Topologia DNA
Topologia
Quella disciplina che studia le proprietà geometriche
delle figure che non variano quando le figure stesse
sono sottoposte a continue deformazioni.
Il superavvolgimento è l’avvolgimento a elica di
un’elica.
Anche i cromosomi anche se sono molecole lineari,
sono organizzati in modo da essere ancorati in più
punti ad uno scuffled costituito da proteine. Sono
organizzati in domini indipendenti l’uno dall’altro,
come se ciascuno di quei domini tra due punti di
ancoraggio fosse una molecola circolare.
Le molecole di DNA in vivo hanno una struttura
“chiusa”, sia che si tratti di molecole circolari che
cromosomi eucariotici o batterici nei quali tratti di dna
sono ancorati con legame a complessi di proteine.
Il DNA è organizzato in domini topologici
indipendenti (dal punto di vista degli avvolgimenti e
super avvolgimenti).
Vinogard stabilì che una molecola di DNA circolare
covalentemente chiusa si trova generalmente in uno
stato di superavvolgimento.
Proprietà topologiche del DNA
L=T +W
In un DNA rilassato L=T
L=L0 =N /10.5 N=n°bp
Il twisting number (T) è il numero di giri dell’elica
Il Writhing number (W) è il numero di
superavvolgimenti.
Il linking number (L) rappresenta il numero di volte
che un filamento si avvolge sull’altro. E’ un numero
intero e può essere modificato solo in seguito a una
rottura dello scheletro zucchero-fosfato. L in una
molecola covalentemente chiusa e circolare non varia.
Ad esempio, se il linking=1, un filamento si avvolge
sull’altro in un unico punto.
Immaginiamo di cambiare L
Prendiamo una molecola di DNA nel quale L è stato
ridotto (L<L0). Ad esempio vediamo che L=18.
Questo DNA forma dei superavvolgimenti detti
negativi perché questo filamento è stato fatto ruotare
nel senso contrario all’avvolgimento dell’elica
(destrorsi).
W è diventato -2 e T=20 (L deve essere uguale a
T+W).
Affinché T sia =20, il numero di paia di basi per ogni
giro di elica deve aumentare e quindi deve diminuire
l’angolo di twist.
Se invece apriamo il doppio filamento, lo facciamo
ruotare nello stesso di avvolgimento dell’elica (L>L0)
e lo richiudiamo osserveremo la formazione di due
superavvolgimenti definiti positivi. Il valore di L
diventa 22 mentre quello di W +2. Per compensare i
valori di T, il numero di basi per giro di elica
diminuisce e aumenta l’angolo di twist per arrivare a
20.
Se partiamo da un DNA rilassato con L=20, lo apriamo
facendo diventare L=18. Se lo forziamo a rimanere
rilassato T è uguale a 18. Questa molecola non è
stabile e quindi si superavvolge due volte
negativamente.
Se noi aumentiamo L a 22, forzando il DNA a una
posizione rilassata, avremmo T= 22. Questa molecola
risulta stabile ma poiché diminuisce il numero di basi
per giro e aumenta l’angolo di twist, quindi W= +2.
Questa è la condizione energetica più favorevole.
Se introduciamo un superavvolgimento senza cambiare
L e sarà positivo (w=+1) allora T sarà 19.
Conseguenza dei superavvolgimenti
Se noi immaginiamo di eliminare questi
superavvolgimenti negativi forzando la molecola a
srotolarsi e diventare rilassata oppure attraverso
l’intervento di enzimi, avremo un L uguale, T=18 e
W=0. Questa molecola rimane in questa posizione
grazie ad una parziale denaturazione. Questa è
termodinamicamente favorita in DNA superavvolti
negativamente soprattutto in regioni ricche di A-T.
Importante in quei processi cellulari dove c’è bisogno
della denaturazione (inizio replicazione o trascrizione),
spesso sono state trovate regioni ricche di A-T.
Per riassumere
Il DNA all’interno delle cellule risulta superavvolto
negativamente. Tuttavia, la posizione più favorevole è
quella i un DNA rilassato nel quale G è più negativo.
L’introduzione di superavvolgimenti richiede energia,
per questo, una volta introdotti i superavvolgimenti
questi possono essere considerati come depositi di
questa energia. Una volta tolti i superavvolgimenti,
questa energia può essere utilizzata per effettuare
transizioni strutturali.
Nell’esempio precedente, il DNA conteneva due
superavvolgimenti negativi. Se si rimuovono, si ha la
denaturazione e l’energia immagazzinata viene
utilizzata per effettuare transizioni strutturali come la
denaturazione di un tratto.
1 giro di superelica = G=-9 kcal/mol
N° di superavvolgimenti in vivo = 1 giro negativo
ogni 200bp (espresso anche dalla densità della
superelica)
Densità di super elica = Lk/Lk0 = σ = 0.05-0.06
Diversi tipi di superavvolgimento
Due tipi di superavvolgimenti (in entrambi i casi
negativo):
 Plectonemico: Si ottiene con il
superavvolgimento dell’elica su se stessa. Si
trova prevalentemente nei batteri, il dna è
associato a delle proteine che formano dei
domini distinti.
