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INTRODUZIONE: La biotecnologia può essere definita come quel ramo della biologia riguardante «...

l'utilizzo
di organismi viventi al fine di ottenere beni o servizi utili al soddisfacimento dei bisogni della società»: Il
termine biotecnologia deriva etimologicamente da tre parole di origine greca: bíos, che significa vita; téchne,
che significa arte nel senso di tecnica e lógos, che significa discorso (studio). Perciò il significato etimologico
è lo studio della tecnica applicata alla vita.

 Bio: impiego di processi biologici


 Technology: per risolvere problemi o fare prodotti utili

Secondo l’ European Federation of Biotechnology (EFB) la parola “biotecnologia” si riferisce all'integrazione


delle scienze naturali, di organismi, cellule, loro parti o analoghi molecolari, nei processi industriali per la
produzione di beni e servizi. Oggi le biotecnologie sono supportate dalle tecniche di ingegneria genetica di
ultima generazione (tecnologie del DNA ricombinante e splicing): vantaggio (tempi e costi) ed applicabilità
ad una vasta gamma di settori: agricoltura, zootecnia, medicina, produzione di alimenti, industria
farmaceutica

Storia delle biotecnologie vegetali: La definizione di biotecnologia è applicabile a pratiche vecchie quanto la
civiltà umana. L’uomo a sua insaputa è sempre stato un biotecnologo… Grazie alla pratica dell’agricoltura il
genere umano è stato capace di coltivare nel tempo diversi tipi di piante (es. cereali) al fine di soddisfare i
bisogni nutrizionali necessari per la sopravvivenza

1. Vecchie: Le prime indicazioni di processi che utilizzavano i lieviti per la fermentazione della BIRRA
risalgono a quasi 4000 anni fa, ai tempi delle civiltà sumera ed egizia. Alla stessa epoca risalgono le
prime testimonianze dell’uso di latte fermentato, yogurt e formaggi.
2. Moderne: Le biotecnologie classiche (fino metà ottocento) riunivano perciò tecniche basate sulla
pratica, senza nessuna conoscenza scientifica alla base.

Scoperte:
 Anthony van Leeuwenhoek (tra ‘600 e ‘700) costruisce il primo rudimentale microscopio per
osservare i microrganismi viventi.
 Louis Pasteur, tra il 1857 e il 1876, a identificare con precisione i batteri responsabili della
fermentazione del malto d’orzo, della fermentazione lattica e butirrica, e i microbi responsabili della
produzione del vino e dell’aceto.
 Gregor Mendel a dare il via ad un nuovo modo di concepire le biotecnologie. Nel convento di Brno
egli si dedicò allo studio dell’ibridazione delle piante per capire i meccanismi e le tecniche alla base
degli incroci. 1856 -1863: incrociò oltre 30.000 piante pubblicando i risultati dei suoi studi tra il 1960
ed il 1970. Gli straordinari risultati sull’ereditarietà dei caratteri, che di fatto aprono la strada allo
sviluppo della genetica, furono inizialmente ignorati dai botanici dell’epoca. Dimostrò che alcune
caratteristiche delle piante da lui studiate si trasmettevano alla progenie da unità indipendenti dette
successivamente GENI, mentre altre no.
 Flemming nel 1879 scopre le cromatine, le strutture ad asta all'interno del nucleo delle cellule che
successivamente verranno chiamate "cromosomi.“
 Waldyer nel 1888 scopre il cromosoma.
 Alexander Fleming nel 1928 scoprì la penicillina il primo antibiotico. Questa scoperta avviò la
produzione industriale di molecole ottenute dal metabolismo microbico.
 Watson e Crick nel 1953 ci si incominciò ad affacciare alle tecniche di ingegneria genetica e del DNA
ricombinante. Fu possibile manipolare il DNA di un organismo per modificarlo o per combinarlo con
parti di DNA di un altro organismo
Negli anni 70 furono scoperti gli enzimi di restrizione e venne elaborata la tecnica di CLONAZIONE GENICA
(base dell’ingegneria genetica). L’ingegneria genetica permise di produrre l’insulina nel 1978 e l’ormone
della crescita nel 1979.
Gli anni 80 furono segnati dalla nascita dei cromosomi artificiali, della tecnica della “polymerase chain
reaction” (PCR), dei primi organismi geneticamente modificati (OGM) utilizzati in campo agronomico.
Mentre gli anni ’90 videro l’avvio dell’enorme progetto “Genoma Umano”: il sequenziamento del genoma
del primo organismo vivente (Haemophilus influenzae) risale al 1995, Nel 1997si ha la clonazione della pecora
Dolly.

SCOPERTE/STUDI UTILI ALLA BIOTECNOLOGIA


Teoria cellulare: è alla base delle biotecnologie moderne.
 1839 Schleiden elabora la TEORIA CELLULARE e individua una delle caratteristiche fondamentali
della cellula vegetale cioè la TOTIPOTENZA
NB: Secondo l’attuale formulazione, la teoria cellulare stabilisce che: tutti gli esseri viventi sono
costituiti da una o più cellule; le reazioni chimiche di un organismo vivente, compresi i meccanismi
di liberazione dell’energia e le reazioni di biosintesi, hanno luogo dentro le cellule; le cellule si
originano da altre cellule; le cellule contengono le informazioni ereditarie degli organismi di cui fanno
parte, e queste informazioni passano dalla cellula madre alla cellula figlia.

Colture di tessuti vegetali in vitro


 1902 Haberlandt fece il primo tentativo di coltura di un tessuto utilizzando una monocotiledone.
Riuscì a mantenere in coltura singole cellule di foglia ma esse non riuscivano a riprodursi per la
mancanza di ormoni e altre sostanze nutritive all’interno del mezzo di coltura SIGNIFICATO E STORIA
DELLE BIOTECNOLOGIE VEGETALI COLTURE DI TESSUTI VEGETALI in vitro
 1904 Hannig isolando embrioni immaturi in vitro ottenne piantine vitali di alcune specie della
famiglia delle crucifere (dicotiledone)
 1960 Jones ottenne la PRIMA LINEA CLONALE partendo da singola cellula.
 1960 Cocking riuscì ad ottenere per la prima volta cellule vitali vegetali prive di parete:
PROTOPLASTI. Lo studio della totipotenza dei protoplasti consentì l’ibridazione somatica di specie
sessualmente incompatibili e numerosi programmi di miglioramento genetico furono pertanto messi
a punto sfruttando quest’ultima tecnica per l’ottenimento di nuove cultivar. Tra le piante
maggiormente utilizzate per la fusione di protoplasti vi è sicuramente il tabacco (Nicotiana tabacum)
 1974 Zaenen insieme ad altri studiosi isola il plasmide Ti (tumor inducing) da Agrobacterium
tumefaciens.
 1983 Zambryski e collaboratori aprirono le porte per l’utilizzo del T-DNA di Agrobacterium come
veicolo per la trasformazione del DNA in un altro organismo … si aprono le frontiere per il
TRASFERIMENTO GENICO
 1986 Mullis trasformò con Agrobacterium la prima monocotiledone (Asparagus)
 1987 Sanford trasformò, con A. tumefaciens piante di cotone e rigenerazione di piante transgeniche
NB: Si andò verso la produzione di specie resistenti ai parassiti e alle infezioni virali. Esse possono così essere
coltivate riducendo drasticamente l’uso di insetticidi e di erbicidi. Il primo esempio in questo senso è stato
l’uso di una tossina letale per gli insetti, prodotta dal batterio Bacillus thuringiensi
 1985 Flores e Filner isolarono il gene Bt dal batterio
 1987 Barton si avvalse della tecnica del bombardamento di particelle (particle bombardment,
particle gun method, biolistic process, microprojectile bombardment or particle acceleration) per la
trasformazione genetica di piante.
 1989 Klein e colleghi introducono la tecnica dell’ ELETTROPORAZIONE: il trattamento provoca la
formazione di pori transienti sulla membrana delle cellule e quindi la possibilità di entrata del DNA
 1990 Dekeyser ed altri studiosi produssero piante di riso resistenti agli erbicidi mediante la
trasformazione mediata da polietilenglicole (PEG)
 1993 Flores e colleghi svilupparono la tecnica AFLP (amplified fragment lenght polymorphism), una
tecnica basata sulla reazione a catena della polimerasi che consente di individuare polimorfismi a
livello del DNA.
 1994 la Calgene (industria californiana) produce il pomodoro Flavr Savr, il primo alimento
geneticamente modificato introdotto nel mercato americano

Miglioramento dei substrati di crescita: Intorno agli anni ’30 nei terreni per le colture in vitro vennero
addizionate sostanze quali la VITAMINA B e l’ AUXINA (acido indolacetico - Went, 1927).

