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Vie di trasporto

 Non mediate
1. Diffusione semplice: Fd=Kd (C1-C2) Kd= R/N x T/f Fi= Pi (C1-C2 )
2. Diffusione non ionica: NH3  NH4+ urine e Aspirina in stomaco
3. Piccole molecole cariche: pori canali ionici 4 sub 6 segmenti ( 5 e 6 ansa interno membrana )
Filtro selettività e alone di solvatazione
a. Voltaggio dipendenti
b. Operati da recettore
c. Meccano sensibili
d. Termo sensibili
e. Luce sensibili
f. Leakeage

 Mediate: carrier uniporti e simporti con specificità, saturazione e competizione J=JmaxS/Km+S


A) Passivi
1. Diffusione facilitata: GLUT 3 (TNCG -HA ) 2 (CBP-HD ) 4 (MA InsTyrKmetLP)
Amminoacidi

B) Attivi primari: si ATP, si controgradiente


1. ATPasi binding casette dimeriche
a) Importers: procarioti
b) Exporters: procarioti e eucarioti  MDR
2. H ATPasi  spostano H
a) V ATPasi: vacuoli e vescicole sinaptiche  3 siti attivi 1 idrolizza ATP a ADP + Pi
b) F ATPasi: mitocondri  1 sito catalitico ogni Alfa e Beta ( 3SC )  ADP + Pi  ATP
c) A ATPasi: archea
3. P ATPasi: C terminale ( sub S e T ) + N terminale ( domini A con TyrGlyAcidoGLut, N, e P con
AspLysTyrGly)
E1  E1P  E2P  E2
a) Na/K: eletteongenica
b) H/K: cellule ossinitiche stomaco per HCl
c) Ca: associate a PMCA (Calmodulina) e SERCA (Sarcolipina e Fosfolambano )

C) Attivi Secondari
1. Simporto Na/Glucosio: in nefrone e tubulo renale per riassorbire glucosio
2. Simporto Na/amminoacidi
3. Simporto Na/neurotrasmettitori: “pulisce” la fessura sinaptica
4. Simporto Na/K/2Cl: in reni per recuperare acqua
5. Simporto Na/I: cellule follicolari della tiroide per produzione ormoni I dipendente
6. Antiporto 3Na/Ca: in cellule muscolari e cardiache per rilassamento
7. Antiporto Na/H: a livello renale e intestinale
8. Antiporto HCO3/Cl
Cell signaling: sopravvivenza, proliferazione e morte programmata
 Autocrini
 Paracrini
 Endocrini

Recettori cellulari: intracellulari (dimerizzano, DCDEDR con Hsp90 o messaggero) o di membrana


 Ionotrpi di membrana:
a) Recettori di membrana chemiodipendenti

 Metabotropi di membrana:
a) Recettori 7 passi transmembrana associati a proteina G
7 passi con 3 anse interne e 3 anse esterne ( Ct dentro e Nt fuori )
Ansa 5-6 dominio per G protein: ALFA GDP Beta e Gamma  GTP e secondo messaggero
b) Recettori Tyr-K
Fattori di crescita  dimerizzazione recettoriale
1. Enzimatici: fosforilano subito
2. Non enzimatici: associazione a porzione citoplasmatica della parte enzimatica

 Proteine adesive

Curve di attivazione e regolazione della funzione recettoriale


 Saturazione: tanta molecola segnale e pochi recettori  risp limitata “Plateau” fino a liberazione
1. Modificazione affinità
2. Modificazione numerica: modifico completamente la risposta della cellula

Vie dei secondi messaggeri


 Adenilato ciclasi: proteina di membrana associata a R7PT
a) N terminale
b) C terminale: S6M1 + S7M2  dominio catalitico per ATP ( con GI e GS ) cAMP + Pi

 DAG e IP3: secondi messaggeri di R7PT  Proteina Q  Fosfolipasi C


a) IP3: citosolico, fosforilato e defosforilato
1. Lega i recettori Ca al REL: Ca++ aumenta in citosol
b) DAG: lipofilico rimane in membrana
1. Il Ca++ stimolato dal IP3 lega la PKC: Ca + PKC + DAG
2. Fattore nucleare attivato per fosforilazione  trascrizione

