S.I.C.S.I.

VI CICLO Laboratorio di Chimica Analitica

APPLICAZIONI DELLE PRINCIPALI TECNICHE ANALITICHE AD ALIMENTI: IL VINO

Prof. Andini

Applicazione delle principali tecniche analitiche al vino

Classe: V anno Istituto Tecnico ind. Tecnologico alimentare
Tempi: 2 lezioni da 1 h Prerequisiti: Conoscenza delle principali tecniche analitiche: Cromatografia Spettrometria di massa NMR

Conoscenza dei principali gruppi funzionali e delle caratteristiche chimico-fisiche dei composti organici

Obiettivi: essere in grado di applicare le principali tecniche spettroscopiche ad alimenti Valutazione: verifica orale

Il vino
Secondo le normative CE, si definisce vino ...il prodotto ottenuto esclusivamente dalla fermentazione totale o parziale degli zuccheri contenuti nelle uve fresche pigiate o non, o di mosti di uve, che si trasformano in alcole attraverso la cosiddetta fermentazione alcolica... Oltre che essere alimento di grande diffusione e consumo in tutto il mondo, il vino anche, probabilmente, lalimento pi studiato dal punto di vista scientifico. Il numero di studi scientifici pubblicati ogni anno notevole e riguarda argomenti vari nel campo della chimica, della microbiologia, della medicina, dellagronomia, ecc.

Composizione del vino

Nel vino sono presenti centinaia di composti diversi (attualmente sono note non meno di 600 sostanze) piuttosto difficile delineare una descrizione della composizione media del vino, viste le numerose possibilit di tecniche di vinificazione. Sono sempre presenti composti delle seguenti classi: Polifenoli: antociani, tannini Sostanze minerali: anioni, cationi Sostanze volatili: acidi volatili, esteri, aldeidi, terpeni Vitamine Gas disciolti: anidride carbonica, anidride solforosa, ossigeno

Acqua Alcoli: etanolo, metanolo, alcoli superiori, glicerina Acidi organici: tartarico, malico, citrico, lattico, acetico Zuccheri: glucosio, fruttosio Gomme e pectine

Alcol etilico
La sua importanza, dal punto di vista merceologico e commerciale, determinante essendo la sostanza a maggior concentrazione dopo lacqua e quindi influenza notevolmente tutto il complesso dei caratteri organolettici. Oltre al sapore dolce, lalcol etilico o etanolo responsabile della morbidezza del vino. inoltre importantissima la sua capacit di solubilizzare tutti i composti importanti ai fini della costituzione del bouquet, che non sarebbero solubili in un mezzo esclusivamente acquoso. Lalcol etilico si forma dalla fermentazione alcolica del glucosio presente nel mosto, favorita dallazione dei lieviti Saccharomyces Cerevisiae: C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2

Determinazione delletanolo
Il metodo pi semplice per determinare il grado alcolico di un vino quello ebullioscopico, nel quale cio si misura il punto di ebollizione del campione. Considerando il vino una miscela binaria acqua-etanolo, possibile risalire alla % di etanolo nel campione in base alla temperatura alla quale esso bolle, facendo riferimento al grafico sottostante; labbassamento del punto di ebollizione dellacqua (abbassamento ebullioscopico) infatti funzione quasi lineare dellaggiunta di un altro componente In alternativa si pu eseguire lanalisi GC, determinando letanolo insieme agli altri alcoli, oppure lanalisi HPLC

Altri alcoli
Il vino contiene altri alcoli che possono influenzarne la qualit, in senso positivo o negativo. Tra quelli apprezzabili vi la glicerina o glicerolo, prodotta come letanolo nella fermentazione alcolica
La glicerina impartisce al vino un sapore marcatamente dolciastro e contribuisce a migliorarne lequilibrio e il corpo. Essendo un composto non troppo volatile, la sua determinazione si effettua per separazione HPLC
CH2 CH CH2 OH OH OH