 Toroidale: il dna si superavvolge su qualcosa.
Si trova negli eucarioti, le proteine si
associano agli istoni a formare i nucleosomi.
Topoisomerasi
Il DNA all’interno delle cellule si trova superavvolto
negativamente e l’introduzione di essi richiede energia.
Questo avviene grazie a degli enzimi chiamati
Topoisomerasi.
Questi enzimi tagliano il DNA e introducono il
superavvolgimento legando insieme il filamento
tagliato portando un differente numero di linking.
Come avviene? Si forma un legame covalente tra un
estremità del dna e un residuo di tirosina che si trova
nel sito catalitico dell’enzima.
Esistono due classi di topoisomerasi e la differenza
risiede nel tipo di rottura del filamento.
Il tipo I taglia un singolo filamento di DNA e
introduce una variazione del numero di linking =1. Può
essere suddiviso in due sottoclassi in base al
meccanismo di azione. Il Tipo IA forma il legame
covalente con la tirosina con il 5’ fosfato mentre il
tipo IB lo forma con il 3’ fosfato
Il tipo II taglia i due filamenti introducendo una
variazione del numero di linking +-2.
Topoisomerasi di tipo I : rimozione di
superavvolgimenti negati
Partendo da una molecola con un superavvolgimento
negativo (L=15, T=16 e W=-1), la topoisomerasi taglia
uno dei due filamenti introducendo un nick, fa passare
l’altro filamento attraverso il nick e richiude il
filamento. Durante l’azione L=15, T=15 e W=0 mentre
alla fine avremo L=16, T=16 e W=0.
Funzionamento del tipo I
Utilizzano un meccanismo chiamato “Strand
passage”. Nonostante tutte le topoisomerasi utilizzino
questo meccanismo, esiste un altro meccanismo
chiamato “Reazione controllata”.
Strand Passage
Nel sito attivo dell’enzima è presente il residuo di
tirosina che, con il suo gruppo OH, compie un attacco
nucleofilo sul fosfato formando un legame covalente
tra tirosina e il fosfato stesso del nucleotide. Questo
provoca la rottura del legame fosfodiesterico. Il
filamento rimasto integro viene fatto passare attraverso
l’interruzione e l’enzima, che si trova in
conformazione chiusa, con il 3’-OH che va ad
attaccare il gruppo fosfato formando di nuovo il
legame fosfodiesterico tra i due nucleotidi rilasciando
la tirosina. L’energia dei legami viene preservata.
Come si comporta l’enzima
L’enzima passa attraverso diversi cambianti
conformazionali. Durante la reazione della tirosina
con l’estremità 5’ l’enzima ha una conformazione
aperta che consente il passaggio del filamento.
Durante la chiusura del filamento tagliato, l’enzima
ha una conformazione chiusa con rilascio dal DNA.
Nel momento in cui si forma il legame covalente con
la tirosina, l’estremità non tagliata rimane
strettamente legata all’enzima. E’ importante perché
un doppio filamento di DNA in cui è stato introdotto
un nick (taglio a singolo filamento) è libero di ruotare
attorno. Se l’estremità venisse lasciata libera, il Dna
potrebbe ruotare perdendo i superavvolgimenti.
Reazione controllata (Tipo IB)
Questa reazione consente di introdurre il taglio. La
tirosina va a produrre il taglio in una regione.
Topoisomerasi di tipo II: Inserimento di
superavvolgimenti negativi
Partendo da un DNA rilassato (L=16, T=16, W=0),
l’enzima taglia entrambi i filamenti e fa passare
l’intero doppio filamento rimasto integro attraverso
l’interruzione. Il numero di linking sarà =2, T=16 e
W=-2.
Girasi (topoisomerasi tipo II)
E’ un enzima tetramerico che consiste di 2 subunità
situate in porzioni dette Cancelli.
Nel cancello N è presente la subunità GyrB e nel
cancello C è presente la subunità GyrA. In queste
regioni ci saranno dei cambiamenti conformazionali
che permettono il legame del DNA e il passaggio di un
filamento di Dna attraverso l’altro filamento. Sono in
grado di aprirsi in maniera alternata.
Modello del “doppio cancello”
Inizialmente l’enzima è legato a un filamento di DNA
detto Segmento G (gate) per indicare il filamento che
si apre e in seguito è legato al Segmento T (transfer)
per indicare quella regione di DNA che passa
attraverso il segmento G.
Inizialmente il segmento G è legato al cancello per il
DNA e il cancello C, che sono chiusi mentre il
cancello N risulta aperto. Quest’ultimo si trova sulla
subunità GyrA che lega l’ATP ed è proprio questo
legame che innesca i cambiamenti conformazionali. Le
due subunità GryB e GryA dimerizzano fra di loro
formando un legame e il filamento del Segmento T
rimane inglobato nel canale e viene catturato
all’interno dell’enzima.
L’idrolisi della prima molecola di ATP induce altri
cambiamenti conformazionali, in particolare
l’attivazione del sito catalitico.