 Guanilato ciclasi: sia di membrana che intracellulare


1) Cellule endoteliali: alta pressione NO  NO a Guanilato ciclasi  c GMP  attiva PKG 
abbassamento Ca++  rilassamento muscolatura liscia vasi “vasodilatazione”
abbassamento pressione
2) Recettori sensoriali occhio: rodopsina, proteina G trimerica Trasducina, fosfodiesterasi, guanilato
ciclasi e canale ionico
a) Buio: produzione cGMP  apertura e ingresso Ca++ e depolarizzazione  no risposta -70 ->
-30
b) Luce: rodopsina attiva trasducina  ALFA a fosfodiesterasi  cGMP in GMP  no ingresso
Ca++ “Iperpolarizzazione  si risposta -30 -> -70
Attivazione delle proteine segnale

1) Proteine G trimeriche QSI a R7PT: inducono la produzione di un SM che attiverà una PK


ALFA GDP  GTP con cariche – che interagiscono con cariche +  distensione
elica della proteina  sito attivo si allontana da recettore per andare a
stimolare la produzione del SM
Attività autocatalitica per terminazione risposta ( taglia GTP )

2) Proteine G monomeriche a TyrK: GDP  fattore GEF: scalza GDP per GTP  cofattore GAP favorisce
l’attività GTPasica della proteina G monomerica  ritorna in stato
inattivo mantenuto da GDI inibisce il rilascio di GDP per GTP
es: MAP chinasi attivate da Proteine G monomeriche
MAP 3 chinasi fosforila Ser o Tre  MAP 2 chinasi fosforilano Tre o Tyr )  MAP chinasi su fattori
nucleari

 PK: proteine enzimatiche attivate da R7PT  Proteina G  SM  PK


DCSMSIDR
A) PK Serina / Treonina ( PKA e PKC)
1. Inattiva: ripiegata con SI su SC
2. Attiva: SM lega  variazione conformazionale  SC libero da SI  lega ATP e Mg++
B) PK Tirosina: regolano la proliferazioni cellulare. Meno abbondanti ma più importanti

 Proteine bersaglio che attivano PK + ATP  fosforilazione su Proteina bersaglio a livello specifico di
amminoacidi  mod conformaz
1. Di membrana
2. Citosoliche
3. Fattori nucleari di trascrizione
Omeostasi del calcio intracellulare: 10*-7 intracellulare obbligatoria stab / fino a 10*-3-4 non intracellulare

 Store operator calcium entry: RE svuotato necessita compensazione  proteine STIM in membrana
RE: porzione interna funge da sensore per [Ca++]  calcio basso STIM
forma aggregati in “puncta”  REL vicino a membrana plasmatica si
associa a canali orari  formazione tetrameri  protusione RE da
membrana cellulare e assorbimento Ca extracellulare
 Clearance del Ca:
1. Chiusura vie ingresso Ca
2. Demolizione secondi messaggero
3. Legame Ca a proteine Ca leganti
4. Attività dei trasporti attivi del Ca

 Calcium binding protein: in RE  dominio EF-hand nicchia per legare cooridinativo Ca

Es: Calmodulina: proteina lineare 4 siti legano Ca  diventa piegata  modificazione


conformazionale attiva proteine  autofosforilazione
Es: Actina e Miosina  Calmodulina su Troponina C  liberazione siti di legame e Tropomiosina 
contrazione muscolare

 CAM chinasi: chinasi Ca e Calmodulina dipendenti  DCDCalmSI


A) Inattiva: è chiusa, sito attivo inibito dallo pseudosubstrato
B) Attiva: Ca lega Calmodulina ( 4 legami in EF-hand )  avvolge la CAM chinasi  CAM chinasi si
apre  attivazione
NB: possono prendere in giro i segnali esterni  CA chinasi 2 altissima affinità per Ca  anche se Ca
è bassissimo è legato comunque  rimane attiva e mantenimento risposta

 Calpaina: impossibilità ristabilizzaziione 10*-7  Calpaina lega Ca  apoptosi mediante rottura


Lisosomi
Recettori canale: attivati da ligando in sito

 Nicotinici: 5 sub 4 segm legano Acetilcolina in sito esterno


 Glutammato: 4 sub 3 segm  legano Glutammato in sito esterno
 ATP: 3sub 2 segm  legano ATP in sito interno.

