LEZIONE 4/5

Ruoli riboflavina come cofattore:

 Enzimi che utilizzano i cofattori riboflavinici:

 NADH deidrogenasi,
 succinato deidrogenasi
 D e L-aminoacido ossidasi
 Piridossina-5-fosfato ossidasi
 Gluiatione riduttasi
 Xantina ossidasi

In alcuni enzimi, il cofattore è legato covalentemente a un amminoacido (deidrogenasi), si crea un sistema

enzima-cofattore. Spesso i cofattori riboflavinici lavorano in combinazione con differenti accettori e
donatori di elettroni come NAD+ e NADP+ o con chinoni e citocromi. Scambiano elettroni con un substrato
e poi riversano gli elettroni attraverso altre reazioni che possono trasportarli al NAD, oppure all’interno di
reazioni con il citocromo. Il FAD svolge un ruolo intermedio di trasportatore di elettroni tra il NAD+ e il
NADH e il citocromo e sistemi di chinoni nella catena di trasporto degli elettroni.

Meccanismo funzionamento NADH deidrogenasi

Sono schemi semplificati che ci fanno intravedere il meccanismo dal punto di vista delle convenzioni della
chimica organica ma queste reazioni avvengono all’interno del sito attivo di un enzima, quindi condizioni
fisiologiche, temperatura, pH attorno alla neutralità, ambiente acquoso. Condizioni che non possono mai
convertirsi in condizioni estreme come nel caso della chimica organica.

C’è un trasferimento di uno ione idruro

dall’idrogeno pro R del nucleo
nicotinammidico del NADH che viene
trasferito sull’azoto che è parte del sistema
funzionale attivo degli enzimi flavinici. Un
nucleo protonico con una coppia di
elettroni (ione idruro) si lega all’atomo di
azoto, la coppia di elettroni del doppio
legame NC si sposta al legame CC e la
coppia di elettroni dell’altro legame NC
lega un protone di un gruppo acido. Questo
non significa che nel mezzo acquoso ci sia
un acido libero HA per quanto possa essere
debole, significa che c’è un gruppo
funzionale dell’enzima, di qualche
amminoacido che è presente all’interno del sito attivo dell’enzima che è in grado di cedere un protone. I
residui amminoacidici possono essere quelli di amminoacidi acidi (acido aspartico o glutammico) oppure
un’istidina che può comportarsi sia da acido che da base. Complessivamente sul nucleo flavinico si vanno a
legare due protoni e due elettroni, quindi sostanzialmente due atomi di idrogeno.

Si forma il NAD+ mentre il FAD ha accettato due atomi di idrogeno (idruro e protone) e quindi diventa
FADH2, la forma ridotta. IL FADH2 generato può ridurre un substrato organico in un’altra reazione che può
essere in qualche modo collegata a questa, verrà riossidato a FAD e potrà riprendere questo ciclo. C’è un
collegamento stretto e funzionale tra gli enzimi della coppia NADH e FAD.
Succinato deidrogenasi

La succinato deidrogenasi è un enzima che catalizza la

reazione di ossidazione del succinato, il succinato
viene ossidato a fumarato e il FAD passa a FADH2.
Possiamo immaginare un meccanismo abbastanza
simile a quello visto precedentemente nel caso del
NAD deidrogenasi. Dobbiamo immaginare che un
idruro può essere trasferito al FAD e da quest’altra
parte passa la coppia di elettroni mentre il secondo
idrogeno viene sottratto sotto forma di protone da una
base del sito attivo dell’enzima. Questo processo è
legato ad altre trasformazioni complesse, il succinato
viene convertito in fumarato, il FAD acquisisce i due
elettroni e i due protoni diventando FADH2 che può
andare ad ossidare altri sistemi, ad esempio qui si
vede una trasformazione svolta all’interno del
citocromo con trasferimento di elettroni. Il FADH2 passa di nuovo a FAD e può continuare altri processi di
trasformazione. I coenzimi una volta che vengono coinvolti in una reazione e quindi trasformati in qualche
modo devono essere rigenerati altrimenti si andrebbe incontro ad una situazione di carenza e di insufficienza
di capacità di trasformazione enzimatica. Ci sono una serie di funzioni fisiologiche che consentono la
rigenerazione e quindi l’omeostasi di questi sistemi enzimi-coenzimi.

