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Metodi indiretti di studio dei recettori

• Le curve dose-effetto • metodi di binding recettoriale

• a livello delle tappe di trasduzione del segnale:

-attivazione o inattivazione di enzimi -attivazione di canali ionici -attivazione o repressione di geni

All’interno di ogni famiglia recettoriale i vari recettori si differenziano per la composizione in aminoacidi e per la lunghezza dei domini extracellulari e intracellulari

Esempi di recettori:

Tipo 1 (recettori ionotropi):

recettore nicotinico recettore GABAA recettore NMDA e non NMDA

Tipo 2: (recettori accoppiati a proteine G) recettori alfa e beta per le catecolamine recettore muscarinico per acetilcolina

Tipo 3: (recettori accoppiati a chinasi) recettori per insulina

recettori per i fattori di crescita tipicamente epidermici e derivati dalle piastrine

Recettori per le citochine

Tipo 4 (recettori intranucleari) recettore per gli ormoni steroidei recettore per l’ormone della tiroide recettore per la vitamina D recettore per i retinoidi recettore per ormoni steroidei

Studi di conduttanza ionica del canale con tecniche di voltage clamp o patch clamp ( 1976) indicano che il flusso di ioni avviene in tempi compatibili con l’esistenza di un poro nella membrana. Sono questi tempi infatti non compatibili con un meccanismo di trasporto ionico che prevede un trasportatore di membrana.

Ruolo delle proteine Gs in diverse patologie

La tossina colerica è prodotta dal vibrione del colera inibendo la GTPasi prolunga la attività della proteina Gs e determina così un accumulo di cAMP a livello delle cellule intestinali. Questi eventi si traducono in secrezione di muco e acqua determinando così la diarrea tipica del colera.

Gli effetti sono limitati all’intestino in quanto il vibrione del colera non è invasivo di altri organi.

Anche un’altra enterotossina prodotta da Escherichia Coli agisce in maniera uguale alla tossina colerica dando la diarrea “del viaggiatore”

Una carenza su base genetica della proteina Gs è alla base di una malattia neuroendocrina: lo pseudoipoparatiroidismo definito tale in quanto non conseguente a iposecrezione dell’ormone ma a resistenza del tessuto all’ormone che agisce su recettori accoppiati a Gs

Nei fibroblasti di tali pazienti la proteina Gs è ridotta del

Un attivatore diretto della adenil ciclasi è la forskolina isolata dalle radici di coleus forskolii.

Gli estratti di questa pianta sono utilizzati nella medicina indiana come rimedio per malattie cardiache, disturbi respiratori, insonnia e convulsioni.

La tossina della pertosse inibisce il legame del GTP alla Gi avendosi così un blocco della inibizione della produzione di cAMP e così indirettamente un aumento di cAMP.

Sintomi che accompagnano la pertosse come la linfocitosi, la sensibilizzazione all’istamina, la ipoglicemia appaiono imputabili a questo effetto

• Gli esteri del forbolo sono derivati sintetici del forbolo che non degradati a livello della membrana come il diacil glicerolo attivano la protein kinasi C.

• Sono sostanze “gli olii do Kroton” che venivano utilizzate prima degli anni 40 come stimolanti cellulari:

usati per massaggi…

• Oggi sappiamo che per le loro azioni di membrana possono essere sostanze cancerogene.

Esempio di un farmaco che esplica la sua azione per interferenza con il ciclo del fosfatidilinositolo:

Uno dei possibili meccanismi del litio come farmaco antimaniacale è la inibizione del ciclo del fosfatidilinositolo.

Secondo la teoria Di Barridge esistono popolazioni neuronali iperattive che utilizzano prevalentemente questo sistema di trasduzione del segnale. La somministrazione cronica di Litio diminuendo la sensibilità cellulare a questo sistema di traduzione diminuisce l’influenza patologica di determinate popolazioni neuronali con conseguente risultato clinico positivo.

Il Litio è selettivo per il sistema nervoso centrale

Perché mentre a livello periferico le cellule ricevono lo inositolo dal plasma oltre a produrlo con una sintesi “de novo”, a livello centrale le cellule non hanno i sistemi di uptake per l’inositolo e sono dipendenti da una sintesi “de novo”. Così mentre in presenza di Litio le cellule periferiche possono compensare, le cellule centrali sono più sensibili.

Anche la tossicità del Litio è infatti ristretta al SNC

Una patologia legata al ciclo del fosfatidilinositolo

Sono alcune complicazioni del diabete consistenti in un rallentamento della conduzione nervosa fino ad arrivare a neuropatie periferiche.

