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INTRODUZIONE
Con il termine amplificazione dell’intero genoma(“whole genome amplification”, WGA) non s’intende unatecnica singola, ma un ampio spettro di metodiche messea punto con lo scopo di ottenere da una quantità limitatadi DNA genomico (approssimativamente 7 pg), qualequella presente in una singola cellula, un campioneidentico per composizione all’originale, ma con unaconcentrazione più elevata (1). I primi protocolli per la WGA risalgono agli anni ’90 ederano basati sulla reazione a catena della polimerasi(PCR) (2, 3). Inizialmente, la WGA è stata applicatasoprattutto nel campo della medicina forense, ma oggi,grazie a un’ampia implementazione della tecnica, l’usodella WGA ha aperto la strada agli studi genetici su largascala e alla diagnostica molecolare su campioni biologicicostituti da singole cellule. La WGA è, infatti, unpassaggio essenziale quando s’intendono utilizzaretecniche come l’“array” basato su ibridazione comparativadel genoma (“array-comparative genomic hybridization”,aCGH) (4, 5), le indagini su larga scala per ladeterminazione della variabilità genomica o le tecnologiedi sequenziamento del DNA di nuova generazione (“nextgeneration sequencing”, NGS) che permettono ilconfronto di intere sequenze del genoma a partire dapiccolissime quantità di DNA (Figura 1) (6-8). Ad esempio,l’introduzione della WGA consente di ottenere la quantitàdi DNA adeguata per la preparazione di una libreria per ilNGS, anche partendo da una singola cellula.Sono oggi in uso diverse metodiche, che possonoessere distinte in metodi WGA basati su PCR (ad es.,“primer extension preampification”-PCR o “degenerateoligonucleotide”-PCR) (2, 3) e metodi WGA non basati suuna PCR [ad es., “multiple displacement amplification”(MDA) e “multiple annealing and looping-basedamplification analysis” (MALBAC)] (9, 10). Questemetodiche differiscono tra loro, oltre che per i protocolli dilaboratorio, anche per l’efficacia dell’amplificazione.Questa è determinata da vari fattori: a) quantità diprodotto ottenuto, in quanto poter fare affidamento suuna elevata capacità di amplificazione permette didiminuire la quantità del materiale di partenza per l’analisi molecolare, come la possibilità di analizzareanche una singola cellula; b) lunghezza dei prodottiamplificati, poiché le tecniche che generano ampliconipiù lunghi tendono a preservare il “linkage” genetico tra
loci 
(11); c) costi e semplicità nell’esecuzione dei
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ABSTRACT
Whole genome amplification on single cell.
Thewhole genome amplification (WGA) is a method for an entiregenome amplification, starting with low amounts of DNA. Particularly, it allows downstream analysis, such as genomicscreening [i.e., comparative genomic hybridization (CGH) array, next generation sequencing] and single genemutation detection in single cells. Because WGA could introduce few bias, dependent on different methods, their selection should be related to the application. The first WGA method was based on amplification reaction and differentlyfrom a regular polymerase chain reaction (PCR), in which a single genetic
locus
is amplified, different locus wereamplified simultaneously. Nowadays, several methods have been developed for WGA: degenerate oligonucleotidePCR and primer extension preamplification based on PCR, and multiple displacement amplification achieved withisothermal reaction setup. Each WGA approach has limitations, such as the genome coverage, chimeric DNAmolecules, preferential allele amplification or allele drop-out and the guanine-cytosine (GC) richness (GC%). In thisreview, we detailed different WGA methods for single cell and their most important applications, such as cancer diagnosis and reproductive medicine.
Corrispondenza a: Federica Cariati, CEINGE-Biotecnologie Avanzate scarl, Via G. Salvatore 486, 80131 Napoli. Tel. 0813737890,Fax 0813737808, E-mail cariati@ceinge.unina.it Ricevuto: 27.10.2015Revisionato: 22.02.2016Accettato: 12.04.2016Pubblicato on-line: 17.11.2016DOI: 10.19186/BC_2016.034biochimica clinica, 2016, vol.