Amminoacido ossidasi

L’amminoacido viene ossidato a

chetoacido, la funzione azotata
dell’amminoacido viene convertita in una
porzione carbonilica. Una grande quantità,
quasi tutti gli amminoacidi salvo poche
eccezioni (serina, treonina e alcuni
amminoacidi acidi e dicarbossilici) possono
essere deamminati tramite le amminoacido
ossidasi. Esistono anche altri processi enzimatici che convertono gli amminoacidi a chetoacidi che sono
quelli in cui intervengono le transaminasi. Abbiamo un processo ossidativo, il FMN viene convertito in
FMNH2, questo deve essere seguito da un processo idrolitico che scinde il legame C-N, libera ammoniaca e
forma il carbonile. Come intermedio si forma un legame imminico C=NH, le immine sono idrolizzate
facilmente, vanno in equilibrio con la forma chetonica e l’equilibrio è spostato verso la forma carbonilica.

Xantina ossidasi

È una flavoproteina che contiene anche ioni

ferro e molibdeno, indispensabili al processo
catalitico. Questo processo coinvolge la
trasformazione della ipoxantina in acido
urico. C’è un primo passaggio ossidativo in
cui l’ipoxantina viene ossidata a xantina,
viene ossidrilata la posizione tra i due atomi
di azoto e successivamente viene ossidrilata anche la posizione fra i due atomi di azoto sull’anello
pentaciclico con formazione dell’acido urico. È un processo degradativo che riguarda le basi azotate che
porta alla formazione dell’acido urico e alla successiva escrezione con le urine di questo composto. È una
molecola che può dare anche delle problematiche di natura sanitaria perché può dar luogo a formazione di
cristalli che se si sviluppano all’interno di determinati tessuti danno luogo alla glotta.

Acil-CoA desaturasi
 Questo è un passaggio molto
importante, intermedio, che ha
luogo nella biogenesi degli acidi
grassi insaturi e polinsaturi. È
possibile che un acido grasso
saturo, privo di doppi legami e catene, venga convertito in un acido grasso insaturo. Gli acidi grassi
polinsaturi sono molto importanti fisiologicamente, aumentano la fluidità delle membrane biologiche e
hanno degli effetti benefici nella riduzione della biogenesi del colesterolo, quindi una dieta in cui ci sia un
buon equilibrio di acidi grassi insaturi è più salutare. In questo processo è possibile il trasferimento di due
atomi di idrogeno dal FAD al FADH2 con formazione di un doppio legame. Si può ipotizzare un
meccanismo abbastanza simile a quello della succinato deidrogenasi, si tratta della rimozione di due atomi di
idrogeno e del trasferimento di due protoni. Sono coinvolti anche altri cofattori, ci sono dei passaggi
intermedi.

Meccanismo di una amminoacido ossidasi

Esistono sistemi indiretti con cui queste reazioni sono state analizzate. Questi meccanismi molecolari sono
sempre delle ipotesi teoriche supportate da evidenze sperimentali consolidate, valide, ben riconosciute come
tali ma vanno sempre presi per quello che sono, cioè delle ipotesi meccanicistiche che possono nel tempo
anche subire degli aggiustamenti più o meno lievi in funzione di eventuali successive evidenze sperimentali
che possano dare indicazioni su determinati aspetti del processo.
È sempre coinvolta la regione
attiva del coenzima. Anche qui
dobbiamo tener presente che
siamo all’interno del sito attivo
dell’enzima, una funzione basica
dell’enzima (istidina, lisina)
preleva e facilita il distacco del
protone, la coppia di elettroni va
sul carbonio per generare la
forma enolata. Il meccanismo dà
una versione semplificata della
realtà perché è molto poco
probabile che si generi un vero e
proprio ione enolato
nell’ambiente cellulare, è più
probabile che sia tutto un poco concertato. La coppia di protoni attacca l’azoto del FAD e dall’altro lato un
protone di un amminoacido acido viene attaccato dall’altro atomo di azoto. Abbiamo la formazione di un
intermedio in cui adesso il carbonio α dell’amminoacido i è andato a legare con un legame covalente al
coenzima. Il doppio legame deriva dalla coppia di elettroni che apparteneva all’amminoacido e che adesso è
condivisa con l’azoto del coenzima mentre dall’altro lato è entrato H+. questa coppia di elettroni va a
formare un doppio legame con il carbonio e un protone rilasciato da un gruppo acido dell’enzima
(presumibilmente quello formato nella prima fase) protona l’atomo di azoto, la coppia di elettroni si
stabilizza sul sistema flavinico e si distacca l’imminoacido che probabilmente è in una forma protonata. In
sostanza, si è formato il FADH2 ridotto, abbiamo avuto il trasferimento di una coppia di elettroni e di un
protone. Mentre l’amminoacido si è impoverito di due atomi di idrogeno e ha perso uno a livello dell’azoto
(anche se non appare come perso perché è una funzione protonata) e uno a livello dell’atomo di idrogeno.
Quello che accade allo ione imminio è quello di essere idrolizzato. È un processo abbastanza banale, questo
subisce spontaneamente idrolisi nell’ambiente acquoso, si genera il chetoacido e viene liberata ammoniaca
che non può liberarsi come tale nella cellula, è un processo di distacco dell’ammoniaca che poi viene captata
in altri processi enzimatici per essere escreta dall’organismo.