Il glucosio aumentato nel diabete compete con il mio-inositolo (lo stereomero più abbondante dell’inositolo) per la captazione da parte del cellule con conseguente caduta di produzione di diacilglicerolo e proteino kinasi C.

La proteino kinasi C fosforila meno la sodio-potassio ATPasi che normalmente mantiene il potenziale di membrana estrudendo Na++ .Si ha così un incremento di Na++ intracellulare, un rigonfiamento nodale, una distruzione delle giunzioni asso-gliali che si traduce in una neuropatia.

Negli U.S.A. gli inibitori dell’aldolasi:

l’enzima che trasforma il glucosio in sorbitolo si sono dimostrati utili in queste neuropatie periferiche.E’ probabile che sia il sorbitolo a competere per l’uptake del mioinositolo da parte delle cellule nervose periferiche

• Altra G proteina di membrana identificata che è importante per la trasmissione dello stimolo visivo è la transducina, la proteina T, che è contenuta nel segmento esterno dei bastoncelli della retina e che è accoppiata al recettore luminoso definito rodopsina.

• La transducina stimola una fosfodiesterasi che idrolizza il cGMP regolandone così i livelli intracellulari.

Una carenza o un difetto di funzionamento della proteina T è alla base di una malattia: la retinite pigmentosa per cui in questa malattia vi è un accumulo di cGMP a livello della retina.

Il recettore accoppiato alle proteine G può agire in due maniere:

1) attivando proteine G si può avere attivazione o inibizione di II messaggeri intracellulari che inducono:

-

una mobilizzazione del calcio

intracellulare fosforilazioni proteiche

attivazione o inattivazione di canali ionici

2) attivando proteine G inducono senza intervento di II messaggeri una attivazione o inibizione di canali ionici inducendo così un cambiamento della eccitabilità cellulare

• Le proteine G attivatici o inibitrici di canali ionici funzionano in maniera analoga a quella con cui agiscono sulla adenilciclasi o sulla fosfolipasi C:

è cioe la subunità alfa a controllare lo stato di apertura o chiusura del canale

• Esempi di recettori legati a proteine Gi che regolano direttamente canali ionici senza intervento di II messaggeri sono:

• il recettore muscarinico cardiaco:

• aumenta la conduttanza al K+ iperpolarizzando la cellula e inibendo l’attività elettrica cardiaca

• il recettore per gli oppioidi, farmaci analgesici, che con lo stesso meccanismo riducono la eccitabilità neuronale

Studi sul recettore GABAB clonato nel 1997 misero in evidenza che questo recettore ha due sottotipi che sono prodotti di geni diversi e che il recettore era funzionale quando si formava un eterodimero dei due sottotipi.

Oggi sono state evidenziate dimerizzazioni dello stesso tipo recettoriale (omodimeri), di sottotipi recettoriali e anche di recettori diversi (eterodimeri):

dopaminici D2 e adenosinici A2A

dopaminici D5 e GABAA

con funzioni potenziantesi o inibentesi.

Queste interazioni per ora dimostrate con tecniche di biologia molecolare e funzionalmente “in vitro” devono essere comprovate funzionalmente “in vivo”.

Donne incinte affette da ipertensione mostrano a livello delle piastrine una aumentata espressione dei recettori B2 per la bradichinina che formano un eterodimero con i recettori per l’angiotensina (AT1) aumentando l’azione vasocostrittrice dell’angiotensina. Questo è stato il primo esempio di un eterodimero funzionale in vivo.

Recettori accoppiati a chinasi:

• recettori per i fattori di crescita • recettori per le citochine • recettori per l’insulina: l’insulina legandosi a questo recettore fosforila una varietà di enzimi involti nel metabolismo intermedio.

Il recettore tirosino chinasico consta di domini extracellulari e intracellulari molto estesi ognuno di 400- 700 aa.

Il legame dell’agonista con il recettore porta alla dimerizzazione di paia di recettori.

L’associazione di due domini intracellulari porta alla autofosforilazione del recettore su residui di tirosina.

I residui di tirosina autofosforilati funzionano come siti di legame ad alta affinita per proteine intracellulari provviste del cosiddetto dominio SH2 (una sequenza di circa 100 aa). Oggi sono state identificate molte di queste proteine intracellulari che si legano a determinati recettori attivati da quell’agonista conferendo specificità di azione al recettore.