Gating dei canali ionici: variazione da stato chiuso ad aperto

 Voltaggio: 4 sub 6 segm ( S4 con + e ansa S5-S6 in membrana )


APERTURE
a) Modello canonico: -70mV S4 con + normale  stimolo esterno  variazione di carica che
attirano le + di S4  Gly perno S6 devia dal centro del canale  apertura
b) Modello elica: + di S4 a simil alfa elica  stimolo esterno  variazione di carica  S4 ruota 
no pareggio cariche  apertura
INATTIVAZIONI
a) Tipo N-term solo in K: Ball and chain  4 sub a 4 N-term Ball + Chain  tappo e inattivazione
b) Tipo P e C: riorganizzazione delle cariche  si toglie ball and chain  stato deattivato per risp
c) Calcio dipendente: proteina che lega Ca a canale  no calcio si passaggio / si calcio no passaggio

 Nicotinici: 5 sub 4 segmenti  S2 forma struttura a gomito con Leu al centro  legame con
acetilcolina  anello largo per passaggio ioni

 Glutammici: 4 sub 3 segmenti  N-terminale e S2 formano complesso D1 alto da ansa e D2 basso


da N-term  complessi speculari a guscio per glutammato x2

Distribuzione e funzione dei canali ionici


 Nav
a) Tipo 1: 1ALFA in 4 S6 classici VOC tessuti e organi eccitabili per innesco di potenziale d’azione
b) Tipo 2: 1ALFA + sub accessorie  tutti gli altri tessuti
Differenza tra -70mV  +30mV classico e pacemaker con corrente risorgente ( no inattivazione
completa Nav ma burst firing per aumento stimolo )
Tetradotossina: blocco Nav ( no cuore si muscoli )

 Cav: : 1ALFA in 4 S6 classici VOC + subunità accessorie


a) Low voltage (transienti): attivati a una bassa variazione del voltaggio
1. Cav 3.1, 3.2, 3.3: tessuto nervoso  potenziale della membrana dei neuroni

b) High voltage: attivati a una alta variazione del voltaggio


1. Cav 1.1 VOC: triade formata dal tubulo T e due cisterne laterali, in muscolatura scheletrica
Cav 1.1(sensore voltaggio ) + Recettore Rianodina su RS  fa uscire Ca
2. Cav 1.2 VOC: triade formata dal tubulo T e due cisterne laterali,
- muscolatura liscia  Ca stimola rianodina
- cardiaca  effetto ionotropo positivo  stimolazione più duratura  forza cardiaca
3. Cav 2.1, 2.3, 2.2 VOC: tessuto nevoso in componente presinaptica  regola rilascio del
neurotrasmettiore ( ingresso Ca  rilascio vescicole neurotrasmettitore fusione membran )
 Rianodina: 4 subunità formate da 6S con porzione citoplasmatica molto grande
Interazione necessaria per apertura con Cav 1.X
a) RyR 1: muscolatura scheletrica  Associato fisicamente a Cav 1.1 VOC
Cav 1.1 VOC  variazione  RyR 1  Ca++ aumenta

b) RyR 2: muscolatura cardiaca e encefalo  Associato non fisicamente a Cav 1.2 come canale
Cav 1.2 Canale  Ca++ aumenta  a RyR 2  Ca++ ulteriore aumenta ( Ca-induzione )

c) RyR 3: muscolatura liscia


Ingresso Ca  stimola rilascio Ca da RE

 IP3: 2 sub e 6egmenti ( 1S e 2S legano IP3, S centrali regolatori, S6 apertura o


chiusura ).
IP3 legato  Ca in citoplasma  conformazione a girandola ( IP3, recettore e Ca )  aperto
a) IP3R1/IP3R3: in tutte le cellule e muscolatura scheletrica
b) IPR2: muscolatura cardiaca

 TRP: in membrana plasmatica ( termo e nocicettori ). Rispondono modificando la fluidità di


membrana

 K:
a) 6PT: S4 con + e filtro ansa S5 S6  divisi in VOC e Ca dipendenti.
1. VOC: N e C-term in porzione intracellulare + proteina accessoria a S1

