Documenti di Didattica
Documenti di Professioni
Documenti di Cultura
PROCEDURA:
CACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACA
GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT
Polimorfismi SHORT TANDEM REPEATS (STR): sono collocati in locus altamente polimorfici: esistono tanti
alleli per ogni singolo locus
2) Sequenza del clone/i positivo/i utilizzando come primer di innesco (CA)n ed il complementare (TG)n.
in questo modo si determina la sequenza delle zone che fiancheggiano l’STR
Costituisce polimorfismo
Clone 6LL3
BLWF1
SEC-1
OME
PROBLEMI CON LA CLONAZIONE SOMATICA?
1 Dolly
2 morti
bovino 440 6 (1.4%) quasi subito
1) LA RESA E’ MOLTO BASSA
11 morti
pecora 417 14 (3.4%)
2) I CLONI CHE ARRIVANO A TERMINE entro 6 mesi
SPESSO SOFFRONO DI DIFETTI GIA’ maiale 977 5 (0.5%) -
ALLA NASCITA
capra 285 3 (1.1%) -
3) I CLONI CHE SOPRAVVIVONO FINO ALL’ETA’ ADULTA SEMBRANO INVECCHIARE PIU’
RAPIDAMENTE DEL NORMALE
-Altre modificazioni del DNA correlate all’invecchiamento (es: metilazione del DNA e/o perdita di proteine associate
al DNA
-Mutazioni accumulate nella vita di un animale possono essere silenti nell’individuo adulto, ma causare uno scorretto
sviluppo embrionale
4) I CLONI NON SONO COPIE ESATTE
Rainbow Copycat
-I geni nucleari umani si attivano più precocemente (4 cellule) che in bovini e ovini (8 cellule): tempo
insufficiente per la riprogrammazione del nucleo somatico?
-Nelle scimmie la rimozione del nucleo rimuove anche componenti importanti del centrosoma. Le mitosi possono
essere non corrette a causa di difetti del fuso che portano ad aneuploidia
http://www.clonaid.com/
Evidence of a Pluripotent Human Embryonic Stem Cell Line Derived from a Cloned Blastocyst
Per poter effettuare diagnosi e prognosi di patologie ereditarie è necessario conoscere
la sequenza del gene responsabile
INGREDIENTI:
Screening di una Library a inserti genomici grandi per la ricerca del clone
positivo per i marcatori polimorfici
BANCHE DATI
Una volta individuato il possibile gene, bisogna determinare se esso è effettivamente mutato nei
soggetti affetti:
sequenziamento
ovvero
FASE I: trattamento di pochi individui umani sani per valutare gli effetti generali
della terapia (sicurezza)
FASI
CLINICHE FASE II: la terapia viene provata in un campione leggermente più ampio di individui affetti
dalla patologia, per verificarne la sicurezza e l’efficacia
FASE III: la terapia viene testata su un ampio campione di soggetti affetti, confrontando
i benefici con quelli di terapie convenzionalmente usate per il tipo di patologia
APPROVAZIONE
TERAPIA GENICA
EX VIVO IN VIVO
Il trasferimento genico viene Il trasferimento genico viene
effettuato al di fuori del effettuato direttamente
paziente nel paziente
Per il trasferimento genico
si usano vettori virali ad
ampio spettro, di tipo NON
litico (RETROVIRUS DIFETTIVI)
Gene funzionante
Le proteine dell’envelope
riconoscono specifiche
proteine di superficie
I VETTORI RETROVIRALI
-Non è patogeno
VETTORI DERIVATI DAL VIRUS DELL’HERPES SYMPLEX tipo1: infettano solo cellule neuronali quiescenti
SISTEMI ALTERNATIVI ALLA TERAPIA GENICA MEDIANTE RIPRISTINO GENICO
IL GANCICLOVIR E LA TK DELL’HSV
EFFETTO BYSTANDER
+
fagocitosi
RIVEDIAMO IL MECCANISMO DI
SPLICING
LA TERAPIA CORRETTIVA PER MEZZO DI OLIGONUCLEOTIDI AS CHE INTERVENGONO SULLO
SPLICING DEL pre-RNAm
A causa di mutazioni puntiformi possono comparire siti di splicing criptici all’interno di un introne: Si possono avere
mutazioni per scivolamento, con inserimento di aminoacidi sbagliati, o non senso, con comparsa di codoni non stop
Il gene della β -globina è piccolo, ma deve essere obbligatoriamente regolato dalle sequenze
regolatrici endogene, poiché la proteina deve essere prodotta in maniera stechiometricamente
corretta nei confronti delle catene dell’ α-globina. Tutta la cassetta è troppo grande per
essere contenuta in un vettore di ripristino.
stop
LO SKIPPING (salto) DELL’ESONE NELLA CURA DELLA DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE
2,25 Mbp
7 promotori diversi
RNAm 17kDa
Molte mutazioni consistono in piccole delezioni/inserzioni negli esoni, che portano ad uno spostamento
nella griglia di lettura con comparsa di prematuri codoni di stop
Nuovo splicing
c mdx
Mdx
+ as Mdx
2gg + as
14 gg