Meccanismo di ossidazione del diidrolipoato ad opera di diidrolipoil deidrogenasi e FAD

 L’acido diidrolipoilico partecipa ad una serie
di reazioni di ossidoriduzione attraverso la
trasformazione da diidrolipoato a lipoato e
viceversa. Il diidrolipoato può ridurre un
substrato e trasformarsi in lipoato ma ancora
può accettare un protone ed ossidare il
substrato. L’equilibrio viene mantenuto
attraverso l’enzima, la deidrolipoil
deidrogenasi che utilizza il FAD come
cofattore. Il diidrolipoato trasferisce due
atomi di idrogeno al FAD, si forma lipoato e
FADH2.

Questa volta il meccanismo è un po’ diverso,

coinvolge l’atomo di carbonio adiacente all’atomo di azoto. La forma anionica del diidrolipoato da cui è
stato rimosso l’idrogeno sullo zolfo (le funzioni tioliche sono più acide delle funzioni alcoliche, le funzioni
basiche possono facilmente rimuovere idrogeni) che fa da nucleofilo andando ad attaccare l’atomo di
carbonio, agevolato dalla protonazione dell’azoto da parte di un gruppo acido dell’enzima. Lo zolfo di lega
covalentemente all’atomo di carbonio, si ha un trasferimento di coppie elettroniche perché i processi di
riduzione devono necessariamente coinvolgere tutti processi redox. Con la formazione di questo legame
covalente la coppia di elettroni viene legata a questo atomo di carbonio e poi passa in posizione tra i due
atomi di carbonio dopo che l’altro atomo di azoto è stato protonato. Il protone dall’altro atomo di zolfo si è
staccato, si stacca lo zolfo dal carbonio, si forma il ponte tiolico e quindi il lipoato e si è formato il FAD
ridotto.

Deficienza di riboflavina

Le problematiche che possono essere legate ad una deficienza di questo coenzima che è una vitamina, quindi
è indispensabile per la vita. Sono problematiche legate alla degradazione di tessuti muscolari, mucose, pelle
ed altro ad esempio fenomeni di cheilosi (fessure verticali sulle labbra), stomatite angolare (ferite
nell’angolo della bocca), glossite, fotofobia, dermatite deborroica, anemia normocromo-normocitica,
patologie spesso associate alla pellagra. È chiaro che una carenza di un coenzima può alterare le
trasformazioni dell’altro coenzima e viceversa, ci possono essere problemi nei neonati che vengono trattati
con fototerapia in fase di iperbilirubinemia. Nel caso di neonati si possono verificare delle situazioni per cui
c’è un eccesso di bilirubina nel sangue, questo fenomeno è spesso evidenziato da una leggera pigmentazione
gialla della cute. Sono fenomeni abbastanza comuni nei primi giorni dopo la nascita, il fenomeno può essere
transitorio, molto lieve oppure può essere correlato ad alcune situazioni patologiche più o meno rilevanti.
Quando il livello di bilirubina supera un determinato valore che può determinare nel neonato altri problemi
soprattutto a livello cerebrale si interviene con trattamenti di fototerapia, il neonato viene esposto a luce
ultravioletta sulla cute, questo viene fatto all’interno di una camera in cui viene controllata la temperatura, il
neonato viene bendato e sottoposto per un certo tempo ad una irradiazione con luce UV che degrada la
bilirubina. Può accadere che in queste condizioni si possa avere un abbassamento della riboflavina perché
essendo una molecola molto sensibile alla luce UV può essere degradata.

Acido ascorbico (vitamina C)

Vitamina detta anti-scorbuto perché previene questa patologia.