Un altro alcol, questa volta meno desiderabile, lalcol metilico o metanolo (CH3OH) che si forma dallidrolisi enzimatica della pectina, un polisaccaride presente nelluva. Pur essendo tossico, il suo contenuto nel vino non costituisce rischio, a meno di quantit fraudolentemente aumentate (come nel caso tristemente noto di Narzole). La sua determinazione si effettua normalmente per GC

Alcoli superiori
I cosidetti alcoli superiori o fusel oils, cio alcoli con pi di due

atomi di carbonio, si originano dagli aminoacidi presenti nelluva: nel vino i pi importanti sono 1-propanolo, 2-metil-1-propanolo, 3metil-1-butanolo e 2-metil-1-butanolo Gli alcoli superiori influenzano in vario modo il gusto del vino; nel Cabernet Sauvignon ne stato identificato uno particolare, il 3metiltio-1-propanolo (CH3-S-CH2-CH2-CH2-OH) che deriva dallaminoacido metionina e impartisce al vino una forte nota dolce La determinazione degli alcoli superiori si pu effettuare per GC. Nel cromatogramma sono riconoscibili i seguenti composti, in ordine di eluizione: 1-propanolo, etil acetato (un estere), 2-metil1-propanolo, 1-butanolo (standard interno), etil acetale (un etere), 3-metil-1butanolo e 2-metil-1-butanolo

Zuccheri
Rappresentano una parte importante del mosto e quindi del vino e sono costituiti principalmente da fruttosio (levulosio) e glucosio (destrosio): HOCH
2

OH

il primo ha struttura furanosidica, cio a 5 atomi di carbonio, mentre il secondo ha struttura piranosidica, cio a 6 atomi di carbonio. I due zuccheri vengono fermentati dai lieviti naturalmente presenti nel mosto con produzione di alcol; quando la fermentazione terminata non sono pi presenti o si ritrovano in tracce. Oltre ai monosaccaridi citati, nelluva sono presenti disaccaridi come il saccarosio (fruttosio + glucosio) e polisaccaridi come la pectina (acido galatturonico).

H OH

HO H

CH2OH

fruttosio
CH2OH H HO O H OH H H OH H OH

glucosio

La separazione cromatografica degli zuccheri possibile con HPLC su colonna di silice con gruppi aminici e fase mobile acqua/acetonitrile. Per la rivelazione si impiega normalmente il detector a indice di rifrazione, basato sulla capacit di una sostanza in soluzione di deviare un raggio luminoso; in alternativa, essendo gli zuccheri composti riducenti in virt del gruppo alcolico e del gruppo aldeidico, possibile utilizzare un rivelatore amperometrico nel quale i vari composti separati sono sottoposti ad una reazione elettrochimica
1. iso-Eritritolo 2. Fruttosio 3. Sorbitolo 4. Mannitolo 5. Glucosio 6. Inositolo 7. Saccarosio 8. Maltitolo 9. Maltosio

Determinazione cromatografica

Determinazione del quadro acido

E utile la determinazione dei singoli acidi organici, in quello che noto come il quadro acido. I principali acidi che lo compongono sono i seguenti:

Acido tartarico,
H

COOH C OH C H COOH H HO COOH C H C H COOH HO

Acido malico, Acido citrico, Acido succinico, Acido lattico,

CH2COOH HO C COOH
H H

COOH C H C H COOH

CH2COOH

COOH

Acido acetico,

C OH CH3

CH3COOH

Quadro acido con HPLC

La determinazione del quadro acido si effettua con tecniche cromatografiche. Si pu utilizzare la cromatografia HPLC, separando gli acidi in forma protonata e quindi meno polare, su una colonna C18 con fase mobile acqua/acetonitrile oppure solo acquosa, e rivelazione spettrofotometrica a 210 nm

