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DNA RICOMBINANTE

Rende possibile isolare e tagliare brevi


sequenze di DNA per trasferirle nel genoma di
altre cellule in modo da modificare l'espressione
di uno o pi geni.
CLONAGGIO
Utilizzando un batterio, l'escherichia coli si
individuano in esso due geni ognuno dei quali
conferisce resistenza a un diverso
antibiotico(kanamicina e tetraciclina), che erano
contenuti in plasmidi, ossia in frammenti di
DNA a forma di anello che si replicano
indipendentemente dal cromosoma
batterico.Utilizzando particolari enzimi essi
tagliarono i due geni e li unirono in un nuovo
plasmide.Reinserirono poi il plasmide risultante
in cellule di coli e osservarono che questi batteri
risultavano resistenti a entrambi gli antibiotici.
I ''particolari enzimi'' sono gli
ENZIMI DI RESTRINZIONE
proteine in grado di tagliare il DNA a livello di
sequenze nucleotidiche precise chiamate siti di
restrinzione.Gli enzimi di restrinzione sono
prodotti dai batteri per proteggersi dai virus che
li parassitano tagliandone il DNA. Riescono ad
agire solo sul DNA estraneo poich il batterio
marchia con un gruppo metile CH3 la citosina e
la adenina che compongono i siti di restrizione
presenti sul proprio DNA, cos evita di
autodistruggersi.
ESTREMITA' ADESIVE
una sequenza palindroma di 4 6 o 8 coppie di
basi azotate. La sequenza sul filamento
superiore letta nella direzione 5-3 identica a
quella sul filamento inferiore letta nella stessa
direzione. Pi lunghe sono queste sequenze e
meno spesso si trovano lungo il genoma.Ogni
volta che un enzima di restrizione riconosce la
propria sequenza palindroma, rompe i legami
tra i nucleotidi in modi differenti. A seguito di
questi tagli sfalsati, i deboli legami a idrogeno
che tengono unite le basi si spezzano e i due
filamenti si separano formando delle code
singole dette ''estremit adesive'''.
Le estremit adesive permettono l'appaiamento
complementare con estremit simili create su un
altro frammento di DNA contenente il
medesimo sito di restrizione. Ai legami a
idrogeno che si formano inizialmente fra le basi
delle estremit adesive,segue la fusione dei due
frammenti attraverso la DNA ligasi che
permette il legame covalente tra
nucleotidi.Utilizzando gli enzimi di restrinzione
e le ligasi quindi possibile tragliare sequenze
di DNA e cucirle nei plasmidi che diventano
vettori ricombinanti capaci di mescolare il DNA
di organismi diversi. Per inserire un vettore
ricombinante in un batterio(trasformazione
batterica) si creano temporaneamente dei pori
per il loro ingresso nella parete cellulare del
batterio.Una volta all'interno della cellula
batterica, i vettori ricombinanti si replicano
producendo frammenti specifici di DNA o
cloni.
DNA OSCURO
Il 2% del genoma umano costituito da geni e
la parte restante quella che non codifica. Il
DNA non codificante ha un ruolo di riserva o
regolazione nell'espressione dei geni. Serve ad
accedere o spegnare i geni innescando o
disinnescando la sintesi di una specifica
proteina.

PCR
Consente per mezzo di una DNA polimerasi di
produrre rapidamente milioni di copie di una
regione di DNA a partire da quantit ridotte di
materiale. Una volta individuata la regione
bersaglio dell'amplificazione bisogna conoscere
le sequenze nucleotidiche che la delimitano;
esse rappresentano gli stampi per la sintesi in
vitro degli inneschi(primer) dai quali avr
orgine la reazione di duplicazione della regione
bersaglio.
I primer sono due sequenze di 17-30 nucleotidi
complementari alle sequenze del DNA bersaglio
che ne costituiscono rispettivamente l'inizio su
un filamento e la fine sul filamento opposto. I
primer sono progettati in modo che appaiandosi
con il rispettivo filamento, collochino le loro
estremit 3 all'inizio della regione da
amplificare.Cos la sintesi di DNA pu
procedere su entrambi i filamenti in direzione 53. A partire dal primer, la DNA polimerasi
catalizza l'aggiunta dei singoli nucleotidi sulla
base della sequenza complementare che fa da
stampo. L'enzima utilizza i nucleotidi nella
forma contenente gruppi fosfato(dNTP). Questi
sono privati di due ioni fosfato.
La reazione di replicazione ha luogo nel
termociclatore e prevede tre tappe. La prima
avviene a 94C ed la denaturazione della
doppia elica del DNA stampo in due singoli
filamenti. La seconda a 30-65C ed
l'appaiamento dei primer alle sequenze di DNA
a singola elica localizzate alle estremit del
frammento bersaglio(la temperatura varia in
base al primer). L'ultima fase avviene a 6575C e riguarda l'estensione dai primer
mediante aggiunta di desossiribonucleotidi nella
direzione 5-3 a opera della DNA polimerasi.
KO GENICO-SILENZIAMENTO
L'espressione di un particolare gene viene
annullata sostituendo la sequenza nucleotidica
attiva con una sequenza modificata in
laboratorio in modo che non sia pi in grado di
tradursi in proteina. La sostituzione avviene
grazie al processo di ricombinazione omologa
ossia sfruttando la capacit che hanno due
filamenti di DNA caratterizzati da sequenze
nucleotidiche omologhe di appairsi e scambiarsi
materiale genetico. Si producono dei topi KO in
cui un gene specifico stato silenziato grazie
alla ricombinazione omologa in una coltura di
cellule staminali embrionali.Le cellule cos
ottenute sono iniettate in un embrione sano
differente.Si produce cos un animale chimerico
che viene impiantato nell'utero di una
femmina.In tal modo il DNA dei topi generati
non deriva dal DNA della madre in affitto. La
progenie caratterizzata da alcune cellule
germinali che possiedono l'allele inattivato del
gene di interesse. A seguito di diversi incroci
quando si uniscono due gameti con l'allele
inattivato si ottiene la generazione di topo KO
per il difetto cercato.
IRNA
E' un silenziamento genico post-trascrizionale.
L'espressione dei singoli geni pu essere
modulata da specifiche molecole di RNA a
doppio filamento(duplex RNA).Tali molecole
vengono aperte con enzimi e frammentate in
brevi sequenze di RNA interferente
breve(siRNA). I siRNA sono poi sequestrati da
un altro sistema proteico che li riduce a
frammenti singoli i quali si appaiano a specifici
tratti complementari dei loro mRNA bersaglio
impedendone la traduzione e inducendone la
degradazione.