40
, n. 4 293
 
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protocolli di laboratorio (1).In letteratura sono presenti numerosi lavori checonfrontano le metodiche di WGA basandosi o surisultati di tecniche successive, come variazione nelnumero di copie del DNA (“copy number variations”,CNVs), variazioni di singolo nucleotide (“singlenucleotide variations”, SNVs) in campioni ottenuti conWGA rispetto al campione di DNA originale usato comecontrollo (12) o in termini di efficienza e uniformità dicopertura del genoma, riproducibilità, ed errori diamplificazione (13, 14). Sappiamo tuttavia che nessunadelle metodiche di WGA attualmente in uso è scevra daerrori tecnici (15). Nel complesso, si può affermare chemaggiore è la quantità di DNA ottenuta dopo WGA,maggiori sono gli errori di amplificazione riscontrati. Per questo motivo, la metodica WGA deve essereconsiderata parte integrante del flusso di lavoro e deveessere adeguata a ogni successiva metodica e alloscopo dell’indagine. Gli errori di amplificazione cui bisogna prestaremaggiore attenzione quando si utilizza la WGA per applicazioni biomediche sono l’amplificazionepreferenziale (PA) di un allele, il fallimento della reazionedi PCR in un allele (“allele drop out”, ADO) e il riscontrofalsamente positivo di SNVs. PA può verificarsi nella fase di appaiamento dellesonde oligonucleotidiche (“primer”), a causa del lorolegame preferenziale con una specifica regione di DNA(15). Il risultato è che nel prodotto amplificato con WGA,una sequenza di DNA può essere più rappresentatarispetto ad altre e rispetto al campione di partenza. LaPA dipende dalle caratteristiche intrinseche delcampione iniziale, in particolare dal contenuto diguanina-citosina (GC) del DNA. È noto che le regioni diDNA ad alto contenuto di GC sono le più difficili daamplificare per la formazione di strutture secondarie, cherendono difficoltoso l’appaiamento dei “primer” (16).Per applicazioni in campo medico, la maggioredifficoltà dell’interpretazione analitica dei risultati ottenutidalla WGA su singola cellula è tuttavia riconducibileall’ADO (la cui incidenza è stata stimata dal 5% al 25%,a seconda del tipo di WGA utilizzata) (17). Il fenomenodell’ADO, che consiste nella mancata amplificazione diuno dei due alleli presenti in un
locus
eterozigote, puòessere causato da lisi imperfetta della cellula, dalladenaturazione a basse temperature, dal fatto che ilcampione di DNA di partenza sia degradato e dalla DNApolimerasi utilizzata (18). La falsa positività è definitacome il riscontro di variazioni di singolo nucleotide neiprodotti WGA che non sono presenti nel campione dipartenza e quindi non sono confermati nel campione diDNA genomico di controllo (19). In questa rassegna sono riportati i principi ecomparate le caratteristiche delle più comuni metodicheWGA su singola cellula attualmente in uso. La qualità ela quantità del DNA di partenza sono essenziali per applicazioni quali il sequenziamento e lagenotipizzazione; quindi, al fine di limitare errori tecnici eaumentare l’accuratezza, i protocolli per le metodiche diWGA sono oggetto di continua revisione e messa apunto. Inoltre, è fornito un quadro d’insieme per la sceltadella giusta metodica WGA in relazione alle successivemetodiche utilizzate e allo scopo dell’analisi della singolacellula. Infine, sono descritte alcune delle applicazionibiomediche per le quali è più utile partire dalla singolacellula, ad es., l’identificazione di cellule tumoralicircolanti e la diagnosi genetica preimpianto.
