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LA CLONAZIONE ANIMALE

Dr. Wilmut & Dolly

Si effettua per TRASFERIMENTO NUCLEARE

PROCEDURA:

1) ENUCLEAZIONE di un oocita maturo non fertilizzato in fase G0 o metafase II


per aspirazione del nucleo (CITOPLASTO)

2) TRASFERIMENTO NUCLEARE: si effettua per MICROINIEZIONE del nucleo o per


ELETTROFUSIONE dell’intera cellula somatica con il citoplasto

Cellula ES (blastocisti) indifferenziata


Nucleo donatore

a) DEPROGRAMMAZIONE: incubazione in un terreno povero di nutrienti:


Cellula somatica di adulto la cellula spegne l’espressione dei geni
b) RIPROGRAMMAZIONE: i fattori citosolici del citoplasto riprogrammano
i geni del nucleo somatico per la totipotenza
3) Un impulso elettrico dà lo stimolo per iniziare la divisione

4) Verifica in coltura della vitalità degli embrioni

5) Impianto in un utero ricevente


from Time Magazine, March 10, 1997
Dolly con la madre in affitto

a) Cellule embrionali (SEC1) (da disco embrionale di un embrione di 9 gg.)

b) Fibroblasti fetali (BLWF1) (da un feto di 26 gg))


c) Cellule mammarie (OME)

IN CHE MODO SI E’ VERIFICATO CHE DOLLY FOSSE VERAMENTE UN CLONE?


SI E’ UTILIZZATO Il FINGERPRINTING DEL DNA ATTRAVERSO L’ANALISI DI MARCATORI MICROSATELLITARI

CACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACA
GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT

Polimorfismi SHORT TANDEM REPEATS (STR): sono collocati in locus altamente polimorfici: esistono tanti
alleli per ogni singolo locus

Un profilo polimorfico permette di identificare in maniera univoca un individuo

COME SI INDIVIDUA UN POLIMORFISMO STR?

1) ≈1000bp) con una sonda (CA)n


Screening di una library genomica a inserti piccoli (≈

2) Sequenza del clone/i positivo/i utilizzando come primer di innesco (CA)n ed il complementare (TG)n.
in questo modo si determina la sequenza delle zone che fiancheggiano l’STR

3) Si verifica che le zone fiancheggiatrici all’STR siano uniche


nel genoma tramite FISH (Fluorescent In Situ Hybridization)

a) Arresto delle cellule in metafase


b) Fissazione delle cellule su vetrino
c) Denaturazione del DNA
d) Ibridazione con la sonda fluorescente
4) Mediante PCR con primers che ibridano le regioni fiancheggianti
l’STR si analizzano gli amplificati ottenuti da individui diversi

Non costituisce polimorfismo

Costituisce polimorfismo
Clone 6LL3

BLWF1
SEC-1

OME
PROBLEMI CON LA CLONAZIONE SOMATICA?

-277 cellule enucleate


-248 cellule morte dopo il trasferimento
nucleare
-16 morte prima dell’impianto in utero
-13 impiantate

1 Dolly

Specie N°° di oociti N°° di nati vivi Note


Yanagimachi, R. 2002. "Cloning: experience from the mouse usati
and other animals." Molecular and Cellular Endocrinology.
21 March, 187. topo 2468 31 (1.3%) -

2 morti
bovino 440 6 (1.4%) quasi subito
1) LA RESA E’ MOLTO BASSA
11 morti
pecora 417 14 (3.4%)
2) I CLONI CHE ARRIVANO A TERMINE entro 6 mesi
SPESSO SOFFRONO DI DIFETTI GIA’ maiale 977 5 (0.5%) -
ALLA NASCITA
capra 285 3 (1.1%) -
3) I CLONI CHE SOPRAVVIVONO FINO ALL’ETA’ ADULTA SEMBRANO INVECCHIARE PIU’
RAPIDAMENTE DEL NORMALE

-Accorciamento dei telomeri

-Altre modificazioni del DNA correlate all’invecchiamento (es: metilazione del DNA e/o perdita di proteine associate
al DNA

-Mutazioni accumulate nella vita di un animale possono essere silenti nell’individuo adulto, ma causare uno scorretto
sviluppo embrionale
4) I CLONI NON SONO COPIE ESATTE

Rainbow Copycat

-DNA mitocondriale diverso

-Fenomeni epigenetici (es: inattivazione dell’X)

-Fattori ambientali e sociali


E LA CLONAZIONE UMANA?

-I geni nucleari umani si attivano più precocemente (4 cellule) che in bovini e ovini (8 cellule): tempo
insufficiente per la riprogrammazione del nucleo somatico?

-Nelle scimmie la rimozione del nucleo rimuove anche componenti importanti del centrosoma. Le mitosi possono
essere non corrette a causa di difetti del fuso che portano ad aneuploidia

http://www.clonaid.com/

Clonaid è stata fondata dai membri di una setta religiosa chiamata


“the Raelians”.
Nel 2002 Clonaid dichiarò di avere clonato Eva, da una cellula di cute
di sua “madre”. Essi si sono tuttavia rifiutati di effettuare test, sia
per provare la natura di clone di EVa, sia la sua esistenza.