Regolatori di crescita:
 metà degli anni 30 i lavori svolti principalmente da Kogl e Haagen-Smit, in Olanda e da Thimann
negli Stati Uniti portarono alla scoperta che l'auxina in questione era l'acido 3-indolacetico (IAA).
 1955 il botanico svedese Skoog, isolò la prima CITOCHININA sintetica (kinetina o 6-benzil-
amminopurina) e dimostrò la sua funzione sulla promozione della divisione cellulare in colture di calli
di tabacco
 1957 Skoog e Miller dimostrarono che il rapporti tra auxine e citochinine influenzavano in modo
significativo la morfogenesi di radici e germogli da colture di tessuti fogliari di tabacco.
Contemporaneamente, venne scoperta una terza classe di regolatori di crescita, le GIBBERELLINE,
di cui si studiarono dapprima gli effetti in vivo, e solo alla fine degli anni ’50 quelli in vitro, che
proseguirono con maggiore rapidità negli anni ’60 e ’70
NB: Skoog insieme allo scienziato Murashige mise a punto il terreno di coltura «Murashige e Skoog»
(MS), che è ancora oggi il mezzo più usato nel campo delle colture in vitro di cellule vegetali.
I COLORI DELLE BIOTECNOLOGIE VEGETALI:

 Biotecnologie rosse: vengono applicate ai settori della medicina, della veterinaria e nell’industria
farmaceutica; hanno lo scopo di sviluppare nuovi farmaci e nuovi procedimenti di trattamento
profilattico o terapeutico di patologie
Es: cercare di riparare o di ricostruire parti di tessuti , produrre farmaci prevedendone l'assorbimento
da parte dell’organismo, terapia genica, produzione di vaccini.
NB: 1982 La Genentech produce l’insulina umana (Hinulin) utilizzando batteri geneticamente
modificati: è il primo farmaco «biotec» che viene approvato dalla FDA per il trattamento del diabete
 Biotecnologie verdi: Comprendono tutte le applicazioni collegate all’agricoltura (impiego di
biofertilizzanti e biopesticidi a basso impatto ambientale e di buona efficacia). Le piante si presentano
inoltre come candidate ideali per la manipolazioni genetiche, in quanto dotate di grande variabilità
e versatilità.
 Biotecnologie bianche: In questo gruppo troviamo le biotecnologie industriali che hanno come
obbiettivo quello di utilizzare mezzi biologici per la produzione di un prodotto commerciale o di
consumo di massa. I settori di applicazione vanno da quello alimentare, cosmetico, energetico, ecc.
Tra i vari esempi quello più comune è la produzione di enzimi come catalizzatori di diversi processi
tra cui ad esempio quelli legati alle energie rinnovabili, ai processi fermentativi ed altri ancora. Tali
tecnologie vengono impiegate per produzioni innovative attraverso processi più sostenibili (anche
dal punto di vista sociale) rispetto a quelle convenzionali.
Es: Miglioramento delle caratteristiche del prodotto, Miglioramento della produttività, Prodotti e
processi biocompatibili, Risparmio energetico legato alla produzione, Maggior tutela dell’ambiente,
Potenzialità di riutilizzo degli scarti e sottoprodotti
NB: Tra le biotecnologie bianche/industriali possiamo oggi riconoscere due macroaree: la chimica
fine (bio-molecole e biomateriali) e quella che potremo definire come produzione di bio-energia (bio-
combustibili). Tutte le applicazioni condividono un fondamento scientifico e tecnologico comune:
partendo da materiali rinnovabili o di scarto come materia prima, utilizzano dei microrganismi (anche
geneticamente modificati) ed i loro singoli componenti cellulari (enzimi) per ottenere prodotti in
modo sostenibile.
COLTURE VEGETALI IN VITRO:
I metodi di coltura in vitro permettono di produrre cellule, tessuti e organi vegetali in condizioni controllate
(temperatura, irraggiamento luminoso, disponibilità di nutrienti, pH) su substrati artificiali (mezzi colturali
o terreni di coltura).
NB: Le colture sono normalmente condotte in condizioni di sterilità, poiché i batteri potrebbero facilmente
proliferare sui terreni utilizzati. Per ben precisi scopi le cellule (o i tessuti, o gli organi) possono essere
coltivate in colture axeniche, in cui sono cioè presenti dei microrganismi selezionati, ma non qualunque altro
microrganismo

La totipotenza (capacità, sotto l’influenza di stimoli opportuni di generare un individuo simile a quello da cui
la cellula proviene) e la plasticità della cellula sono alla base delle tecniche delle colture in vitro vegetali.
Ricordiamo che non tutte le cellule sono totipotenti e che, in diversi casi, le cellule vegetali svolgono il
proprio compito da morte.
NB: Il dedifferenziamento e la rigenerazione sono due processi ampiamente sfruttati nelle colture vegetali
in vitro.
 Dedifferenziamento: consiste nel recupero dell’attività mitotica da parte di cellule che si erano
differenziate (e si trovavano quindi in G0) e che tornano ad acquisire attività meristematica. Il
dedifferenziamento può manifestarsi in seguito ad eventi traumatici (ferite) oppure può essere parte
di fenomeni naturali legati allo sviluppo della pianta ad es. formazione dei meristemi laterali. R
 Rigenerazione è la capacità di una singola cellula di riformare organi interi o, perfino, organismi
completi.

Il termine “colture di tessuti” include es. la propagazione di piante prive di virus (es. orchidee, fragole, uva,
etc), colture di protoplasti, sospensioni cellulari, colture di tessuti o organi, colture di antere e pollini per la
produzione di piante aploidi.
 Espianti: frammenti di pianta che viene tagliato ed usati per avviare una coltura in vitro. Possono
originare da quasi ogni parte del corpo della pianta: meristemi, gemme apicali, gemme ascellari,
foglie, fusti, piccioli, radici, elementi fiorali. Si preferiscono comunque porzioni in struttura primaria
della parte epigea della pianta in quanto giovani e meno soggette a contaminazioni da parte di
microrganismi.

STERILIZZAZIONE:
Gli espianti devono essere lavati con cura e sterilizzati in superficie senza danneggiare troppo il materiale
di partenza. Di solito si usano combinazioni di blandi agenti disinfettanti e tensioattivi non troppo aggressivi.
I terreni di coltura e gran parte degli strumenti sono sterilizzati in autoclave (P=1 atm, T= 121 °C per 15-20
min), alcuni strumenti si possono sterilizzare in stufa, altri mediante radiazioni ionizzanti (es. raggi gamma)
 Radiazioni elettromagnetiche: costituite da fotoni.
1. INFRAROSSE (OLTRE 7600 INFRAROSSE ANGSTROM)
2. VISIBILI (7600-4000 ANGSTROM)
3. ULTRAVIOLETTE (4000-1000 ANGSTROM)
4. RAGGI X (1000-0,1 ANGSTROM)
5. RAGGI GAMMA (0,1-0,001 ANGSTROM)
NB: I RAGGI GAMMA SONO EMESSI DA MOLTI ISOTOPI RADIOATTIVI. ISOTOPI RADIOATTIVI LE PRINCIPALI
FONTI DI RAGGI GAMMA PER APPLICAZIONI INDUSTRIALI SONO IL COBALTO-60 ED IL CESIO-137. I PRINCIPALI
VANTAGGI OFFERTI DALLA STERILIZZAZIONE CON RAGGI GAMMA SONO L’ALTISSIMO POTERE DI
PENETRAZIONE DI QUESTE RADIAZIONI E IL MODESTO INCREMENTO TERMICO DURANTE IL PROCESSO
(MENO DI 5°C) LA STABILITA’ DEI MATERIALI DI CONFEZIONAMENTO ALLE RADIAZIONI:
A) OTTIMA STABILITA’: POLIAMMIDI, POLISTIRENE, POLISULFONI, POLIURETANI
B) BUONA STABILITA’: VETRO (CAMB. COLORE), POLICARBONATO (INGIALLISCE), GOMMA NATURALE,
GOMMA NEOPRENE, POLIETILENE (QUELLO A BASSA DENSITA’ DIVENTA FRAGILE)
C) SCARSA STABILITA’: CELLULOSA E SUOI ESTERI, POLIMETILMETACRILATO, PVC, TEFLON,