METODICHE WGA BASATE SU PCR“Primer extension preamplification”
La prima metodica utilizzata per la WGA su singolacellula risale agli anni ‘90 ed è la “primer extensionpreamplification” (PEP-PCR) (Figura 2) (2). Dopo unafase di denaturazione, la PEP-PCR prevede una fase diappaiamento (“annealing”) a bassa temperatura (37 °C),in cui sonde oligonucleotidiche diverse tra loro (definite“random primer”) di ~15 bp legano il DNA genomico, euna successiva fase di amplificazione durante la quale
Figura 1
Rappresentazione schematica della sequenza di amplificazione dell’intero genoma per applicazioni biomediche da singola cellula.PCR, reazione a catena della polimerasi; CGH, “comparative genomic hybridization”.
Real-time PCRMultiplex PCRSequenziamento Array CGHNext generationsequencing
294biochimica clinica, 2016, vol.
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, n. 4
 
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una Taq polimerasi, in ~50 cicli di estensione, generasvariate copie della sequenza di DNA presenteoriginariamente nel campione. Grazie ai “random primer”,che legando il DNA in più punti diversi ne assicurano unacopertura estesa, la PEP-PCR è in grado di amplificare~96% del genoma almeno 1000 volte. Il protocollo basato sulla PEP-PCR è stato miglioratosuccessivamente [“improved” (I)-PEP] utilizzando unenzima a elevata processività e modificando alcunecondizioni di PCR al fine di ridurre i tempi tecnici da 14ore a 5,5 ore (20).
“Degenerate oligonucleotide primed”
La “degenerate oligonucleotide primed” (DOP-PCR)consiste in una reazione di PCR basata su sondeoligonucleotidiche parzialmente degenerate, chepresentano all’estremità 3’ una sequenza variabile di 6basi e all’estremità 5’ una sequenza comune (per questo sono definite parzialmente degenerate) (Figura3) (3). A un’iniziale fase di preamplificazione, in cui lesonde oligonucleotidiche legano il DNA stampo a bassetemperature (~30 °C) al fine di ridurne la specificità,segue un ciclo di amplificazione in cui i prodotti ottenutisono amplificati mediante sonde oligonucleotidiche, chea elevate temperature si appaiano alla sequenzacomune al 5’. Questa fase di amplificazione è di tipoesponenziale: quindi fattori che condizionanol’amplificazione di alcuni tratti di DNA genomico rispettoad altri potrebbero condizionare l’uniformità dellacopertura del genoma (15).In entrambe le metodiche descritte la WGA si basasu una reazione di PCR di tipo esponenziale ed èutilizzata la Taq DNA polimerasi, che oltre a causareuna maggiore percentuale di errore di amplificazione,limita l’uniformità della copertura del genoma e lalunghezza dei frammenti amplificati; infatti, entrambeproducono frammenti di DNA relativamente piccoli(~0,2-2 kb) (21). L’appaiamento dei “primer” in più trattiè favorito da temperature molto basse; tuttavia, nellaDOP-PCR sono utilizzati “primer” parzialmentedegenerati. La differenza principale risiede nella resa diDNA finale, che è superiore utilizzando la DOP-PCR.
METODICHE WGA NON BASATE SU PCR
In alternativa alle metodiche WGA basate su PCR eal fine di ridurre gli errori riscontrati, sono state messe apunto tecniche di WGA non basate su PCR, che, pur assicurando un’elevata copertura del genoma, limitanol’eventuale introduzione di errori di amplificazione.
“Multiple displacement amplification”
La MDA, messa a punto nel 2001, si avvale diparticolari “random primer”, di una DNA polimerasi aelevata processività (la polimerasi
Φ
29) e di condizioni
Figura 2
Schema di “primer extension preamplification”.WGA, whole genomic amplification.
 
Figura 3
Schema di “degenerate oligonucleotide primed”-PCR.WGA, whole genomic amplification.
biochimica clinica, 2016, vol.
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, n. 4 295

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