2. Ca dipendenti: Ca troppo abbondante in cellula  interazione con canale per K fuori e


ristabilizzazione potenziale
2a) SK: bassa conduttanza NO VOC 6S stile voltaggio con Calmodulina a C-terminale
2b) IK: conduttanza intermedia NO VOC  6S stile voltaggio con Calmodulina a C-terminale
2c) BK: alta conduttanza VOC  7S con S5 + e S6-S7 ansa e C-terminale a Ca bowl

b) 2PT: NO VOC  2 segmenti con ansa in mezzo


regolarizzano il potenziale di membrana (corrente inward rectifier no K in uscita, riportano K
dentro ). Sono dipendente da ATP/ADP

c) 2 sub che dividono la sub alfa: canali leakage


Formule EF:
 Planck: flusso ionico per una singola specie ionica
J= -u z/|z| dV/dx
 Fick: in equilibrio il flusso è 0
J= -D ( dC/dx + zF/RT c dV/dx )
 Nerst: potenziale di equilibrio per una singola specie ionica
V= zF/RT ln (Ce/Ci)
 Godman-Hodgkin-Katz: potenziale di equilibrio per tutte le specie ioniche membrana
V= RT/F ln ( PNaKCl e / PNaKCl i )

Potenziale di membrana: grazie a Na/K ATPasi ( K leakage sempre aperti  conduttanza )


 Cellule eccitabili: muscolari, nervose e ghiandole -70mV  +30mV
Stimolazione elettrica  variazione del potenziale di membrana  risposta 1/0
 Cellule non eccitabili: tutte le altre cellule
Stimolazione elettrica  ripristino istantaneo delle condizioni di riposo  no ris

A) Riposo  canali chiuso  conduttanza= 0


B) Stimolazione elettrica  canali aperti  conduttanza diversa da 0

UNO: La membrana cellulare è come un circuito elettrico: corrente


Ic= Gsi ( Vm – Esi ) retta grafico
 Resistenza G= data dalla conduttanza à
 E= batteria. Data dal potenziale di equilibrio di Nerst per ognuna specie
 Vm= variazione voltaggio

DUE: La membrana cellulare è come un condensatore: isolatore di soluzione con capacità elettrica
 Lunghezza cellula e spessore membrana
Ic= Cm dVm/dt
 Cm= capacità elettrica di membrana
 dVm/dt= variazione del potenziale di membrana

UNO + DUE  CIRCUITO ELETRRICO + CONDENSATROE  Im= Cm dVm/dt + Gsi ( Vm – Esi )

TRE: Membrana come componente resistiva data dalla conduttanza di tutti i diversi canali

UNO + DUE + TRE  circuito elettrico + condensatore + resistenza


Im= Cm + dVx/dt + Gk ( Vm – Ek ) + Gna ( Vm – Ena ) + Gcl ( Vm – Ecl )

Canale ohmico: canali si aprono tutti allo stesso momento  grafico con retta
Canali nel reale: canali si aprono in maniera crescente  grafico con curva
Misurazione delle proprietà elettriche della membrana
MICROELETTRODI: capillari in vetro con soluzione salina e filo di cloruro d’argento

A) Current clamp: settaggio di corrente  Cellula con ME1 (generatore) e ME2 ( millvoltmetro)
Definiti i valori soglia e di eccitabilità
Corrente  Capacitiva: alta fino a picco ( cariche coprono tutta la membrana )
Resistiva: 0
Dopo  Capacitiva: scende
Resistiva: sale fino a plateau, canali tutti aperti
Parametro Y= t per 63% di Cr max  a 63% la Ccap è trascurabile  Valore res
Voltaggio dipendenza e tempo dipendenza:
 Voltaggio: conduttanza dipendente dal voltaggio  crescita e deflessione per apertura e richiusura
canali

B) Voltage clamp: settaggio di voltaggio


Amplificatore + Voltaggio settato
- a ME1 in cellula per registrazione potenziale di membrana
IN a ME2 in cellula per registrazione corrente

Potenziale d’azione
 Piede: Potenziale d’azione a riposo  stimolo elettrico interno o esterno
 Soglia: valori definiti per tipo cellulare  stimolo liminare o sovra/sotto
 Depolarizzazione: fase di salita a potenziali più positivi
 Ripolarizzazione: ritorno a potenziale in condizioni di riposo
 Iperpolarizzazione: discesa a valori più negativi del potenziale di riposo per riposo cellulare