Es. sterilizzazione materiale vegetale


Il materiale per produrre colture in vitreo deve essere sterile. Più il materiale è giovane meglio è: meno
probabilità ha di essere stato a contatto con i microrganismi. Gli apici meristematici non hanno un sistema
di conduzione sviluppato, quindi se il microorganismo dovesse veicolare si evita il trasporto poiché
materiale giovane.
 I bacelli: sono materiali che vengono sterilizzati in etanolo al 70%. Il baccello viene sterilizzato
velocemente anche sulla fiamma Bunsen ( modo molto veloce per non recare danno al materiale di
partenza ). Una volta che avviene la sterilizzazione il baccello i semi possono essere escissi e messi in
coltura. I semi possono essere ulteriormente sterilizzati, in maniera blanda: materiali antifunginei e
antibatterici. Hanno una pellicola costituita da questi prodotti per mantenere il seme sterile. Il
problema è che se pongo il seme in cotura in vitreo si deve eliminare quella pellicola, quindi va
“lavato” ( lavaggi in acqua sterile e ipoclorito di sodio 20% ). Il lavaggio dipende dalla grandezza del
seme. Può esserci poi una fase chiamata imbibizione: il seme si gonfia e accumula acqua. Aiuta il
seme a fari si che avvenga la germinazione. Il seme sterilizzato viene messo in capsule Petri sterili
con carta bibula ( carta particolare assorbente con una certa porosità ). Questa viene imbibita di
acqua ( il seme necessita di acqua per germinare ). La piastra viene poi messa al buio in termostato:
a seconda del seme sono necessarie temperature diverse ( si sta sui 19-24*C ). La germinazione
avverrà tra le 48-72 ore, una volta che esce la radichetta possiamo coltivare poi il seme.
Es: Bacello le orchidee producono baccelli ( Vaniglia ).
 Piante coltivate in campo: le piante arboree. Una delle piante più usate è la Psidum guajava fam.
Mirtaceae. È soggetta a impollinazione crociata e può essere propagata tramite innesto. il materiale
viene poi raccolto per la coltura.

Cappa a flusso laminare: Le cappe di sicurezza biologica sono inefficaci per i rischi di natura chimica per i
quali deve essere predisposta la canalizzazione all’esterno o possono essere installati opportuni filtri (ad es.
filtri a carbone attivo). Il flusso unidirezionaleè formato da filetti di aria sterile, filtrata attraverso filtri HEPA
(High Efficiency Particulate Air), paralleli tra loro ed aventi tutti la stessa velocità, generalmente di 0,5 m/sec.
I filetti di aria sterile trascinano lontano dall’area di lavoro i contaminanti ed evitano la formazioni di vortici.
I Filtri HEPA prevengono la contaminazione particellare, sono costituiti da fogli di microfibre di vetro
ripiegati più volte per aumentare la superficie filtrante. L’efficienza di filtrazione è la capacità di trattenere
particelle del diametro di 0,3 µm e deve essere compresa in un range che va da 99,97% a 99,99%. Quando
svolgo l’espianto, lo devo sterilizzare e mettere in un apposito terreno di coltura per farlo crescere. Prelievo
e messa in terreno devono essere fatte sotto cappa.
NB: Le cappe sono “biologiche” perché lavorano con materiale biologico. Se devo utilizzare solventi organici
non lavoro sotto la cappa biologica ma sotto la cappa chimica. Ci sono anche cappe completamente chiuse
per assicurare la completa sicurezza/immunità all’operatore
 Cappa a flusso laminare orizzontale: Area frontale aperta; l’aria filtrata attraverso il filtro HEPA posto
dietro la parete di fondo si muove orizzontalmente parallela al piano di lavoro verso l’apertura
frontale cioè verso l’operatore. Protegge solo il campione.
 Cappa a flusso laminare verticale: Area frontale aperta; l’aria filtrata attraverso il filtro HEPA si
muove verticalmente dall’alto verso il basso cioè verso il piano di lavoro dove viene in parte espulsa
e in parte ricircolata, il flusso laminare verticale produce una aspirazione di aria esterna che crea una
barriera di protezione per l’operatore ed impedisce la contaminazione del campione. Protegge
campione e operatore.
MEZZI COLTURALI:
La crescita e la morfogenesi delle colture vegetali sono influenzate dalla composizione del mezzo colturale,
che dovrà contenere tutto ciò che è necessario alla sopravvivenza, alla crescita, alla moltiplicazione ed al
differenziamento (eventualmente) delle cellule.
NB: Si tratta di miscele di zuccheri, vitamine, micro- e macroelementi. Il pH del terreno viene “aggiustato”
a ca. 5.8 ± 0.2 usando soluzioni diluite di NaOH o HCl, quindi se richiesto viene aggiunto un agente gelificante
che può essere Agar (8-10g/l), Phytagel (2-3 g/l) o Gelrite alla stessa concentrazione del Phytagel.
I terreni di coltura vengono sterilizzati in autoclave a 121°C per 20 min. In caso si debbano addizionare al
terreno fitormoni e/o antibiotici essi devono essere filtrati (0,22 µm) e aggiunti al mezzo di coltura già
autoclavato poichè sono sensibili alle alte temperature.

Terreni solidi: L’espianto va messo sul mezzo colturale per cresce, come noi vogliamo seguendo i nostri
obbiettivi. Ciò dipende dal terreno di coltura: ormoni, altre sostanze, pH ( 5.8 ). A seconda delle esigenze si
modificano i parametri necessari. Il terreno di coluta può essere liquido o solido.

 Agar: 8/10gr di agar per litro. Polisaccaride di origine vegetale prodotto dal genere di Alghe rosse. Si
può aggiungere prima di autoclavare.
 Phytagel: 2/3 gr per litro. È prodotto da un substrato batterico. È più idoneo per alcuni tipi di coltura,
ed e è anche più economico dell’Agar.
 Gelrite: gomma prodotta da un batterio per fermentazione, la Pseudomonas elodea. È un
tetrasaccaride di glucosio arabinosio e acido glucuronico.

NB: Uno dei terreni più usati è il mezzo B5 di Gamborg: micro e macronutrienti somministrati sottoforma di
Sali le piante colutrate e espiantate possono dopo essere irrigate in campo con tutti gli elementi sotto
riportati.

 Macroelementi: sono zolfo, fosforo, magnesio, calcio, potassio (KCl), azoto ( nitrato e ammonio),
ossigeno, carbonio: elementi aggiunti in concentrazioni millimolari. Potassio, fosforo e azoto sono i
più fondamentale perché la loro concentrazione è importante per la crescita della pianta dei diversi
stati fenologico.
 Microelementi: sono alluminio, boro, cloro, cobalto, ferro, iodio etc. Gli essenziali sono il rame e
zinco: la pianta necessita di questi micronutrienti poiché reclutati in molti processi biologici ( Zn per
prodizione clorofilla, sintesi proteica, metabolismo auxine ). Questi due elementi appartengono ai
metalli pesanti, quindi un eccesso di concentrazione può provocare danni gravi: stress abiotico. Sono
quindi micronutrienti essenziali ma potenzialmente dannosi se non in concentrazione corretta. Il
ferro viene usato per la fase di enzimi catalasi e perossidasi, trasportatore elettroni e fissazione di
azoto in leghemoglobina. I micronutrienti vengono addizionati micromolari.
NB: L’azoto viene addizionato come ione nitrato NO3- e ione ammonio NH4+: il loro rapporto deve
essere bilanciato per evitare la bitrescenza dei germogli ( aree nelle foglie dall’aspetto traslucido ).
Se però il substrato contiene molte sostanze azotate è preferiiìbile somministrare l’azoto in forma
ammoniacale che nitrica.