Originally published in Science Express on 12 February 2004


Science 12 March 2004:
Vol. 303. no. 5664, pp. 1669 - 1674
DOI: 10.1126/science.1094515
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Dr Moon
Reports
This article has been retracted

Evidence of a Pluripotent Human Embryonic Stem Cell Line Derived from a Cloned Blastocyst
Per poter effettuare diagnosi e prognosi di patologie ereditarie è necessario conoscere
la sequenza del gene responsabile

L’IDENTIFICAZIONE DI GENI RESPONSABILI DI MALATTIE GENETICHE

SI CONOSCONO LE BASI METABOLICHE NON SI CONOSCE IL DIFETTO


(BIOCHIMICHE) DELLA MALATTIA BIOCHIMICO DELLA MALATTIA

Screening di una library con:


CLONAGGIO POSIZIONALE
a) Oligonucleotidi degenerati
b) EST
c) Sonde ottenute da specie
affini
IL CLONAGGIO POSIZIONALE

Permette di arrivare ad identificare un gene responsabile di


un fenotipo mutato, partendo dalla attribuzione del gene ad
una regione ristretta di un cromosoma

INGREDIENTI:

1) PEDIGREE di famiglie affette dalla patologia e relativo materiale


genetico

2) MARCATORI POLIMORFICI: polimorfismi la cui posizione all’interno


del genoma (locus) è nota

3) GENOTECHE GENOMICHE AD INSERTO GRANDE


ATTRIBUZIONE DELLA POSIZIONE DEL GENE RESPONSABILE DELLA PATOLOGIA
AD UNA REGIONE PARTICOLARE DEL DNA

Gene recessivo associato al cromosoma X


Si analizza la associazione tra soggetti affetti e alleli
di marcatori polimorfici

Determinazione del cromosoma su cui è localizzato il gene

Avvicinamento al gene utilizzando marcatori specifici per il


cromosoma individuato: maggiore è l’associazione (minori
crossing over), minore è la distanza

Delimitazione di una zona compresa tra due marcatori


CORRELAZIONE DELLA MAPPA FISICA CON QUELLA GENETICA PER LOCALIZZARE LA POSIZIONE
APPROSSIMATIVA DEL GENE DI INTERESSE.

Screening di una Library a inserti genomici grandi per la ricerca del clone
positivo per i marcatori polimorfici

Determinazione della sequenza

RICERCA DELLE SEQUENZE ESONICHE


La presenza di isole CpG
può indicare la prossimità
di geni trascritti

Taglio con enzimi che


riconoscono siti ricchi
in C e G

oppure si isola direttamente il gene da una library a cDNA mediante


la SELEZIONE DEGLI IBRIDI
LA SELEZIONE DEGLI IBRIDI

clone genomico selezionato grazie ai


marcatori

Scelta da un tessuto che si pensa sia


arricchito per l’espressione del gene
Cercato. cDNA = solo esoni

Primers che fiancheggiano l’inserto di cDNA


CLONAZIONE POSIZIONALE DEI GENI CANDIDATI

BANCHE DATI
Una volta individuato il possibile gene, bisogna determinare se esso è effettivamente mutato nei
soggetti affetti:

La SSCA (Analisi Conformazionale del Singolo Filamento)

La differenza anche di una singola base può


causare, nel DNA a singolo filamento, una
diversa configurazione tridimensionale, che
comporta una diversa mobilità elettroforetica

sequenziamento

STUDIO DELLA FUNZIONE DELLA PROTEINA


LA TERAPIA GENICA

ovvero

il trasferimento genico come sistema per la correzione di


difetti genetici causa di malattie

-AL MOMENTO E’ APPLICABILE ALLE SOLE CELLULE SOMATICHE

-MALATTIE GENETICHE IDEALI SONO QUELLE CARATTERIZZATE DA UNA O PIU’


bMUTAZIONI A CARICO DI UN SOLO GENE

-NECESSITA’ DI ELABORARE UNA STRATEGIA PER OGNI DIVERSA TERAPIA GENICA


LE FASI DELLA SPERIMENTAZIONE

FASE PRECLINICA: prevede la sperimentazione in vitro e su animali

FASE I: trattamento di pochi individui umani sani per valutare gli effetti generali
della terapia (sicurezza)
FASI
CLINICHE FASE II: la terapia viene provata in un campione leggermente più ampio di individui affetti
dalla patologia, per verificarne la sicurezza e l’efficacia

FASE III: la terapia viene testata su un ampio campione di soggetti affetti, confrontando
i benefici con quelli di terapie convenzionalmente usate per il tipo di patologia

APPROVAZIONE

TERAPIA GENICA

EX VIVO IN VIVO
Il trasferimento genico viene Il trasferimento genico viene
effettuato al di fuori del effettuato direttamente
paziente nel paziente
Per il trasferimento genico
si usano vettori virali ad
ampio spettro, di tipo NON
litico (RETROVIRUS DIFETTIVI)

Cellule ideali da trattare sono quelle SCID


Ad ampio potenziale proliferativo (es: TALASSEMIA
cellule staminali, cellule di midollo osseo ANEMIA FALCIFORME
VETTORI VIRALI