La struttura ha delle correlazioni agli zuccheri e in particolare al
glucosio, il meccanismo di sintesi è in qualche modo legato alle
molecole zuccherine. Viene prodotta nelle piante in un pathway
dell’acido uronico che parte dal glucosio. Strutturalmente esiste
in equilibrio tra froma enolica e chetonica, è abbondantemente
contenuta soprattutto negli agrumi (limone, aranci, pompelmo)
ma anche in diversi ortaggi e vegetali. non può essere
sintetizzata dall’uomo, poiché non ne può fare a meno la deve assumere dalla dieta. Non può biosintetizzare
questa molecola perché manca un enzima che presiede ad una importante trasformazione strutturale,
l’enzima L-gulono-γ-lattone ossidasi.

10 mg/d di vitamina C sono sufficienti in un uomo per prevenire la patologia dello scorbuto, però per un
corretto funzionamento del cofattore sono necessari almeno 30 mg/d, mentre una dose di circa 100 mg/d va
a saturare i tessuti, quindi è necessario un giusto equilibrio. Non ne possiamo fare a meno ma non dobbiamo
neanche abusare delle vitamine. La vitamina C è una vitamina che se presa in eccesso non fa male perché è
facilmente eliminabile ma esistono vitamine che se presenti in eccesso possono comportare anche problemi
di salute. Le dosi medie suggerite nel caso delle donne è di 75 mg/d e per gli uomini 90 mg/d, per i bambini
30 mg e per le donne in gravidanza circa 100 mg. Si aggiungono 35 mg/d per i fumatori. Si utilizza per
prevenire lo scorbuto, un danneggiamento del tessuto connettivo della matrice extracellulare e di alcune
strutture muscolari. Questo perché la vitamina C è fondamentale in una corretta costituzione strutturale del
collagene. L’acido ascorbico può intervenire in terapie per carenze di emoglobina. Alcuni ritengono che
aiuta con il raffreddore.

I fattori che possono alterare il livello della vitamina C negli alimenti sono: una lunga conservazione che
può causare ossidazione e perdita di vitamina C, anche processi di cottura comportano una perdita molto
elevata di vitamina C. Rischi di insufficienza vitaminica sono dovuti ad abuso di alcolici, nei bambini se
vengono nutriti solamente con latte bollito e diete carenti di fabbisogni di carboidrati, di prodotti con un
adeguato apporto calorico e vitaminico.

Uno dei possibili processi di biosintesi dell’acido ascorbico:

l’acido glucuronico che viene dall’ossidazione del glucosio, è in

configurazione D (la molecola è ruotata di 180 gradi). Questo
acido D-glucuronico viene ridotto attraverso una deidrogenasi in
cui interviene un coenzima NADH, la funzione aldeidica viene
ridotta ad alcol, a questo punto questo composto che si è formato è
l’acido L-gulonico. È diventato L perché, sempre per le
convenzioni di Fisher, la catena va rappresentata con la funzione
carbossilica in alto e non più con la funzione aldeidica. L’acido L-
gulonico subisce una lattonizzazione, il carbossile va ad
esterificare l’OH in posizione 4, si forma un anello a 5 termini.
L’enzima che catalizza la ciclizzazione, cioè l’esterificazione
intramolecolare, è una lattonasi, così si forma l’L-gulonolattone
che viene ossidato ad opera della L-gulonossidasi, enzima che non è presente nell’uomo e in diversi animali,
che non possono formare la vitamina C. Invece è presente nelle piante e in alcuni microorganismi. Ossida la
funzione alcolica, è un enzima di un’elevatissima specificità. Nella molecola ci sono 3 OH secondari e un
ossidrile primario, non c’è nessun reagente chimico organico per effettuare un’ossidazione così selettiva. Si
può ossidare selettivamente il primario rispetto ai secondari ma ossidare solo uno dei secondari lasciando
inalterati gli altri non è realizzabile in laboratorio. Questo enzima, grazie alla sua elevata specificità, ossida
selettivamente la funzionalità ossidrilica convertendo l’L-gulonolattone in 3-cheto-L-gulonolattone. Questo
composto spontaneamente si converte nella forma enolica che è più stabile perché si genera anche un legame
a ponte idrogeno tra i due ossidrili, la struttura ha una maggiore stabilità. Questa è la molecola dell’acido
ascorbico. Le due molecole sono in equilibrio tra di loro anche se è spostato verso la forma enolica. Il tutto
si gioca sull’alta specificità dell’enzima. La vitamina C è stata la prima vitamina sintetizzata in laboratorio.
Mentre alcune trasformazioni possono essere effettuate mediante metodi chimici in laboratorio, alcuni
passaggi possono essere fatti per via enzimatica. Sono stati utilizzati processi di biotrasformazione in cui si
utilizzano o enzimi isolati oppure fermentatori batterici in cui si utilizzano microorganismi che effettuano la
trasformazione. Una delle trasformazioni chiave è appunto l’ossidazione selettiva. Queste trasformazioni
sono fatte particolarmente in Asia e nella casa farmaceutica Hoffmann. Oggi il processo di sintesi della
vitamina C è molto importante, vengono sintetizzate quantità molto imponenti a scopo farmaceutico.
 La vitamina C svolge diversi ruoli
nell’organismo. Un ruolo importante è quello di
agire come bloccante di radicali liberi che
vengono formati nel corso di trasformazioni
biologiche. L’acido ascorbico può eliminare
facilmente un H radicale e formare una struttura
radicalica stabilizzata. Il radicale è delocalizzato
su tutti questi atomi di carbonio e ossigeno,
quindi è un radicale libero particolarmente stabilizzato che può facilmente reagire in presenza di un’altra
forma radicalica.