CARBOIDRARTI: Un terreno di coltura deve anche contenere carboidrati, poiché l’efficienza fotosintetica (dei
tessuti che ne siano eventualmente capaci) in vitro è limitata, anche in presenza di sufficiente illuminazione
(bassa conc di CO2). Lo zucchero più comunemente utilizzato è il SACCAROSIO (all’1-5%), in alternativa si
possono usare fruttosio e glucosio.
VITAMINE: Si aggiungono anche vitamine come tiamina, acido nicotinico 0,1/5mg/l e piridossina
0,1/10mg/l. Le piante non producono tutte le vitamine, quindi alcune vanno aggiunte: sono fondamentali
per il metabolismo delle piante. In realtà solo la tiamina è strettamente necessaria per la pianta.

 Tiamina: veniva utilizzata per curare il Ber iberi: dovuta a carenza di vitamina B che causa polinevriti
( in estremo oriente ). Il riso veniva brillato e sfogliato della cuticola ( luogo di vitamina B1 ) quindi
avevano il deficit. La tiamina può essere fosforilata sul gruppo OH e forma esteri mono, di e trifosfato.
Nella forma difosfato è richiesta come cofattore nel metabolismo di amminoacidi e carboidrati. Può
anche essere usata come non cofattore: in disfosfato serve per condizioni di stress abiotico e biotico.
Questa induce l’espressione di proteine di risposta ai patogeni ( PR proteine ). Serve per la resistenza
sistemica acquisita. Gli studi sono stati eseguiti su riso, tabacco, cetriolo.

È stato osservato che gli espianti di radice non possono crescere in assenza di tiamina. Non per tutte le specie
accade ciò: a seconda della pianta si osservano richieste e necessità diverse ( lino ). In questi casi la tiamina
viene prodotta endogenamente. Tuttavia la crescita è lenta.

Altre vitamine importanti sono biotina, acido folico, acido ascorbico, tocoferolo e riboflavina: queste però
non sono essenziali ma possono aiutare nella crescita.

 Mio-inositolo: se lo considero dal punto di vista chimico è un carboidrato idrogenato, dal punto di
vista medico è incluso nelle Vitamine B: in generale questa molecola è trattata come una Vitamina
non essenziale. Il mio-inositolo forma 6 idrossili che possono reagire con molecole di natura acida
formando degli esteri: a loro volta si forma il complesso estere-auxina-mioinositolo. L’auxina viene
dunque veicolata. Il mioinositolo stimola la formazione dei germogli e del callo.

AMMINOACIDI: Gli amminoacidi vengono aggiunti come fonte di azoto. Spesso sono aggiunti sottoforma di
caseina idrolizzata.

COMPOSTI ORGANICI ADIUVANTI: Si aggiungono anche altri composti di tipo organico: adiuvante. Non sono
molecole aggiunte perché essenziali, ma perché aiutano il processo di crescita. Sono spesso idrolizzati proteici
come il latte di cocco, polpa banana, estratto di malto. Quando la pianta ha difficoltà a crescere si
introducono come ultima spiaggia gli agenti adiuvanti.

Il carbone attivo si aggiunge perché adsorbente. È importante in alcuni terreni di coltura, per le piante che
colturate producono metaboliti tossici: così facendo il carbone le assorbe facilita la crescita delle cellule.
Anche il char coal e il polivinilpirrolidone possono essere utilizzati: azione sbiancante per analisi
spettrofotometriche.

L’acido alginico è un polisaccaride presente nelle alghe brune. Viene usato nella industria alimentare come
addensante o stabilizzante. Nella preparazione del terreno di coltura è impiegato per la propagazione delle
Orchidee. Vengono colturate su un terreno semi solido.
FITORMONI: nel 1965 Skoog e Miller definirono la
funzione di auxina e citochine. Equilibrio sbilanciato
verso auxine  rizogenesi / equilibrio sbilanciato
vero citochine  germogli

 Auxina: acido indol-3-acetico. È un


composto termolabile che soffre gli balzi della temperatura, e anche fotolabile. È molto poco
utilizzato per le colture in vitro poiché poco stabile. Si usano dunque auxine sintetiche: acido 2,4-
diclorofenossiacetico e acido indol-3-butirrico. L’IBA in realtà è prodotto anche dalla pianta, quindi
non è solo fotosintetico. Questi vengono utilizzati perché l’auxina induce la proliferazione e
distensione della cellula: la presenza di auxina induce la callogenesi e la rizogenesi in condizioni di
buio. È coinvolto anche nella embriogenesi somatica ( apomittico ): cellule somatiche messe in
opportune condizioni sono in grado di produrre embrione non zigotico. La prima divisione
embrionale zigotica è asimmetrica, lmnell’embrionale è simmetrica.
Le auxine sono anche coinvolte nella inibizione della produzione di germogli. Ci sono fasi di alcuni
processi in cui l’auxina è un fattore necessario inizialmente e poi diventa inibente nelle fasi
successive. Ci sono composti auxinlike come l’acido triclorofenossiacetico che possono essere
aggiunti al terreno di coltura.
 Citochinine: promuovono la formazione di germoglio ( gemme e caule ). In luce stimolano la
caulogenesi e inibiscono la rizogenesi. Si ha la zeatina e 2-isopenteniladenina. Stimolano la divisione
cellulare. Vengono usate assieme al dimetilsolfossido: il dimetilsolfossido ha il vantaggio di essere
un agente sterilizzante. Se metto la citochinina a quello posso aggiungere il tutto al terreno in coltura
perché già sterile.
 Gibberelline: 20 composti tra cui l’acido gibberellico. Può andare a indurre la fioritura e ha funzione
importante nella interruzione della dormienza in bulbo e seme. L’acido abscissico viene usato per
promuovere e inibire la crescita nel callo. Ha quasi sempre funzione dulpice di agente attivante o
inibente.

I fitormoni furono scoperti da Skoog e Miller, pubblicarono un lavoro in cui veniva utilizzato un terreno di
colture in cui venivano utilizzati fitormoni sintetici.

Parametri per colture: Quando prendo una porzione della pianta per fare colture in vitro devo tener conto
di diversi aspetti:
 Età pianta
 Stato fisiologico: in che fase fenologica è la pianta. Il metabolismo cambia molto in funzione dello
stato fenologico della pianta ( produzione di metaboliti secondari solo in fase di fioritura piuttosto
che fruttificazione etc ). La Brassica ( Crucifere ) ha alcune specie che sono migliori per la produzione
di germogli avventizi. Molte di queste vengono usate per la trasformazione con Agrobacterium. La
Petunia viene studiata per la regolazione dell’RNA ( RNA interference ).

Se utilizziamo una pianta arborea per la coltura in vitreo è meglio usare la parte più giovane, gemme o apici
meristematici. Lo zigote, dopo la mitosi, forma l’embrione ( dicotiledone o monocotiledone ). Qui si possono
già osservare due zone fondamentale per la produzione di organi:
 SAM: apice meristematico del fusto
 RAM: apice meristematico della radice
Tra queste due zone è presente l’ipocotile: alcune colture vengono fatte prendendo come espiante questa
zona. In altre piante, cereali, lo zigote viene utilizzato per cominciare la coltura.
Quando svolgo l’espianto, lo devo sterilizzare e mettere in un apposito terreno di coltura per farlo crescere.
Prelievo e messa in terreno devono essere fatte sotto cappa.
TIPI DI COLUTRE IN VITRO
Per fare la coltura in vitro parto da cellula o
organo? Da cellule posso produrre calli,
sospensioni cellulari o colture di
protoplasti. Se parto da organi posso fare o
coltura di radici, hairy roots o germogli.

