Replicazione del DNA
Watson e Crick individuarono il fatto che
l’appaiamento di basi complementari potesse
essere alla base della replicazione di questa
molecola, tuttavia il meccanismo era sconosciuto.
Erano stati ipotizzati tre meccanismi per la
replicazione:
 Semi-conservativa: i due filamenti
costituenti la doppia elica fungono da
stampo per la sintesi di due filamenti nuovi
così che il filamento figlio avesse un
filamento uguale a quello di partenza e uno
nuovo
 Conservativa: i due doppi filamenti
originati erano uno uguale al DNA di
partenza e l’altro completamente nuovo di
nuova sintesi
 Dispersiva: i tratti della doppia elica erano
originati in parte dalla molecola iniziale e
in parte erano di nuova sintesi
Esperimento di Meselson e Stahl (1958)
Meselson e Stahl fecero un esperimento che portò
alla comprensione del corretto meccanismo di
replicazione del DNA.
Cosa fecero?
 Marcano le molecole di DNA di E.Coli
con azoto 15 (isotopo pesante del N14).
 Viene preparata la coltura batterica in un
terreno di coltura che contiene un sale di
ammonio contenente azoto 15.
 Viene lasciata crescere per 14 generazioni
in modo tale che l’azoto 15 sostituisca
l’azoto 14
 Viene estratto il DNA dalle cellulle e
sottoposto in una centrifuga in gradiente di
densità con cloruro di cesio. Le molecole
vengono separate in base alla strtuttura e
PM
 Il DNA della generazione 0 ha una
velocità di sedimentazione molto elevata
(100%)
 Prendono una liquota di questi batteri e la
inoculano in un terreno di coltura
contenente azoto 14
 Dopo 20 minuti (1 generazione) viene
prelevato un campione e centrifugato come
prima. La migrazione delle molecole di
DNA risulta minore (PM minore).
 Dopo un’altra generazione cresciuta in
presenza di azoto 14, si osservano due
bande di DNA, una migra come nel
campione precedente mentre la seconda ha
una velocità di sedimentazione ancora
inferiore
 Andando avanti con le generazioni, le
bande rimangono nella stessa posizione
con la banda rossa che diminuisce
drasticamente e la banda arancione che
aumenta
Interpretazione dei risultati
Il campione 0 ha un DNA contenente l’azoto 15
quindi due filamenti pesanti.
Nella seconda generazione, si osserva che si ha
una migrazione leggermente inferiore però non
possiamo trarre subito delle conclusioni.
Grazie alla terza generazione osserviamo le due
bande che devono corrispondere a un DNA
uguale a quello della seconda generazione e uno
più leggero. Diamo per buona l’ipotesi del
meccanismo semi-conservativo. Perché alla
prima divisione avremo un filamento pesante e
uno leggero ma dalla terza generazione, dove
compaiono due bande, si ha una banda uguale alla
seconda e la banda più leggera che corrisponde a
due filamenti più leggeri.
Enzimi coinvolti nella replicazione
Contemporaneamente all’esperimento di
Meselson e Stahl, Kornberg identificò ed estrasse
un enzima da E.coli, ovvero la DNA polimerasi.
La DNA polimerasi può sintetizzare il DNA solo
in direzione 5’ -> 3’ e non è in grado di iniziare la
sintesi di un filamento ma ha bisogno di un
gruppo -OH come innesco.
Substrati del DNA polimerasi
La dNA polimerasi è in grado di legare un
nucleotide all’altro catalizzando il legame
fosfodiesterico.
Per agire, ha bisogno di due substrati: il nucleotide
trifosfato e lo stampo, ovvero un filamento che
fungesse da stampo appaiato con un innesco OH.
Lo stampo è in direzione 3’-5’ mentre l’innesco è
costituito da un breve filamento 5’-3’ dove il suo
3’OH nel quale si va a legare la DNA polimerasi.