Alcune vie di trasduzione del segnale del recettore tirosino- chinasico sono ben note:

La via Ras/Raf media l’effetto di molti fattori di crescita: ras è una proteina prodotta da un protoncogene. Ras funziona a livello di membrana come una proteina G. Attivata dalla proteina Grb2 che è stata fosforilata dal recettore tirosinochinasico, ras scambia il GDP con il GTP risulta così attivata e in grado di indurre la cosiddetta cascata delle chinasi: una serie di fosforilazioni successive di enzimi: Raf, Mek, MAP chinasi che infine fosforilano fattori di trascrizione che iniziano l’espressione genica: la divisione, la moltiplicazione e la differenziazione cellulare.

Un altro recettore accoppiato a chinasi è quello che attiva la via Jak/Stat media l’effetto di molte citochine: in risposta alla citochina il recettore dimerizza e si lega ad una proteina citosolica Jak che fosforila il recettore e viene fosforilata. In tale forma attiva Jak è in grado di fosforilare una proteina che è un fattore di trascrizione Stat (proteina con dominio SH2). Stat fosforilata dimerizza migra nel nucleo e trasferisce il segnale di trascrizione.

Fra le MAPK 3 sottotipi sono i più noti (p38, JNK, ERK ½) di cui si sa che p38 e JNK sono involte in processi di sofferenza e morte cellulare (apoptosi) ed anche nei fenomeni infiammatori. ERK è involta in meccanismi di differenziazione e sopravvivenza cellulare.

Attivatori di questa vie sono gli esteri del forbolo, gli stessi che attivano la proteino kinasi C e che sono molecole liposolubili.

Come inibitori delle MAPK si conoscono sostanze di natura peptidica che funzionano come falsi sustrati delle MAPK intracellulari formando un legame sul sito catalitico della chinasi, essi non possono essere fosforilati e impediscono l’attività dell’enzima chinasico.

In realtà come tutti i peptidi somministrati in vivo non passano nei tessuti facilmente e sono allo studio inibitori non peptidici liposolubili che ancora non hanno però una buona specificità d’azione.

Sul recettore tirosino kinasico o recettore accoppiato a kinasi funziona il fattore natriurenico, un ormone, prodotto delle cellule atriali del cuore, che funziona su recettori NPR A o NPR B che contengono nella struttura catalitica la guanilato ciclasi che determina un aumento di cGMP.

Il fattore natriurenico ha effetti:

vasodilatanti e di riduzione della pressione

aumenta la capacità di filtrazione glomerulare renale (aumenta la dilatazione delle arteriole afferenti al glomerulo e diminuisce la dilatazione delle arteriole efferenti).

E’ in corso di valutazione clinica in pazienti con insufficienza renale.

Gli oncogeni possono conferire malignità alle cellule disorganizzando le normali vie di controllo della crescita cellulare.

1) L’oncogene sis che è attivato da virus del sarcoma di scimmia codifica per proteine simili al PDGF

2) L’oncogene erb b codifica per una modificazione del numero e della struttura del recettore tirosino-chinasico (viene a mancare la parte di recettore che lega lo EGF)

Lo EGF induce la normale crescita dei fibroblasti che sono involti nei normali processi di riparazione.

Alcune forme di tumori umani della testa e del collo mostrano tali anomalie del recettore per lo EGF.

3) L’oncogene c ras appartiene alla famiglia degli oncogeni ras che sono associati con il cancro del polmone, della prostata e del colon. Codifica per una proteina che potenzia l’attività della proteina G che induce l’attivazione delle fosfodiesterasi in particolare della fosfolipasi C che rompe il fosfatidilinositolo nei suoi due prodotti : Il DG e lo IP3.

4) a) Gli oncogeni myc e fos che codificano per proteine che ritrovate all’interno del nucleo delle cellule mitotiche disorganizzano i normali processi di trascrizione del DNA in risposta ai fattori di crescita e in tale maniera inducono una abnorme suddivisione cellulare

c-myc è associato al linfoma di Burkitt n-myc con il carcinoma del polmone e il neuroblastoma

b) Oncogeni possono codificare per proteine che a loro volta inducono la soppressione di geni che inibiscono la crescita cellulare

• Prodotti di geni che inibiscono la crescita tumorale sono:

• le citochine:

• gli interferoni • il TGF beta

sono peptidi che inibiscono la crescita tumorale, oggi si pensa del cancro del polmone.

La non produzione quindi di tali peptidi comporta l’insorgenza del tumore

Terapia genica del cancro?