1) COLTURE DI CELLULE
 Colture di callo: ammasso di cellule indifferenziate non organizzate. Nel terreno di coltura è
necessario uguale concentrazione di auxine e citochine. Per produrre un callo possono partire anche
da materiali molto diversi: espianto di foglia. Si produrrà tessuto cicatriziale che produrrà il callo
primario ( di prima formazione ). Le cellule del callo sono molto simili a quelle parenchimatiche:
parete primaria con grosso vacuolo. Quando si forma il callo primario si va a staccare e lo poso su
un nuovo terreno di coltura: la cellula per proliferare ha consumato sostanze nutritive nel vecchio
terreno di coltura. Nel nuovo terreno di coltura si formerà il callo secondario: una quota di callo può
essere mantenuta indefinitamente subculturandolo sul terreno fresco. Il callo è mantenuto a 25*C
in buio ( il callo rimane biancastro o bruno) o luce ( colorazione verde per cloroplasti). Variando poi
la concentrazione di auxine e citochinine posso determinare la differenziazione tissutale poiché il
callo è indifferenziato.

 Sospensioni cellulari: tipiche anche per colture di batteri. È fatta in liquido. Le cellule colturate
vengono selezionate precedentemente e queste vengono poi messe in coltura. Si formano clumps,
aggregati cellulari, in cui sono presento 20-100 cellule i quali vengono tenuti in
agitazione/movimento. La linea cellulare è inoculata in terreno fresco dopo 2/3 settimane. I clumps
vengono disaggregati in modo che le cellule non prolifino in gruppo. Quando si inoculano le cellule
nel terreno di coltura la beuta non deve essere completamente riempita di liquido, ma si deve
mantenere uno spazio per la circolazione di gas. L’agitazione a cui vengono cresciute le sospensioni
cellulari sono attorno a 100-120rpm. Il callo da cui viene avviata a sospensione cellulare può essere
compatto o friabile. Alcune specie vegetali non formano calli vegetali e rendono difficile l’avvio delle
sospensioni cellulari. Per queste specie la capacità di essere friabile è indotta variando la
composizione del mezzo di coltura. Si inocula il callo in una coltura semisolida.

 Colture di protoplasti: sono cellule vegetali a cui viene tolta la parete cellulare. La rimozione della
stessa è effettuata per mezzi enzimatici, chimici e meccanici. Queste cellule vengono poste in un
mezzo che consenta a questa di fare plasmolisi. Nella plasmolisi la cellula vede la membrana
leggermente distaccata dalla parete: si agisce con bisturi o laser per rimuovere la parete cellulare.
Per il metodo enzimatico si usano cellulasi e pectinasi: digeriscono i legami cellulosa e peptine a
livello della parete cellulare, la quale si disgregerà. Prima si usano le pectinasi, che agiscono sulle
lamelle mediane. Poi si usano le cellulari che operano sulla parete cellulare. Se faccio la rimozione
mediante metodo enzimatico devo introdurre gli enizmi nel terreno di coltura: la parete non sarà
presetne, ma se rimuovo gli enzimi si riforma la parete. Il protoplasto è più accessibile a determinati
processi. Posso utilizzali per la selezione di mutanti, ottenere ibridi somatici e per fare studi di
ingegneria genetica.
 Metodo combinato: viene fatta una soluzione di Sali ( Mg e K ) favorendo la plasmolisi.
Successivamente si ha la produzione di protoplasti. Vengono incubati in soluzioni con pectinasi e
cellulasi. Con centrifugazione poi si divde il tutto ottenendo i protoplasti.

Per testare la vitalità colture cellulari: Come facciamo a sapere se i protoplasmi sono vivi? Si usano
metodiche per testare la vitalità.

 Fluorescenza diacetato ( evidenzia l’attività delle esterasi per la formazione delle memrbane in
protoplasti vivi ),
 Fenosafranina ( si lega ai protoplasti morti ),
 Evans blu ( no cellula blu cellula viva ),
 Calcofluor bianco ( se si lega non sono protoplasti perché si legano alla parete di neoformazione ),
 Consumo di ossigeno, attività fotosintetica.

Metodi di misurazione della crescita cellulare: Sia per i calli, sia per le sospensioni di cellule (con parete o
protoplasti) è utile verificare periodicamente la crescita della coltura. La crescita dipende dall’aumento del
numero e delle dimensioni delle cellule. Un approccio comune è quello di misurare il gli incrementi di peso
fresco o secco, o incremento del numero di cell (conta cellulare). Per le sospensioni cellulari si può misurare
anche volume delle cellule impaccate (dopo centrifugazione).
NB: In tutti casi occorre separare le cellule dal mezzo di coltura.

Per la misura del numero di cellule si ricorre a particolari vetrini, chiamati emocitometri, come le camere di
Burker, di Thoma o di Neubauer. Esistono anche sistemi automatizzati per contare le cellule (Coulter cell
counter, citometria a flusso).
 Peso fresco: (il campione di partenza non viene perso)
a) Colture agarizzate: l’incremento del peso viene determinato prelevando periodicamente il callo
e pesandolo;
b) Sospensioni cellulari (terreno liquido): le cellule, prima di essere pesate, devono essere separate
dal mezzo di coltura (es. mediante filtrazione su filtro di carta o nylon, utilizzando una pompa da
vuoto, oppure centrifugando la sospensione e rimuovendo il surnatante).
 Peso secco: L’ esposizione delle cellule a temperature comprese tra 60 e 80°C per 48-72 h fa
evaporare l’acqua (contenuta in esse): il campione viene considerato secco quando il suo peso
rimane stabile nel tempo.
 Incremento del numero di cellule: La conta delle cellule viene fatta direttamente su un particolare
vetrino detto EMOCITOMETRO, osservando le cellule al microscopio. I vetrini hanno una sorta di
reticolo di dimensioni note ed inoltre è anche noto lo spessore tra il reticolo ed il vetrino
coprioggetto; in questo modo è possibile determinare il volume di sospensione cell presente in ogni
riquadro e conseguentemente sapere il numero medio di cellule presenti in 1ml di sospensione)
a) Thoma: Il reticolo corrisponde al largo quadrato centrale del modello Neubauer. Eritrociti e
trombociti
b) Burker: Il reticolo è formato da 9 larghi quadrati ciascuno con una superficie di 1 mm2 . Essi
servono per il conteggio dei leucociti. Ogni largo quadrato è suddiviso da una doppia linea
(distanti 0,05 mm) in altri gruppi di 16 quadrati con lati di 0,2 mm. Questi corrispondono come
formato al modello Neubauer, ma non hanno ulteriori suddivisioni.
Importanza delle colture di protoplasti: Grazie allo studio dei protoplasti si è potuta studiare la rigenerazione
della parete e lo sviluppo del callo/pianta.

 Rigenerazione delle piante: Il processo di formazione della parete cellulare inizia entro poche ore
dopo l’ isolamento e può durare due o più giorni in condizioni adeguate. Appena rigenerata la parete
cellulare, i protoplasti perdono la loro caratteristica forma sferica. La parete cellulare di nuova
formazione può essere identificata utilizzando il calcofluor. Essa è composta di microfibrille
debolmente legate che poi si andranno ad organizzare per formare la tipica parete cellulare vegetale.
Tale processo richiede la presenza continua di sostanze nutritive nel mezzo di coltura, in particolare
una fonte di carbonio facilmente metabolizzabile come ad esempio il saccarosio.