TERAPIA GENICA TRASFERIMENTO GENICO IN


COLTURE CELLULARI
Non devono replicarsi nell’ospite
quando

-non si riescono ad ottenere trasfettati


stabili (invecchiamento cellulare)

-l’efficienza di trasfezione in transiente


è troppo bassa
I RETROVIRUS nella terapia ex vivo

Non lisano le cellule

Hanno largo spettro di


specificità di cellula ospite

Per l’usi in terapia, si devono usare retrovirus DIFETTIVI


Occorrono delle STRATEGIE DI SICUREZZA per evitare la propagazione incontrollata del virus.
Si devono costruire dei RETROVIRUS DIFETTIVI, cioè non in grado di costruire strutture di
incapsulamento

Ψ+ :sequenza segnale per il packaging


nel plasmide
pol: geni per enzimi (I, RT)
env: gene per la proteina dell’involucro

-clonazione del DNA retrovirale in plasmide


-eliminazione dei geni pol ed env
-mantenimento della regione di gag che contiene Ψ+

Gene funzionante

CELLULE IMPACCHETTATRICI: servono per fornire al retrovirus ricombinante le proteine


strutturali

in un sito del genoma hanno integrato Integrati nel


DNA delle cell.
LTR5’-gag-pol-LTR3’ ∆Ψ+ impacchettatrici

in un altro sito LTR5’-env-LTR3’


COSTRUZIONE DI UN VETTORE RETROVIRALE RICOMBINANTE ED INFEZIONE DI CELLULE
IN COLTURA
TERAPIA GENICA EX VIVO PER IL TRATTAMENTO DELL’EMOFILIA
TERAPIA GENICA IN VIVO

Introduzione diretta di un gene correttivo nelle cellule di un tessuto


specifico di un paziente

Le proteine dell’envelope
riconoscono specifiche
proteine di superficie
I VETTORI RETROVIRALI

SONO POCO SPECIFICI INFETTANO SOLO CELLULE IN ALTA EFFICIENZA DI INFEZIONE


PROLIFERAZIONE

UTILIZZO DI PROMOTORI TESSUTO-SPECIFICI


PER IL GENE BERSAGLIO
PSEUDOTIPIZZAZIONE

Sostituzione dell’env con quello


di un virus più selettivo Creazione di env con caratteriestiche diverse e
selezione dei virus con le caratteristiche più
vantaggiose
VETTORI DERIVATI DALL’ADENOVIRUS (a DNA)

-Infetta molto bene le cellule della mucosa respiratoria

-Infetta anche cellule quiescenti (neuroni, cuore)

-Non si integra nel genoma (espressione limitata)

Trattamento della fibrosi cistica


con il ripristino del gene CFTR
VETTORI DERIVATI DAL VIRUS ASSOCIATO ALL’ADENOVIRUS (AAV)

-Non è patogeno

-Si integra in un sito specifico del cromosoma 19

-Per riprodursi necessita di un virus helper (es: adenovirus)

-E’ poco capiente

VETTORI DERIVATI DAL VIRUS DELL’HERPES SYMPLEX tipo1: infettano solo cellule neuronali quiescenti
SISTEMI ALTERNATIVI ALLA TERAPIA GENICA MEDIANTE RIPRISTINO GENICO

IL GANCICLOVIR E LA TK DELL’HSV

EFFETTO BYSTANDER

+
fagocitosi
RIVEDIAMO IL MECCANISMO DI
SPLICING
LA TERAPIA CORRETTIVA PER MEZZO DI OLIGONUCLEOTIDI AS CHE INTERVENGONO SULLO
SPLICING DEL pre-RNAm

A causa di mutazioni puntiformi possono comparire siti di splicing criptici all’interno di un introne: Si possono avere
mutazioni per scivolamento, con inserimento di aminoacidi sbagliati, o non senso, con comparsa di codoni non stop

Es: Il caso della β-talassemia

Il gene della β -globina è piccolo, ma deve essere obbligatoriamente regolato dalle sequenze
regolatrici endogene, poiché la proteina deve essere prodotta in maniera stechiometricamente
corretta nei confronti delle catene dell’ α-globina. Tutta la cassetta è troppo grande per
essere contenuta in un vettore di ripristino.

stop
LO SKIPPING (salto) DELL’ESONE NELLA CURA DELLA DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE

DISTROFINA: 427kDa codificata dal gene dys (Xp21.1)

2,25 Mbp
7 promotori diversi

4 muscolo 3 altri tessuti 79 esoni 99,4% introni


(distrofina HMW) (isoforme LMW)

RNAm 17kDa

Molte mutazioni consistono in piccole delezioni/inserzioni negli esoni, che portano ad uno spostamento
nella griglia di lettura con comparsa di prematuri codoni di stop

MANCANZA DEL DOMINIO Ct

Distrofia di becker: distrofina con delezione interna, ma con dominio


Ct: forma molto meno grave
TOPO mdx

Ha una mutazione “non senso” nell’esone 23

Nuovo splicing

c mdx

Mdx
+ as Mdx
2gg + as
14 gg