La tirosina taglia il doppio filamento (come nel tipo I)
in due estremità 5’. Visto che abbiamo un dimero, una
si lega ad una estremità 5’ e l’altra a l’altra estremità 5’
mentre le estremità 3’ rimangono attaccate all’enzima.
In seguito al taglio, si ha l’apertura del cancello per il
DNA e quindi il segmento T può passare attraverso il
segmento G e, poichè anche il cancello C è aperto, il
Dna si prepara per l’uscita.
Subito dopo l’enzima risalda il segmento G tagliato in
contemporanea alla chiusura del cancello del DNA. Il
segmento T lascia il complesso attraverso il cancello
C.
Solo ora avviene l’idrolisi della seconda molecola di
ATP che innescano dei cambiamenti conformazionali
che riportano l’enzima allo stato iniziale. Quindi ADP
e il fosfato si dissociano dall’enzima e questo, privo di
ATP, ritorna ad avere le due subunità dissociate tra di
loro con il cancello N aperto.
Il risultato del ciclo catalitico è di aver introdotto
due superavvolgimenti negati con l’idrolisi di due
molecole di ATP.
Fra tutte le topoisomerasi, solo la girasi è in grado
introdurre superavvolgimenti, gli altri possono solo
rilassare i superavvolgimenti già presenti.
Introduzione di superavvolgimenti in cellule
procariotiche
Nelle cellule batteriche i superavvolgemnti sono di
tipo plectonemico con domini del DNA formati grazie
al legame di alcune proteine lungo la molecola di
DNA.
LA DNA girasi utilizza le molecole di ATP e come
cofattore il magnesio ed è in grado di introdurre i
superavvolgimenti negativi.
Introduzione di superavvolgimenti in cellule
eucariotiche
Nelle cellule eucariotiche i superavvolgimenti sono di
tipo toroidale. Il livello di superavvolgimento negativo
è dato dall’avvolgimento del Dna attorno all’ottamero
istonico a formare i nucleosomi di circa 1,5 volte.
Questo avvolgimento toroidale corrisponde ad un
superavvolgimento negativo. Poiché il filamento di
DNA libero si avvolge positivamente, intervengono le
topoisomerasi di tipo I che lo rilassano (w=0) in modo
tale che il DNA sia superavvolto negativamente.
Dov’è necessario l’intervento delle topoisomerasi?
Poiché lo stato topologico del DNA deve essere
finemente regolato, le topoisomerasi intervengono
durante:
 la replicazione: Durante questa i due filamenti
vengono separati. L’apertura di un doppio
filamento che sia avovlto ad elica genera la
formazione di superavvolgimenti positivi. Ad
un certo punto questi potrebbero impedire il
processo di replicazione quindi le
topoisomerasi vanno a togliere questi
superavvolgimenti dalla forca di replicazione
 trascrizione: Solo una regione del Dna si apre
quindi abbiamo una regione in cui la rna
polimerasi inizia a trascrivere. L’apertura e lo
spostamento della bolla di trascrizione fa si
che a monte si accumulino superavvolgimenti
negativi mentre a valle superavvolgimenti
positivi. Le topoisomerasi controllano queste
due regioni. Inoltre la trascrizione a partire da
alcuni promotori richiede un livello minimo di
superavvolgimento negativo.
 associazione con gli istoni:
 terminazione della replicazione di cromosomi
circolari: La topoisomerasi IV batterica (tipo
II) interviene alla fine della duplicazione per
far in modo che i due cromosomi originati non
rimangano legati quindi passa un filamento
attraverso l’altro.
Metodi di analisi di topoisomeri di DNA
I topoisomeri del DNA sono molecole di DNA
caratterizzate da un livello di avvolgimento diverso.
Questi vengono separati attraverso elettroforesi su gel
di agarosio e centrifugazione in gradiente di densità.
Per ognuno di queste due tecniche è stato utilizzato il
Bromuro d’etidio che introduce naturalmente
superavvolgimenti perché quando viene colpito da luce
UV mentre è legato con il DNA aumenta luce
fluorescente. E’ una molecola intercalante perché si
intercala in una coppia di basi adiacenti.
Bromuro d’etidio
E’ una molecola planare che apporta cambiamenti
all’interno del DNA. La molecola si allunga perché le
due coppie di basi adiacenti devono arrangiarsi per fare
spazio a questa molecola. Questa molecola svolge il
DNA di 27° cambiando l’angolo di twist e 14 molecole
svolgono il duplex di 378° facendo perdere al DNA 1
giro d’elica.
Nel processo di intercalazione, si può assistere ad una
variazione dello stato di superavvolgimento. Se noi
mettiamo il DNA in concentrazioni crescenti di
bromuro d’etidio avremo un DNA rilassato
inizialmente e poi un superavvolgimento positivo
senza che sia cambiato il numero di linking. Queste
forme vengono separate con i metodi già elencati.

Elettroforesi su gel di agarosio

Il DNA superavvolto migra più facilmente nel gel
perché ha una struttura più compatta (in basso). Il
DNA rilassato si trova in alto poiché ha una
migrazione inferiore. Il DNA linearizzato si trova nel
mezzo.