Il concetto di specie microbica

Il concetto di specie usato per

piante ed animali non si applica
ai procarioti.

Il concetto di specie microbica

non ha una base teorica solida,
ma tende ad essere arbitrario,
antropocentrico o guidato da
necessità pratiche.

Il sequenziamento e la
comparazione di interi genomi:
miglior metodo di tassonomia
molecolare.
Approccio tassonomico tradizionale

L’approccio molecolare mediante ibridazione DNA-

DNA (DDH) è il metodo di riferimento.

Sia il contenuto in geni che le similarità nucleotidiche di

geni condivisi contribuiscono a una misura della
parentela genomica complessiva di due isolati.

L’identità di specie tra due diversi isolati è determinata

da almeno il 70% di ibridazione tra i due genomi in
condizioni standard.

I dati di DDH sono in accordo con risultati recenti che

utilizzano il sequenziamento di interi genomi o analisi
multilocus.
La tecnica DDH
Limiti della tecnica DDH
Pochi laboratori usano attualmente
questo metodo. I motivi:

 non adatta ad una

identificazione veloce
 non adatta per la
classificazione di
procarioti che attualmente
risultano non- coltivabili
 prevede la comparazione di due
genomi per volta, non è
possibile fare riferimento ad una
banca dati
Approccio tassonomico più usuale

Attualmente, nuovi isolati

vengono comparati tra loro e con
taxa noti determinando le
similarità di sequenza nei loro
geni 16S rDNA.
Sequenziamento del gene rRNA 16S
Coltura pura

Primer universali

∼1500 bp

oppure clonaggio delle

sequenze amplificate
Risultato dell’approccio tassonomico
molecolare

Allineamento delle sequenze degli amplificati 16S rRNA

Calcolo della distanza evolutiva Albero filogenetico

Differenziazione tra batteri utilizzando
l’analisi del 16S rRNA

Due isolati appartengono alla stessa specie

se mostrano almeno il

97% di identità

a livello della sequenza del gene 16S rRNA.

Due isolati appartengono allo stesso genere

se mostrano il

93-95% di identità
 Risultati discordanti
Le sequenze di 16S rDNA sono molto conservate e non forniscono sufficiente risoluzione
per esplorare le parentele tra popolazioni batteriche strettamente imparentate.
Percentuale di similarità del 16S rRNA

Percentuale di similarità genomica DNA/DNA

 Esiste la specie microbica ?

La trasformazione, coniugazione e trasduzione

determinano scambio orizzontale (o laterale) di
DNA tra batteri ed acquisizione di nuove
sequenze (differenze genomiche) e di nuove
capacità (differenze fenetiche).

Più che la parentela filogenetica sembra essere

l’ambiente l’elemento determinante nello
scambio di DNA.

Lo scambio di DNA tra batteri di un taxa o di

taxa diversi potrebbe rendere difficile la corretta
assegnazione di specie.
 Nuovo approccio tassonomico
La sequenza del gene 16S rRNA è più utile per assegnare un
isolato ad un genere, mentre il metodo Multi Locus Sequences
Typing (MLST) può aiutarci ad identificare raggruppamenti in
ramificazioni più profonde (evolutivamente più recenti) e quindi
raggruppare diversi isolati nelle principali linee genetiche a
livello di specie.

La MLST utilizza l’analisi di sequenza (circa 500 bp) di diversi

(6-7) geni “housekeeping” che sono meno conservati del 16S
rDNA. I geni vengono concatenati in un’unica sequenza la cui
analisi viene usata per costruire un albero.

Ha il vantaggio che l’analisi di più geni diminuisce gli effetti

della ricombinazione ad un singolo locus.
Approccio tassonomico polifasico

Per definire una specie microbica, i

microbiologi dovrebbero usare un
approccio polifasico, che utilizza ed
integra diversi tipi di dati ed
informazioni, con lo scopo di
raggiungere una classificazione
condivisa delle entità biologiche e che
contiene un minimo di contraddizioni.
Schema approccio tassonomico polifasico

isolato

Analisi genomica Analisi fenetica

o filogenetica

Confronto con specie note

Analisi numerica

Sequenza Posizione
16S rDNA filogenetica Analisi
chemiotassonomica

Ibridazione Identità Fingerprinting

DNA-DNA di specie DNA e rDNA

NON CORRISPONDE CORRISPONDE

classificazione identificazione
Esempio di analisi tassonomica polifasica
La caratterizzazione tassonomica polifasica di isolati inizia con un’analisi degli
acidi grassi cellulari (metodo chemiotassonomico)

e una serie di metodi di tipizzazione basati sull’analisi del DNA (AFLP, utilizzo
in PCR di primer casuali) che sono relativamente facili, veloci ed automatizzabili.
Si ottengono dei raggruppamenti.
Successivamente le analisi 16S rRNA di rappresentanti di questi raggruppamenti
sono comparate con quelle di specie note, determinandone la posizione
filogenetica.
Vengono selezionati microrganismi filogeneticamente vicini che vengono
saggiati con esperimenti di DDH per l’appartenza di specie.