 Sviluppo pianta/callo: Quando la formazione della parete cellulare intorno protoplasti è completata,
le cellule aumentano di dimensione, e la prima divisione avviene generalmente entro 2-7 giorni.
Divisioni successive portano alla formazione di piccole colonie, ed entro la fine della terza settimana,
si formano colonie ben visibili macroscopicamente. Esse vengono trasferite in un mezzo osmotico
libero da mannitolo o sorbitolo, per poi sviluppare un callo. Con l’induzione ed opportune
manipolazioni, il callo può subire differenziazione organogenica o embriogenica e formare un’intera
pianta. La rigenerazione di piante può essere fatta da calli ottenuto sia da protoplasti o da colture di
organi vegetali. I due tipi di callo sono diversi: Il callo derivato da organi contiene gemme preformate
o strutture organizzate, mentre quello ottenuto da protoplasti non ha tali strutture

Centrifugando i protoplasti a diversa velocità e sottoponendoli ad un gradiente discontinuo si possono


originare dei frammenti detti SUB-PROTOPLASTI:

1. MINI-PROTOPLASTI: contenenti il NUCLEO e perciò anche detti carioplasti. Sono capaci di dividersi e
rigenerare una pianta.
2. CITOPLASTI: contenenti MATERIALE CITOPLASMATICO (e vacuolo) ma non hanno nucleo. Per questo
non si possono dividere ma possono essere usati per ibridazione.
3. MICRO - PROTOPLASTI: contenenti non tutti ma alcuni CROMOSOMI
2) COLTURE DI ORGANI
Come visto nello schema generale delle colture in vitro, oltre alle cellule si possono rigenerare e coltivare
anche degli interi organi. Il processo di formazione di organi è detto ORGANOGENESI, nel caso di radici si
parla di RIZOGENESI, in quello delle gemme vegetative e dei fusti di CAULOGENESI.
 Organogenesi diretta: se gli organi sono fatti rigenerare dall’espianto;
 Organogenesi indiretta: se invece si passa attraverso la formazione di un callo.
L’organogenesi prevede due fasi:
1. Induzione: durante la quale alcune cellule si differenziano e tornano a dividersi, formando i
meristemoidi ( gruppo di cellule che hanno un carattere meristematico e hanno origine post
embrionale/avventizio )
2. Determinazione: in seguito alla quale i meristemoidi assumono una crescita polarizzata (verso l’alto
o verso il basso), divenendo apici (e quindi meristemi) caulinari o radicali (SAM e RAM).

A) RIZOGENESI: Dal punto di vista ontogenico si distinguono tre tipi di radici:


 primarie: sviluppano dall’apice radicale embrionale
 secondarie: sviluppano dal periciclo delle radici primarie
 avventizie: Possono originare da radici mature in struttura secondaria (mai dal periciclo). Si
sviluppano da diversi tessuti dell’ipocotile, del caule e delle foglie. Si possono ottenere mediante
colture in vitro.

La formazione di radici è promossa da elevati livelli di auxina e bassi livelli di luce, mentre l’esposizione alla
luce e alti livelli di citochinine indirizzano verso la caulogenesi (e inibiscono la rizogenesi). Tuttavia, la
composizione del mezzo di coltura per dare caulogenesi o rizogenesi è specie-specifica e in molti casi non
sono ancora stati individuati i composti da aggiungere al terreno per indurre l’organogenesi. Si parla, in questi
casi, di specie recalcitranti all’organogenesi.

Tre classi di piante in base alle loro capacità rizogeniche avventizie:


 Piante capaci di radicare facilmente: La pianta ha un contenuto endogeno di sostanze (fitormoni
inclusi) sufficiente all’induzione ed allo sviluppo dei primordi radicali. Frequente è la rizogenesi
diretta.
 Piante che posseggono tutte le sostanze necessarie per la radicazione, ma bassi livelli di ormoni
(auxine endogene insufficienti). E’ necessaria somministrazione esogena di auxina per la radicazione.
 Piante recalcitranti alla radicazione: Impedimenti meccanici e/o carenze nutritive rendono la
radicazione avventizia in queste piante estremamente difficile.

Vari modi di ottenere colture di radici: Radici prelevate in vivo e poste su un terreno idoneo possono essere
coltivate direttamente. Tuttavia, questa metodica è poco praticata in quanto la superficie delle radici è
ampiamente colonizzata da microrganismi e spesso essi si possono ritrovare anche dentro i tessuti radicali.
La radice inoltre non presenta un’epidermide impermeabilizzata, per cui mal tollera i trattamenti di
sterilizzazione.
NB: Le alternative sono due:
1. Prelevare radici da semi germinati in vitro e precedentemente sterilizzati, oppure (ed è la soluzione
più frequente) coltivare radici rigenerate da un callo (RIZOGENESI INDIRETTA)
2. Prelevare radici da un espianto (RIZOGENESI DIRETTA)
Le radici sono coltivate in vitro per lo più per produrre metaboliti secondari che non sono prodotti dalle
cellule indifferenziate dei calli.
 La iosciamina è molto importante: servono per la dilatazione pupillare nei colliri.
 Gli alcaloidi tropanici sono usati in farmaci vasocotrittori.
 Le betalaine danno colorazioni alla pianta e queste non producono antociani ( barbabietole ).
 Fenilpropanoidi
 Indaco: sostanze ritrovate in tempi antichi, usata per tingere stoffe.
 Olii volatili: per prodotti antitarme

Coltura di Hairy Roots: Solo A. tumefaciens ed A. rhizogenes sono utilizzati per la trasformazione di piante.
A. rhizogenes: è responsabile della patologia delle ”Radici pelose”, sottili e filamentose radici presenti in
gimnosperme e angiosperme dicotiledoni. Tali radici possono essere escisse dalla pianta e fatte crescere in
vitro indefinitamente. Il batterio trasferisce alla cellula vegetale un frammento di DNA (T-DNA) localizzato
nel plasmide Ri (root inducing). Il T-DNA non espresso nella cellula batterica si integra nel DNA dell’ospite: i
geni batterici vengono perciò trascritti e tradotti. Infetta per lo più dicotiledoni.
Per le colture di hairy roots:
1. Sterilizzazione espianto
2. INFEZIONE dell’espianto con sospensioni di A. rhizogenes . L’infezione può essere DIRETTA o avvenire
per CO-COLTIVAZIONE.
3. Eliminazione dei batteri dopo circa 3gg dall’infezione: l’espianto viene posto su un terreno agarizzato
contente antibiotici.
4. FORMAZIONE ed ISOLAMENTO DELLE RADICI dopo ca. 1-4 sett: le radici formatesi nei siti di infezione
vengono separate dagli espianti.
5. COLTURE HAIRY ROOTS: TRASFERIMENTO in mezzi colturali rinnovati e privi di antibiotici e fitormoni.
6. Produzione di metaboliti/ produzione di piante transgeniche.

Post infezione espressione genetica della pianta: Alcuni geni quali iaaM e iaaH sono coinvolti nella biosintesi
di auxine; mas1’ , mas2’ e causano la sintesi di opine, derivati amminoacidici usati come nutrienti dai batteri.

L’avvenuta trasformazione può essere verificata per via DIRETTA (PCR o Southern Blot) o INDIRETTA (analisi
chimica sulle radici per rilevare la presenza di opine)
Il meccanismo di trasformazione genetica delle hairy roots ha enormi potenzialità e diversi vantaggi:
 alto tasso di crescita (costante e stabile, anche senza fitormoni nel mezzo)
 metodo biochimicamente stabile e questo e strettamente connesso con la stabilità genetica
 sintesi di metaboliti con rese superiori alle normali colture in vitro (radici)

Colture di germogli: : Anche i germogli possono essere coltivati in vitro. Sono ottenuti mediante caulogenesi
indiretta (a partire da masse cell indifferenziate) o per moltiplicazione di germogli di piante. I germogli sono
coltivati per ottenere la moltiplicazione clonale di piante su larga scala o per la produzione di alcuni metaboliti
secondari

Per testare la vitalità delle cellule: Per monitorare lo stato delle colture è necessario compiere dei saggi di
vitalità cellulare. Si ricorre a coloranti vitali e si applica la formula:
(Numero di cellule vive/Numero di cellule morte) x 100
Tra i coloranti più comuni:
 Blu tripano: le cellule morte (non vitali) si colorano di blu
 Fluresceina diacetato (FDA): le cellule vive accumulano una colorazione giallo-verde, risultato della
lisi dei gruppi acetilici dell’FDA (che rendono la fluoresceina incolore).
 Tryphenil tetrazolium chloride (TTC): la riduzione del sale di tetrazolio (incolore), operata da delle
deidrogenasi, produce una colorazione rossa (rosa chiaro-rosso intenso), che si manifesta solo nelle
cellule vive.
VARIABILITA’ SOMACLONALE:
Continuando a subcolturare una popolazione di cellule, dopo un po’ di tempo, si può osservare la comparsa
di varianti morfologiche: cellule con differente morfologia, tasso di crescita, capacità rigenerativa (caratteri
distintivi rispetto ai parentali).
Questo suggerisce la presenza di diversi genotipi (originati per mutazione o poliploidie, aneuploidie),
oppure di variazioni epigenetiche.