• Uno dei geni involti nella soppressione del tumore è il P53 che appare alterato in più del 60% dei tumori umani

• Si studia la possibilità di reintrodurlo con un retrovirus

Possibilità terapeutiche nel cancro

1) utilizzo di anticorpi monoclonali contro determinati fattori di crescita o recettori

2) utilizzo di fattori di crescita come ad esempio quello dei granulociti o macrofagi che a contatto con cellule leucemiche ne producono la differenziazione e così sopprimono lo sviluppo del cancro

3) di sostanze come i retinoidi, derivati della vitamina A, che agiscono su recettori intracellulari e si sono rivelati in grado di bloccare alcune condizioni premaligne. I retinoidi sperimentalmente inibiscono gli esteri del forbolo che sono sostanze promotrici del tumore:sostanze in assenza delle quali un agente cancerogeno non è in grado di indurre il cancro.

Recettori intracellulari

Agiscono come agonisti:

gli ormoni steroidei ormoni tiroidei Vitamina D Acido retinoico •

E’ noto fino dalla fine dell’800 dal lavoro di Huxley che estratti della tiroide potevano controllare la metamorfosi degli

anfibi , ma non fu’ che nel 1915

che

Kendall cristallizzò la molecola degli ormoni steroidei e degli ormoni della tiroide e ne identificò la struttura chimica.

Nel 1980 l’utilizzo di analoghi sintetici marcati con alta attività specifica ha permesso l’isolamento, la purificazione del recettore

Ormoni steroidei steroidi derivati dalla corteccia del surrene:

controllano il metabolismo del glicogeno e dei minerali

-mediano la risposta allo stress: hanno effetti sul sistema immunitario e nervoso

-influenzano la crescita e la differenziazione cellulare ormoni sessuali (progesterone, estrogeni,testosterone) influenzano la differenziazione del sistema riproduttivo controllano le caratteristiche sessuali secondarie influiscono sulla differenziazione del cervello in senso femminile o maschile

Ormoni tiroidei

Una produzione anomala di questi ormoni implica una quantità di funzioni alterate fra cui i processi di crescita e differenziazione cellulare

L’acido Retinoico è un importante regolatore dello sviluppo embrionale in particolare nello sviluppo degli arti e nella organogenesi

Vitamina D3 gioca un ruolo importante nel metabolismo del Ca++ e nello sviluppo dell’osso

Agendo su recettori intracellulari attivano l’espressione di 50-100 geni per cellula che codificano per proteine implicate nel normale funzionamento cellulare Fra il legame dell’agonista al recettore e la produzione di RNAm possono intercorrere solo pochi minuti ma per vedere l’effetto fisiologico possono occorrere ore o giorni Il recettore è formato da 400-1000 aa.

Ne sono stati a tutt’oggi clonati molti e molti sono ancora “orfani”: non è stato identificato il ligande che li attiva

.

La porzione che lega il DNA è la porzione più conservata e quella che conferisce la specificità al recettore cioè induce determinati geni e non altri in risposta ad un determinato ormone.

Normalmente il “binding domain” del recettore inibisce la porzione del recettore che lega il DNA. Il legame dell’ormone al “binding domain” causa un cambiamento conformazionale tale per cui il recettore dimerizza e “sblocca” la porzione che lega il DNA in modo che permette l’avviluppamento al DNA.

La porzione di recettore che lega il DNA è costituita da circa 60 aa ed è quella che specificamente controlla la trascrizione dei geni promoters o Hormone Responsive Elements (HRE) come dimostrato sperimentalmente con l’uso di recettori chimera.

Gli HRE sono localizzati circa 200 coppie di basi a monte del gene che viene regolato.

• Diversi recettori intracellulari simili ai nativi ma prodotti di oncogeni, non hanno bisogno del ligande per essere attivati

• Tumori della mammella o della prostata hanno alla base mutazioni del recettore agli estrogeni

• Mutazioni del recettore o del numero dei recettori agli estrogeni possono essere alla base di disordini psichiatrici quali l’ansia, la depressione, la psicosi

È noto fin dall’800 che modificazioni degli ormoni sessuali e tiroidei possono essere alla base di processi neurofisiologici come l’insonnia, l’irritabilità, la sonnolenza e forse anche di disturbi psichici.

• La menopausa è spesso associata a depressione.

Agiscono su recettori intracellulari:

Sostanze carcinogenetiche come le Diossine e idrocarburi policiclici induttori enzimatici di tipo misto che aumentano la trascrizione del citocromo P450 e P448

Il clofibrato utilizzato per ridurre il colesterolo plasmatico.

Farmaci antinfiammatori steroidei come i glucorticoidi hanno recettori intranucleari tramite cui inibiscono la trascrizione del gene delle prostaglandino sintetasi (COX- 2) che portano alla produzione di prostaglandine che sono mediatori dell’infiammazione