee:
1. Negativo (Klebsiella); 1 2 3 4
3. Positivo dopo 24 h di crescita,
l’intero tubo è rosa brillante
(E.coli e Salmonella);

6. Positivo dopo 4 ore di crescita


(tipico positivo di Proteus);

4. Non inoculato - + + NO

Questo test è utile nell’identificazione di microrganismi e/o nel distinguere


tra patogeni (es., Salmonella) e non-patogeni (es., Proteus) intestinali.
TEST DELLA CATALASI
La catalasi è un enzima prodotto dalla maggior parte dei batteri e serve a
catalizzare la degradazione dell’acqua ossigenata con conseguente
rilascio di ossigeno libero.
Il test di solito viene effettuato aggiungendo poche gocce di H2O2 su un
vetrino dove è stato trasferito il microrganismo. Se quest’ultimo esprime
attività catalasica si sviluppa una schiuma bianca.

I batteri catalasi-negativi sono di solito anaerobi (Streptococcus,


Leuconostoc, Lactobacillus, Clostridium, Mycoplasma).
TEST DELL’OSSIDASI

Su una striscia impregnata con para-amminodimetilammina viene distesa


la coltura batterica; se questa presenta attività citocromo-ossidasica c’è
produzione di citocromo-c ossidato che ossida la para-
amminodimetilammina dando luogo ad un prodotto rosso scuro-violaceo,
la reazione è positiva.

+ -

Batteri appartenenti ai generi Pseudomonas e Neisseria sono ossidasi-


positivi.
Il test è anche utile per distinguere tra i batteri enterici quelli appartenenti
alle Enterobacteriacee, che sono ossidasi-negativi.
DIAGNOSI DELLA GONORREA

Neisseria gonorrhoeae (gonococco) è in genere individuato


come diplococco Gram-negativo.
N. gonorrhoeae cresce sul terreno di arricchimento non selettivo
agar-cioccolato (sangue lisato col calore), e sul terreno selettivo
Thayer-Martin che contiene vancomicina, nistatina, trimetropim
e colistina che sopprimono la normale flora microbica ma non
inibiscono Neisseria.
Le colture vengono saggiate con il test dell’ossidasi (le Neisseria
sono ossidasi-positive).
Diplococchi Gram-negativi e ossidasi-positivi che crescono su
agar-cioccolato e altri terreni selettivi, isolati da campioni
patologici di derivazione genito-urinaria, si assume siano
gonococchi.
La conferma definitiva viene da test biochimici per l’utilizzo di
alcuni carboidrati e di altri substrati nutrizionali, da saggi
immunologici e mediante l’uso di sonde di acidi nucleici.