SEQUENZIAMENTO
Mappatura genetica: rappresenta la distanza
relativa tra geni ricavata dalla probabilit che
essi siano associati negli incroci o in altre
tecniche genetiche analoghe.
Mappatura fisica:si basa sulle tecniche utilizzate
in biologia molecolare per costruire mappe che
mostrano la posizione fisica dei geni rispetto a
particolari sequenze di DNA.
Metodo di Sanger:Questa tecnica prevede che
degli inneschi sintetici si appaiano in una
reazione in provetta a un frammento di DNA a
singolo filamento di sequenza ignota e la DNA
polimerasi inizi l'allungamento sulla base dello
stampo complementare utilizzando i dNTP che
vengono forniti. All'interno della miscela di
dNTP sono introdotte piccole quantit di
nucleotidi terminatori(sono dei ddNTP ovvero
dei dNTP nella cui molecola di ribosio l'unico
gruppo OH stato sotituito con un atomo di
idrogeno). A causa della sostituzione subita i
terminatori sono privi della capacit di legarsi a
un altro nucleotide per cui interrompono la
reazione di polimerizzazione bloccando la
sintesi della catena.La casualit dell'aggiunta
alla sequenza in crescita di un dNTP o del
ddNTP determina la sintesi di filamenti di
diversa lunghezza che si concludono tutti con
un ddNTP. Separando queste sequenze e
ordinandole dalla pi corta(innesco+primo
ddNTP) alla pi lunga(innesco+intera
sequenza+ultimo ddNTP) si pu ricostruire
l'esatta successione con cui nucleotidi sono
aggiunti al filamento in crescita e quindi per
complementariet ricavare la sequenza di basi
sullo stampo.Ogni terminatore masrcato con
un composto fluorescente.
ELETTROFORESI SU GEL
Serve per separare i frammenti di DNA. Sfrutta
le caratteristiche chimiche delle molecole per
separarle e identificarle grazie al loro diverso
comportamento sotto l'azione di un campo
elettrico. A ph neutro i frammenti di DNA sono
tutti carichi negativamente a causa dei gruppi
fosfato che contengono ma se sottoposti a un
campo elettrico si muovono verso l'elettrodo
positivo con velocit diverse in funzione della
loro differente dimensione. I fogli di
gel(agarosio o poliacrilammide) si comportano
come un setaccio che rallenta le molecole; le
pi corte sfuggono meglio mentre le pi lunghe
sono trattenute di pi. A corsa terminata e a
separazione effettuata, i frammenti intrappolati
nel gel vengono colorati.
LIBRERIA GENOMICA
Collezione di segmenti di DNA provenienti dal
genoma di un organiscmo, ospitati in vettori
ricombinanti all'interno di cellule
batteriche.Rappresentano il materiale su cui
realizzare le reazioni di sequenziamento su ogni
singolo frammento.Realizzati i sequenziamenti
la fase successiva consiste nell'unirli nell'ordine
corretto.La sequenza originale ottenuta con
programmi che confrontano le sequenze
derivanti da una libreria genomica cercando i
punti di sovrapposizione tra i frammenti.
OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO
Sono brevi frammenti di DNA o RNA sintetici
in modo da contenere la sequenza nucleotidica
complementare a quella del DNA
condificante(senso) o dell'mRNA del gene che
si vuole spegnere. L'oligonucleotide antisenso si
appaia al DNA senso o all'mRNA impedendo la
trascrizione(dna) e la traduzione(mRNA).