Eccitabilità cellulare: Hodgkin e Hucley come cellule eccitabili rispondono a uno stimolo elettrico
Studio su assone gigante del calamaro: identificazione dipendenza risposta da Na e K
 Voltage clamp: incremento di +20mV a volta fino a +90mV
Amplificatore  ME1 a – per registrazione potenziale
+ a settaggio Voltaggio
ME2 a ingresso amplificatore
 Corrente= Ic + Ir + Ina entrante + Ik uscente

Grafico
100%Na [Na]  corrente Na  discesa e picco ( rapido aumento conduttanza e poi diminuzione )
10%Na [K]  corrente K  graduale crescita ( solo graduale aumento della conduttanza )

NON SI CONOSCEVANO I CANALI IONICI

 Patch clamp: isolamento frammento di membrana mediante pipetta Pasteur


1. Studio di frammento membrana
2. Studio di frammento “cellularizzato” per analisi di indipendenza
Correnti di singolo e whole-cell
Cellule stimolate  canale  Chiuso 0 no corrente
Aperto 1 sì corrente non cambia il 0/1 ma solo la durata
 Na: C/O solo 1 volta
 K: C/O variabile con durata variabile
 Sommatorie singole per i canali definiscono le curve di attivazione dei canali Na e K

C Alfa-Beta A
Canali aperti= Aperti che si possono chiudere – Chiusi che si possono aprire
Gate:
 Attivazione: depolarizzazione  canali da chiusi ad aperti
 Inattivazione: depolarizzazione  canali da aperti a chiusi

-70mV  canali chiusi  conduttanza 0


Incremento da -70mV  cambio probabilistico di C/O

Teorema ergodico
Equivalenza, per singolo canale ( riflette anche caso di molteplicità ), tra probabilità del singolo canale di
essere in O e la frazione dei canali che si trovano in O
 Foto a canali in mebrana  C/O
 Rifaccio foto a canali in membrana  C/O ma non è detto siano gli stessi

Attivazione dei canali Na/K


 K: gK= Gkmax * y ( probabilità O )
-70mV  canali chiusi  y=0  gK = 0
+20mV  y diversa da 0  gK diversa da 0

 Na: gNa= Gnamax * m (Oatt) * h (Oinatt )


A picco di corrente  att e inatt O  h=1 trasc  funziona come K  gNa= Gnamax * m(y)

Inattivazione dei canali Na


+10mV  attivazione tutti aperti  m=1 trasc  valutazione degli inattivazione

Ricostruzione potenziale di membrana Hodgkin – Huxley


Vm dipende da: caratteristiche di membrana
Valore soglia
Intensità di corrente di Na-K-Leakage
Caratteristiche del potenziale d’azione
 Intensità-durata: studio sullo stimolo liminare
A) Intensità doppia SL  t/2 per risposta
B) Intensità dimezzata SL  2xt per risposta

Corrente reobase: intensità minima x tempo infinito  risposta  impossibile


Cronassia: 2xCorrente Reobase per arrivare a valore soglia  risposta

 Intensità-periodo: stimolo membrana  si risposta nuovo stimolo  no risposta


Refrattarietà: tempo minimo di attesa per riavere una risposta dopo stimolo precedente
A) Assoluta: canali già lavorano  stimolo  no ulteriore stimolo poiché già lavorano
B) Relativa: periodo refrattario  si stimolo (canali non lavorano) ma no risposta ( valore soglia
spostato più in alto )  ristabilizzazione valori di riposo base  si risposta

 Rate-dependence: potenziali di azione in successione


Frequenza  Alta: durata potenziale breve
Bassa: durata potenziale lunga
Modulazione della durata mediante canali K Ca-dipendenti
 Più lunga è la durata più devono entrare +: Canali Ca  Ca ++ aumento  canali K Ca-dip  fuori K

 Restituzione elettrica: stimolazione anomala “Extrastimolo”  PAM e Risposta  modificati


Extrastimolo  Hf stimolazione normale: maggiore modificazione x ES
Lf stimolazione normale: minore modificazione x ES