Polifenoli
Nel vino hanno un ruolo importantissimo: innanzitutto sono responsabili delle differenze tra vini bianchi e vini rossi, soprattutto per colore e aroma, in particolare contribuendo al gusto amaro e allastringenza del vino; in secondo luogo, hanno propriet antiossidanti e battericide, particolarmente gradite dal punto di vista salutistico; infine hanno un ruolo primario nella conservazione e nellinvecchiamento del vino A livello macroscopico, i polifenoli rappresentano la parte colorata e colorante del vino. Sono composti contenuti nella buccia dell'uva

Classificazione dei polifenoli

Chimicamente i polifenoli si distinguono per la presenza di due o pi gruppi fenolici, e sono suddivisibili nelle seguenti famiglie:

OH

Flavonoidi, sostanze pigmentate con struttura caratteristica costituita da due gruppi benzenici uniti da un eterociclo con un atomo di ossigeno

R4 R3 R
7 2' 3' 1

O A
5

2 3 4

4' 5'

R5 R6

C O

R2

R1
OH

Acidi fenolici, come gli acidi benzoici e gli acidi cinnamici derivati degli acidi fenolici, come gli stilbeni tra cui il resveratrolo
HO

OH OH
OH

OH

Determinazione cromatografica
La determinazione dei singoli polifenoli piuttosto complessa, in quanto non ci sono reazioni selettive che si possano sfruttare per effettuare ad esempio misure spettrofotometriche.

La tecnica pi idonea a determinare singolarmente i composti fenolici la cromatografia, e in particolare, essendo i polifenoli composti non volatili, la tecnica HPLC.

Esempi di separazione di polifenoli

In questo esempio riportato il cromatogramma di una miscela standard di polifenoli (A) separati su colonna C18 con una fase fissa acqua/metanolo/acido acetico in gradiente di metanolo. La rivelazione spettrofotometrica a 280 nm I polifenoli separati sono di tipo flavonoide e A non flavonoide. Nel cromatogramma B mostrata lanalisi di un vino rosso iniettato direttamente in colonna; il risultato migliora nettamente dopo estrazione liquido-liquido con dietiletere (C). Si noti il picco del C resveratrolo (13)
B

Composti aromatici
La determinazione delle sostanze volatili si effettua ovviamente per gascromatografia, impiegando preferenzialmente la versione accoppiata con la spettrometria di massa (GC-MS) che permette di identificare strutturalmente le numerosissime e spesso assai complesse sostanze volatili presenti nel vino Per effettuare lanalisi delle componenti volatili, bene effettuare un pretrattamento per isolare soltanto la frazione che li contiene ed evitare di mandare in colonna sostanze non volatili come i composti fenolici o le sostanze inorganiche. Per questo motivo si soliti estrarre la frazione volatile con unestrazione liquido-liquido.

Esempio di analisi GC-MS

Quale che sia il tipo di pretrattamento, lanalisi GC-MS dei composti volatili permette di determinare un numero elevato di sostanze, quindi di caratterizzare ampio il quadro aromatico. In un vino sono determinabili 50-100 sostanze aventi caratteristiche di volatilit, in prevalenza alcoli, terpeni ed esteri. Con opportuni trattamenti, possibile ampliare il gruppo di composti, con la possibilit di caratterizzare le variet Nella figura riportato un esempio di analisi GCMS di un estratto da vino Nebbiolo

Sostanze inorganiche
Le sostanze inorganiche nel vino hanno scarsa importanza dal punto di vista qualitativo, tranne influenzare negativamente i caratteri organolettici se presenti in quantit eccessive, es. il sodio in eccesso pu dare una nota salata sgradevole Dal punto di vista analitico possiamo classificare i composti inorganici in tre categorie:

cationi, cio ioni positivi di metalli, presenti come controioni di

composti organici carichi negativamente, come gli acidi carbossilici, oppure come impurezze anioni, cio ioni negativi, solitamente provenienti dalladdizione di composti impiegati nel processo di vinificazione ceneri, linsieme delle sostanze inorganiche rimaste dopo lincenerimento dellestratto secco