Le cellule con variazione somatiche possono essere isolate e propagate e usate per rigenerare nuovi individui
(SOMACLONI), portatori delle nuove caratteristiche.
NB: I somacloni si distinguono dai parentali o per caratteristiche morfologiche o fisiologiche. Tale variabilità
è definita «somaclonale» e può quindi avere origine genetica (variazioni permanenti, irreversibili e
certamente ereditabili) o epigenetica (variazioni transitorie, reversibili e generalm. non ereditabili). Il
fenomeno è più comune nel caso della organogenesi indiretta (cell indifferenziate).
La variabilità somaclonale fu osservata per la prima volta da Braun nel 1959.

Comprendono mutazioni di tutti i tipi:


a. puntiformi (alterazioni sequenza nucleotidica);
b. delezioni (perdita di un nucleotide o nel caso dei cromosomi aberrazione); - inversioni (rottura di un
filamento di DNA);
c. trasposizioni (inserimento all'interno di una sequenza codificante o di regolazione, di elementi
trasponibili o trasposoni;
d. duplicazioni (raddoppiamento di un tratto di cromosoma che si lega all'omologo causando una
doppia presenza di geni per lo stesso locus)

MUTAZIONI:
La frequenza delle mutazioni e del grado di ploidia è correlata positivamente con la durata della coltura e la
presenza di regolatori della crescita nel mezzo di coltura

 cambiamenti del grado di ploidia

 Riarrangiamenti chimerici di strati tissutali: piante orticole che presentano uno strato cellulare
geneticamente diverso dagli altri e che origina in generale da una cellula meristematica che ha subito
una mutazione. Mediante divisioni periclinali (cioè parallele alla superficie dell’organo) la cellula
mutata origina uno strato di cellule diverso dagli altri.
NB: In processi proliferativi rapidi (es. callogenesi) gli strati originati da cell mutate possono
mescolarsi e le piante così rigenerate possono essere chimeriche o non più chimeriche rispetto alla
pianta parentale.
 Alterazioni epigenetiche: Sono alterazioni reversibili (temporanee) e non ereditabili che possono
persistere per tutta la vita della pianta e le cui cause sono probabilmente da ricercare in fattori esterni
(es. terreno di coltura).
NB: Sono legate al riarrangiamento delle cromatina e allo stato di metilazione della citosina nel DNA.
Una di queste alterazioni è il “ringiovanimento” : fioritura precoce, incremento di radici avventizie
(piante più vigorose). Inoltre possiamo avere alterazioni epigenetiche anche mediante silenziamento
genico dovuto all’alterazione del pathway dei piccoli RNA non codificanti (microRNA). Questi processi
alterano l'espressione genica

Studiare la variabilità somaclonale per:


 Ridurne l’insorgenza al fine di ottenere un materiale propagato uniforme
 Avere una fonte di variabilità genetica
 Utilizzarla in programmi di miglioramento genetico (es isolamento di mutanti con nuovi fenotipi,
resistenti a patologie, insetti e stress abiotici)

Selezione somaclonale:
 Vivo: Richiede la coltivazione di molte piante (molto laborioso, ampi spazi di lavoro). Si selezionano
le piante rigenerate.
 Vitro: a selezione viene fatta in laboratorio. Può essere una selezione visiva (le varianti di interesse
sono distinguibili per la loro morfologia
es. cell che accumulano antociani rosse; oppure si effettua una selezione per resistenza (somacloni
resistenti a condizioni fisiche o chimiche).
PROPAGAZIONE IN VITRO DELLE PIANTE
Abbiamo visto come le colture in vitro, opportunamente indirizzate, possano dare luogo alla rigenerazione
di organi o perfino di intere piante. L’organogenesi in vitro passa attraverso una fase di dedifferenziamento
ed una di redifferenziamento. Durante le fasi di dedifferenziamento le cellule non devono riprogrammarsi
fino a uno stadio embrionale, infatti possono formare una massa di cellule indifferenziate, con aspetto
pseudoparenchimatico (callo), capace di rigenerare organi differenti, modulando ad
es. il rapporto auxine/citochinine nel mezzo colturale.
La distribuzione asimmetrica degli ormoni, ed in particolare dell’auxina e delle citochinine gioca un ruolo
fondamentale nell’organogenesi. Le cellule coinvolte nella rigenerazione possono anche non essere a diretto
contatto con i regolatori di crescita presenti nel mezzo; perciò devono essere coinvolti meccanismi di
comunicazione intercellulare.

La caulogenesi permette la propagazione clonale, cioè la moltiplicazione di piante geneticamente identiche


tra loro e a quelle di partenza. Ciò è possibile perché non interviene il rimescolamento genico
(ricombinazione) caratteristico della riproduzione sessuale.
In un anno è possibile ottenere migliaia di piante clonate, con enorme impatto in campo vivaistico, agricolo
e biotecnologico (miglioramento genetico, risanamento di piante virosate, ecc.).
NB: Il processo può avvenire senza passare attraverso una fase indifferenziata, e questa è la
micropropagazione; oppure si può operare rigenerando gli organi a partire da callo (organogenesi vegetativa
e radicale); infine è possibile operare mediante la formazione di embrioni somatici (per via diretta o
indiretta).

A) Micropropagazione:
Non è l’unico metodo di moltiplicazione clonale, infatti ne esistono diversi legati ad agrotecniche tradizionali,
come il taleaggio, l’innesto, la margotta.
Ma con la micropropagazione ottengo un elevatissimo numero di individui in tempi brevi e a costi ridotti.
Inoltre si è svincolati dalla periodicità stagionale.
Piante ornamentali, medicinali, aromatiche e di interesse economico in campo agricolo. Mele, pesche, kiwi,
pere, etc sono commercialmente moltiplicate per propagazione clonale in vitro. MICROPOPAGAZIONE.

Si parte per lo più da gemme ascellari e apicali per generare colture di germogli che vengono
successivamente fatti radicare, in modo da generare piante complete TUTTE IDENTICHE (per genotipo e
fenotipo) alla pianta madre e tra loro.
La micropropagazione è un utile strumento per la conservazione della biodiversità e la conservazione ex situ
di specie a rischio di estinzione o rare.

Si producono microgemme in vitro, che vengono poi incluse in capsule di alginato a produrre dei semi
artificiali che possono essere conservati in azoto liquido (crioconservazione -196°C, previo trattamento di
disidratazione o soluz. vitrificante). Mediante questa tecnica è possibile ottenere un numero molto elevato
di piante a partire da una ridotta quantità di materiale crioconservato.
Gli espianti (caulinari apicali o nodali con gemme ascellari) vengono trattati con citochinine per stimolare la
moltiplicazione di gemme vegetative (germogli). I diversi germogli che si formano vengono separati
dall’espianto, poi usati per nuovi cicli di moltiplicazione (ciascuna gemma darà origine ad un nuovo
germoglio). I germogli così ottenuti sono infine fatti radicare per generare le piantine.
Le tre fasi della micropropagazione sono:
1. Moltiplicazione germogli: questa fase serve ad incrementare il numero finale di piantine,
aumentando il n dei germogli (che vengono trasferiti in mezzi colturali rinnovati). L’attivazione delle
gemme ascellari è indotta da un basso rapporto tra auxine/citochinine. Per alcune specie (quali
patata, garofano, dalia, crisantemo) si ricorre anche alla somministrazione di GA3. Ciclo luce/buio e
temperatura adeguati. Prima della fase successiva i germogli sono inseriti in un ciclo di allungamento
(15-20 gg), durante il quale si riduce la concentrazione di citochinine, portando ad un rallentamento
della proliferazione.
2. Radicazione: fase in cui si ha la formazione di radici avventizie alla base del fusticino. La comparsa
delle radici è favorita dalla somministrazione di auxina (a. indolbutirrico 0.1-5mg/l), ma anche dalla
scarsità di zuccheri e minerali nel terreno di coltura. La radicazione richiede 3-5 settimane.
3. Il trapianto e l’acclimatazione: il trasferimento della piantina in terra e quello in ambiente sono
passaggi delicati della propagazione. Quando la pianta è ben radicata, viene acclimatata poco alla
volta, passando da un ambiente in vitro ad elevata umidità, assenza di microrganismi, irraggiamento
controllato ad uno in vivo avente condizioni completamente diverse. L’acclimatazione avviene in 2-
4 settimene ed è seguita da coltura in serra o in pieno campo.

