La reazione a catena della polimerasi

La reazione a catena della polimerasi (in inglese: Polymerase Chain

Reaction), comunemente nota con la sigla PCR, è una tecnica di biologia
molecolare che consente la moltiplicazione (amplificazione) di frammenti
di acidi nucleici dei quali si conoscono le sequenze nucleotidiche iniziali e
terminali. L'amplificazione mediante PCR consente di ottenere in vitro
molto rapidamente la quantità di materiale genetico necessaria per le
successive applicazioni. Tale metodo fu ideato nel 1983 da Kary B. Mullis
il quale ottenne, per questo, il Premio Nobel per la chimica (1993).
La PCR sfrutta due fenomeni naturali: la tendenza di due filamenti di
DNA con sequenza complementare ad appaiarsi spontaneamente e la
capacità dell’enzima DNA polimerasi di copiare un filamento di DNA
stampo.
Il DNA stampo di una reazione PCR può essere di qualunque tipo: da un
corto frammento di DNA a un intero genoma. Nel nostro caso, il DNA
stampo sarà il vettore di clonaggio contenente il cDNA che stiamo
cercando nella libreria. Prima di procedere alla PCR, questo vettore viene
estratto e purificato lisando le cellule batteriche che lo contengono. Una
volta estratto, il DNA stampo viene inserito nella miscela di reazione della
PCR, in cui è presente una coppia di oligonucleotidi di DNA, detti primer,
ciascuno complementare all’inizio e alla fine della sequenza da
amplificare: i primer forniscono l’innesco per la reazione della
polimerizzazione.
Dato che le sequenze dei vettori di clonaggio sono note, è possibile usare
per la PCR coppie di primer universali che sono completamentari alle
sequenze a monte e valle del polilinker di uno specifico vettore. Questi
primer universali possono essere usati anche per amplificare tramite PCR
qualsiasi frammento di DNA clonato, senza bisogno di conoscerne la
frequenza. La PCR avviene attraverso la ripetizione ciclica di una
sequenza standard di reazioni. Ogni ciclo di reazione della PCR
comprende tre fasi:

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1. Denaturazione: il DNA di partenza viene riscaldato fino a 90 °C, in
modo da separare la doppia elica ed esporre il singolo filamento che
servirà da stampo per la DNA polimerasi.
2. Ibridazione: la temperatura viene abbassata fino a circa 50 °C, per
consentire l’appaiamento dei primer al DNA stampo.
3. Allungamento: la DNA polimerasi sintetizza la prima copia della
porzione del DNA stampo compresa tra i due primer. La reazione
avviene a temperature intorno ai 60 °C per garantire la specificità
della reazione: a queste temperature solo i primer appaiati alle
sequenze perfettamente complementari rimarrano legati al DNA
stampo. Perché l’allungamento possa avvenire a temperature così
elevate è necessario ricorrere a DNA polimerasi termoresistenti,
come la Taq polimerasi del batterio termofilo Thermus aquaticus.
Infatti, le normali DNA polimerasi operano a circa 30-37 °C e si
inattivano a temperature superiori ai 45 °C.

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Terminata la fase di allungamento il campione viene portato nuovamente a
90 °C e si ha una nuova denaturazione, in cui tutte le molecole di DNA a
doppio filamento si aprono; comincia così un nuovo ciclo di reazione.
Partendo da una singola copia di una sequenza di DNA stampo, dopo un
primo ciclo di replicazione di otterranno due coppie. Se questa operazione
si ripete per n cicli, si otterranno 2n copie. Questo processo è detto
amplificazione del DNA. In questo modo, la PCR consente di disporre di
una quantità di DNA sufficiente per condurre le analisi chimiche e le
manipolazione genetiche.
Bibliografia:
 https://it.wikipedia.org/wiki/Reazione_a_catena_della_polimerasi
 “Carbonio, metabolismo, biotech” G. Valitutti, N. Taddei, G. Maga,
M. Macario (Zanichelli Ed. 2020).

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