Propagazione attività elettrica sottosoglia


Teoria del cavo: effetto dispersivo delle resistenze sulla corrente
Cellula muscolare  innesco in un punto  propagazione  dispersione corrente in punti distanti
Corrente va esterna sulla membrana dispersa e interna
Vm= somma algebrica tra Vint +Vest
Im= -ΔIint/dx o ΔIest/dx

Costante di spazio cavo: distanza a cui Vm= 37% valore iniziale di innesco CSC= sqrt(RM/RMI)
Effetto dispersivo di corrente dovuto a resistenze  Membrana + Mezzo interno
Aumento di CSC: aumento distanza  aumento velocità per raggiungere i diversi punti

Propagazione del potenziale d’azione: stimolo  innesco in punto membrana  propagazione


Corretta propagazione avviene per
 Caratteristiche geometriche: punto membrana innesco ben preciso e ristretto con Vm adatto
 Caratteristiche elettriche: punto membrana innesco
1. Esterno  accumulo –
2. Interno  accumulo +
Formazione correnti elettrotoniche di rotazione +  -
Fibre nervose:
 Afferenti: recettore periferico  encoder fibra nervosa  centro nervoso
 Efferenti: centro nervoso  trigger cono d’emergenza fibra nervosa  periferia

A) Mieliniche: presenza di guaina  Bilayer fosfolipidico che avvolge ( costante di spazio cavo
aumentata per propagazione potenziale )
Nodi di Ranvier ( punto assonema per canali ionici  Depo seq
a) Periferiche: guaina da cellule di Schwann
b) Sistema nervoso centrale: guaina da oligodendrociti

B) Amieliniche: prive di guaina  cono emergenza e assonema privi di guaina e nodi di Ranvier

Codifica del segnale elettrico:


Stimolo periferia PA  SNC riceve: durata e intesità stimolo  codifica  risposta: +/- rilascio NT

Accomodazione: le fibre mieliniche non possono rispondere in sequenza a un potenziale d’azione


Stimolo  risposta  periodo di riposto  risposta a secondo stimolo

Scarica ripetitiva:
Depolarizzazione -70mV  condizioni di base di riposo
Iperpolarizzazione -90mV refrattarietà assoluta/relativa  necessità di inganno per tempi veloci di
risposte in sequenza
1. Terminazione PA prima fine stimolo
2. Maggiore efflusso K  Na inatt tolti
Na att per uso
Codifica di frequenza:
gestisce tutto i canali K  K rectifier
Kvoc  generano correnti che determinano la vicinanza maggiore o
minore dei diversi potenziale d’azione

Adattamento: encoder recettore periferia “punto di innesco del PA”  come viene mandato lo stimolo/
A) Tonico: scarica di potenziali con una certa frequenza  idea di intensità media dello stimolo
B) Fasico: scarica immediata dello stimolo “reale” che va poi ad attenuarsi

Attività autoritmiche: no necessità stimolo esterno  stimolazione ciclica autonoma


Pacemaker: instabilità di membrana  ripolarizzazione incompleta per raggiungimento valori soglia
1. Depolarizzaizone: Na + Ca  cariche + dentro
Poi K  cariche – dentre  corrente compensativa per valore soglia più alto
2. Ripolarizzaizone: da + verso –
3. Ripristino omeostasi Ca: classici metodi di omeostasi Ca  Ca giusto si ritorna a fase 1
Sinapsi: giunzioni cellulari con discontinuità per trasporto del segnale elettrico
 Neuronali: terminale assonico a dendrite neurone successivo
 Neuro-Muscolare: terminale assonico a fibra muscolare
 Cito-Neurale: terminale assonico a cellula recettoriale non nervosa

A) Elettriche: no discontinuità per integrità del segnale elettrico


B) Chimiche: fessura sinaptica discontinua  Switch 1: da segnale elettrico a neurotrasmettitore
Switch 2: da neurotrasmettitore a segnale elettrico

Recettori del post-sinaptico


 Ionotropi: per risposte veloci  Na entra eccita / K fuori inibisce
 Metabotropi: regolano gli ionotropi ( PG a canali per flusso ionico )

Sinapsi elettrica
Membrana pre e post sinaptico in contatto  EMICONNESSIONI antiporti (correnti in somma per direzione)
Chiuse  stimolo  aperte