Composti indesiderati
Nel vino sono a volte presenti sostanze che si formano in condizioni particolari e che danno al vino note organolettiche negative. Alcuni esempi di composti indesiderati sono i seguenti: 2,4,6-tricloroanisolo (TCA): il composto responsabile del famoso gusto di tappo, avente una soglia olfattiva di ~5 ng/l; si forma nei tappi di sughero a seguito del trattamento di sbiancamento con ipoclorito, come il suo analogo 2,3,4,6tetraclorofenolo etilfenoli (4-etilfenolo e 4-etilguaiacolo) e vinilfenoli (4-vinifenolo e 4vinilguaiacolo) si originano dagli acidi cinnamici trans-ferulico e trans-pcumarico, con il contributo di lieviti del genere Brettanomyces; questi composti sono responsabili delle note fenoliche e medicinali dei vini deteriorati
OCH3 Cl Cl Cl OH Cl Cl Cl Cl
CH2

CH2

CH3

HC

OCH3

OH

OH

Determinazione di 2,4,6-TCA
La determinazione del 2,4,6-tricloroanisolo nel vino si pu effettuare per GC, impiegando la tecnica SPME o altre tecniche di estrazione Nella figura, lanalisi effettuata per GC-MS dopo trattamento SPME con una fibra di polidimetilsilossano, un materiale sorbente avente affinit per i composti organici volatili. Nel cromatogramma A riportata lanalisi di un campione di vino addizionato con 40 ng/l di TCA (picco 1) e 50 ng/l di triclorotoluene (picco 2, standard interno); il TCA non sembra presente nel campione tal quale (cromatogramma B)

Adulterazione del vino

Il vino, tra gli alimenti, uno dei prodotti maggiormente sottoposto a frode.

Fino a poco tempo fa, lunico modo per verificare lautenticit di un vino consisteva nellassaggio da parte di esperti.

Attualmente, sono stati sviluppati metodi che accoppiano strumenti matematici e tecniche analitiche avanzate, permettendo cos lapplicazione a studi di autenticazione e tracciabilit.

Principali frodi
Le principali frodi in campo enologico sono:
Diluizione con acqua (annacquamento) Vini ottenuti dalla fermentazione di zuccheri di natura diversa da quelli dell'uva (pratica vietata in Italia, ma consentita in altri Paesi) Aggiunta di sostanze non consentite: alcool, antifermentativi, aromatizzanti, coloranti Messa in commercio di vini di qualit differente da quella dichiarata in etichetta

Metodi per riconoscere le frodi

Le tecniche maggiormente utilizzate per riconoscere le frodi e le adulterazioni sono le seguenti, in ordine di importanza:

Risonanza Magnetica Nucleare (NMR): si tratta di una tecnica potentissima per la differenziazione di prodotti alimentari di origine diversa o ottenute con procedimenti diversi

Cromatografia: il termine riassume un insieme di tecniche di separazione, alcune delle quali sono impiegate per la determinazione di classi di composti che possono essere utilizzati nella differenziazione di prodotti alimentari

Addizione illecita di coloranti

Attraverso la determinazione del profilo antocianico spesso possibile riconoscere laddizione illecita di sostanze coloranti, impiegata per impartire al vino un colore pi attraente il loro impiego nel vino ovviamente vietato. Il riconoscimento si basa sul fatto che nelluva sono presenti 5 antocianine di base (cianidina, delfinidina, malvidina, peonidina e petunidina) aventi soltanto residui di glucosio. Lidentificazione di antocianine con altri residui zuccherini indica limpiego di estratti di frutti diversi, come nel caso riportato dove si identifica laddizione di estratto di bacca di sambuco che contiene cianidina con un residuo di sambubioside, uno zucchero caratteristico del sambuco.