B) Coltura di apici vegetativi per risanamento delle piante da virus:


Le colture in vitro possono essere usate per la produzione di piante sane partendo da piante infettate da
virus.
I virus possono essere trasmessi da pianta a pianta per: contatto, seme, polline, propagazione vegetativa,
funghi e vettori animali.
I mezzi per contrastare le malattie batteriche e virali sono piuttosto scarsi, e in molti casi la PREVENZIONE è
l’unica azione che ci consente di controllare la diffusione delle varie patologie.
Strategia: partire da materiale completamente sterile oppure risanare quello malato.
Le piante malate possono essere trattate con TERMOTERAPIA (35-38 °C per alcune settimane, per inattivare
patogeni sensibili al calore) e prelievo di apici meristematici per colture in vitro. Infatti gli apici meristematici
sono un ottimo materiale per le colture in vitro e sono di norma esenti dai virus (poiché privi di tessuti
conduttori differenziati).

C) Embriogenesi somatica:
Processo con cui alcune cellule somatiche (non dedicate alla riproduzione) sono indotte a formare degli
embrioni che hanno aspetto morfologico simile a quello degli embrioni zigotici (no fusione dei gameti-
fecondazione).
In opportune condizioni le cellule vegetali somatiche si differenziano, possono riguadagnare la totipotenza
e sviluppare un embrione.
NB: Gli espianti più favorevoli per questo processo sono le cellule dei meristemi, i tessuti che danno origine
agli embrioni zigotici e i tessuti giovani in genere (anche se già differenziati). L’embriogenesi somatica può
avvenire anche spontaneamente sia in tessuti riproduttivi (es. nucella e cellule sinergidi) sia in tessuti somatici
(foglia).
Es: In Crassula multicava (pianta succulenta perenne) cellule dell’epidermide fogliare, dopo che la foglia è
stata staccata dalla pianta, riprendono a dividersi e formano embrioni avventizi che successivamente
differenziano piante (Esempio di induzione di embrioni somatici mediante stress meccanico). Le cellule della
foglia in condizioni naturali non differenzierebbero mai embrioni, però il distacco dalla pianta
(meccanicamente) riattiva alcune cellule epidermiche alla divisione ed alla successiva organizzazione di
embrioni.

Gli embrioni somatici generati in vitro possono essere mantenuti e fatti sviluppare, per dare quindi origine a
plantule che potranno poi essere trasferite in serra o in campo.
Per quanto riguarda la ricerca di base, gli embrioni somatici sono particolarmente utili perché permettono
di studiare lo sviluppo embrionale con maggiore facilità rispetto agli embrioni zigotici, essendo molto più
accessibili.
Per gli aspetti applicativi, piante trasformate e mantenute in vitro possono essere indirizzate alla produzione
di embrioni somatici in modo da moltiplicarle.

Le cellule in coltura producono diversi fattori (tra i quali proteine e polisaccaridi) importanti per la
generazione degli embrioni, soprattutto come segnali intercellulari.
Mezzi di coltura sui quali siano stati cresciuti embrioni somatici sono in grado, a loro volta, di indurre
l’embriogenesi in nuove cellule.
NB: Una coltura giovane (< di un anno di età) ha un potenziale embriogenico maggiore rispetto a una
vecchia. Le cellule che più facilmente possono dare origine ad un embrione sono una sottopopolazione detta
massa pro-embriogenica (PEM, proembryogenic mass), in cui le cellule hanno aspetto di cellule
meristematiche in divisione.

Differenze tra ES e EZ:


 In vivo: l’embriogenesi
termina quando l’embrione
maturo immagazzina le
sostanze di riserva che gli
servono per la fase di dormienza
e il successivo sviluppo post
embrionale: germinazione. La
fase di dormienza nell ‘emb.
zigotica è sotto il controllo
ormonale dell’ABA, che viene
attivato da segnali materni. Gli
embrioni somatici non passano
nella fase di dormienza
 In vitro: la fase di dormienza
non si presenta e l’embrione
attivando SAM e RAM procede
immediatamente allo sviluppo
in plantula.

Embrioni normali possono originare da cellule somatiche: ciò suggerisce che l’informazione genetica per
l’embriogenesi è contenuta nella cellula e la formazione di embrioni somatici può progredire anche in assenza
dei prodotti dei geni materni.
NB: L’avvio dell’embriogenesi è però strettamente legata alla presenza di ormoni nel mezzo di coltura e
dipende anche dalla comunicazione cellula-cellula

Come l’organogenesi, anche l’embriogenesi somatica può essere:


 DIRETTA: avviene sulle cellule dell’espianto. L’embrione deriva da cellule dell’espianto e non si passa
dalla fase di callo. Le cellule proembriogeniche sono già determinate e richiedono: fitormoni nel
mezzo colturale, condizioni favorevoli per la crescita e per l’espressione dell’embriogenesi.
 INDIRETTA: derivante da coltura di callo. E’ richiesta proliferazione di callo. Le cellule devono andare
incontro a rideterminazione (poichè sono indfferenziate). I fitormoni sono richiesti non solo per la
ripresa delle divisioni mitotiche ma anche per la determinazione dello stato embriogenico
Non è facile distinguere i due processi. Nella diretta la resa è di solito inferiore. I risultati migliori,
quantitativamente, si ottengono da colture cellulari su terreno liquido. Di solito è migliore per ottenere
piante rigenerate geneticamente stabili, poiché la formazione di callo può causare variazioni somaclonali.

In alcune specie (vite, cacao, canna da zucchero) gli embrioni generati per embriogenesi somatica sono liberi
da virus. L’embriogenesi somatica diretta è stata adottata per diverse specie vegetali: Arabidopsis, erba
medica, broccoli, legumi, albero della canfora, cotone, eucalipto, caffè, riso, canna da zucchero, etc. (utile
nella rigenerazione di piante ricombinanti).

Gli embrioni somatici possono essere usati come germoplasma da sottoporre a crioconservazione.
L’embriogenesi somatica è altamente dipendente dalla specie o dal genotipo (angiosperme mono/dico e
gimnosperme) e da molti fattori esterni (chimici e fisici) oltre che fattori morfologici e molecolari.

Fattori induttivi della embriogenesi somatica: La produzione di embrioni somatici è frequentemente indotta
in vitro ricorrendo ad
 AUXINE, in particolare al 2,4-D (utilizzato da solo o in combinazione).
 CITOCHININE (TDZ), zuccheri, sali minerali, salicilato, metalli pesanti, e stress osmotici.

Induzione: Le auxine promuovono il processo ma devono essere rimosse perché l’embriogenesi possa
procedere oltre lo stadio globulare. L’induzione si manifesta con incubazione in presenza di auxina per
qualche giorno (1-7), a seconda del tipo di materiale di partenza. In presenza continua di ormoni le PEM
producono tutti i prodotti genici necessari per la fase globulare ma anche prodotti che ne inibiscono il
successivo sviluppo: coltura cellulare con potenzialità embriogenica. Rimuovendo gli ormoni si interrompe la
sintesi degli inibitori e l’embriogenesi prosegue da sola. Il completamento del programma è garantito dalla
sintesi endogena dell’ormone. Non si hanno le fasi successive di dormienza.

NB: Dopo lo stadio a torpedine lo sviluppo degli embrioni somatici e zigotici diverge: i secondi cominciano
ad accumulare proteine e sostanze di riserva, preparandosi alla disidratazione e dormienza, il tutto sotto il
controllo dell’ABA. Gli embrioni somatici producono una certa quantità di ABA (e attivano geni ABA-
inducibili), ma non entrano in dormienza; probabilmente la concentrazione del regolatore di crescita deve
essere incrementata dall’ambiente circostante l’embrione per arrivare a indurre dormienza. Questa ipotesi
è in accordo con i risultati di esperimenti in cui si somministravano elevate quantità di ABA esogeno, fino a
indurre la dormienza degli embrioni somatici.