Altro aspetto è quello di agire da

agente riducente, questo è dovuto
all’equilibrio tra forma ridotta ed
ossidata con possibile
trasferimento di atomi di idrogeno.
Se trasferisce al substrato due
atomi di idrogeno sempre
attraverso amminoacidi passa dalla
sua forma ridotta alla forma
ossidata. Si forma una forma trichetonica che è l’acido deidro-L-ascorbico.

Svolge un ruolo molto importante nella produzione e conservazione funzionale stabile del collagene. È
estremamente importante questa funzione, è un po’ complesso il meccanismo biologico. È fondamentale il
ruolo che l’acido ascorbico ha nella trasformazione della prolina in idrossiprolina e la lisina in idrossilisina,
che sono importanti componenti del collagene. Poi interviene nella catena di trasporto degli elettroni,
reazione che avviene a livello dei mitocondri con la partecipatione del citocromo C. Interviene nel
metabolismo cerebrale della L-tirosina attraverso processi redox. La tirosina viene trasformata in acido p-
idrossifenilpiruvico, successivamente una seconda ossidazione forma l’acido 2,5-diidrossifenilacetico. È un
meccanismo chiave per la degradazione della tirosina.

Questa è una simbolica rappresentazione di una prolina all’interno di

una sequenza peptidica, questo è il legame ammidico che precede e
questo è il legame ammidico che precede. L’intervento della vitamina
C in un meccanismo enzimatico catalizzato dall’enzima prolina
ossidasi che utilizza anche ossigeno come agente ossidante porta alla
formazione dell’idrossiprolina. Non tutte le proline del collagene vengono ossidrilate, questo porta una
strutturazione particolare delle fibre del collagene, alla sua stabilizzazione. Quindi è un fenomeno
particolarmente importante per la massa muscolare e tutta la struttura del tessuto extra-cellulare.

Qui vediamo una delle trasformazioni legate al

ciclo della tirosina, la dopamina viene ossidata in
una reazione catalizzata dalla dopamina β
idrossilasi che utilizza come cofattore la vitamina C
e

come agente ossidante l’ossigeno, si

forma la norepinefrina, un importante
neurotrasmettitore biologico.

Anche in questi casi i processi catalizzati

sono estremamente selettivi e specifici.
La tirosina viene trasformata nell’acido p-idrossifenilpiruvico tramite una reazione di transamminazione, che
comporta la trasformazione del legame C-NH in una funzione carbonilica. Una volta ottenuto questo para-
idrossifenilpiruvato questo viene sottoposto ad una trasformazione catalizzata da una ossigenasi, enzima che
effettua una ossidrilazione selettiva sull’anello aromatico. L’ossidrilazione è poi seguita da una
decarbossilazione ossidativa. In questo passaggio interviene l’ascorbato. L’acido oomogentisico subisce una
decarbossilazione ossidativa e viene degradato ad aceto acetato e fumarato attraverso una serie di processi.

La vitamina C è un buon agente riducente, può essere ossidata alla sua forma policarbossilica, dichetonica,
questo può andare a sopperire processi nativi degradativi nelle proteine cellulari e nel DNA. Questo è molto
importante in tutte le condizioni metaboliche cellulari in cui vengono sintetizzati composti organici molto
energici che vengono indicati come superossidi che possono andare ad aggredire molecole molto importanti
dal punto di vista funzionale ed essere causa di danni cellulari, patologie, invecchiamento precoce e anche di
condizioni che possono innescare processi tumorali. La vitamina C è in grado di bloccare gli aspetti deleteri
di questi superossidi perché attraverso il suo potere riducente e antiossidante va a bloccare i superossidi, a
renderli inattivi e a prevenire i danni sulle molecole.