La reazione che viene catalizzata è una
sostituzione nucleofila, nella quale l’O attacca il La DNA polimerasi subisce un cambiamento
fosfato in posizione alfa del nucleotide entrante conformazione durante la formazione del
portando alla formazione del legame legame. E’ stata identificata un’alfa elica (elica
fosfodiesterico tra O e P. Porta alla liberazione di O) che può avere una conformazione aperta e
H e pirofosfato. L’energia associata è di -3.5 chiusa. L’ingresso del nucleotide fa piegare l’alfa
kcal/mol. Il contributo energetico che consente la elica di 45° (quindi elica O chiuso) e si ha un
non reversibilità è data dalla scissione del contributo per la catalisi in quanto gli
pirofosfato portando il G = -7 Kcal/mol. amminoacidi che sporgono dall’alfa elica
stabiliscono delle interazioni con il nucleotide
entrante.
Dettagli strutturali
Un residuo di tirosina (che ha un anello) forma
I dettagli strutturali sono stati chiariti dall’analisi
delle interazioni di stacking con la base appena
della DNA polimerasi del fago T7. Tutte le DNA
entrata mentre i due residui di lisina e arginina
polimerasi hanno bisogno di un innesco e
interagiscono con i fosfati carichi negativamente
procedono in direzione 5’-3’ e il meccanismo
sempre del nucleotide entrante. La formazione di
della catalisi è conservato.
questi legami stabilizza solo i nucleotidi
Nella DNA polimerasi del T7, riconosciamo 3
complementari.
domini distinti: Palmo costituisce il domino
catalitico in cui l’innesco stampo si va a legare,
La DNA polimerasi non utilizza rNTP (deossi
pollice e dita.
NTP).
Considerando i due tipi di nucleotidi, abbiamo una
Sito attivo della DNA polimerasi
concentrazione di ribonucleotidi (NTP) molto
Esiste un unico sito in cui i 4 dNTP dell’ATP
maggiore rispetto a quella di rNTP. Nonostante i
possono legarsi durante la sintesi. L’analisi di
due tipi di nucleotidi abbiano due concentrazioni
questo sito ha dato le basi molecolari per capire
diverse, la Dna polimerasi è molto selettiva nei
come la DNA polimerasi sceglie la base
confronti dei rNTP.
complementare rispetto al filamento stampo.
Sono presenti gli amminoacidi discriminatori che
L’ingresso di un nucleotide corretto porta alla
formano legami di van der Waals con l’anello
formazione del legame idrogeno e il legame del
dello zucchero. Se dovesse entrare un
nucleotide nel sito attivo dell’enzima.
ribonucleotide nel sito attivo, la presenza dell’OH
L’appaiamento corretto pone il nucleotide entrante
lo porrebbe in una conformazione del deossiNTP.
nella giusta posizione in modo tale che l’O
dell’innesco si trovi affianco al fosfato in
Come si posizionano nel palmo della mano?
posizione alfa.
L’innesco stampo si trova adagiato sul palmo, il
Quando si ha un appaiamento sbagliato, non solo
nucleotide entrante si trova nello spazio tra pollice
non si viene a formare il legame di O e P ma la
e dita entrando nel sito catalitico.
velocità di incorporazione di un nucleotide
Il filamento stampo si trova piegato rispetto
scorretto è minore rispetto a quella della velocità
all’enzima stesso in modo tale che solo il primo
di incorporazione del nucleotide corretto
nucleotide libero si trovi vicino al sito catalitico.
(10.000 volte >).
Il sito catalitico della polimerasi presenta due
cationi bivalenti come Magnesio e Zinco che
favoriscono la polimerizzazione e quindi la
Fedeltà della replicazione
catalizzazione del legame fosfodiesterico. Dalla
Si intende la capacità della DNA polimerasi di
posizione di questi cationi, possiamo vedere come
non commettere errori, ovvero l’incorporazione di
questo riduce l’affinità tra il 3’ O e H in modo tale
un nucleotide non appaiato con lo stampo.
che si possa formare il legame tra O e P con
Tuttavia, la DNA polimerasi può commettere
l’azione di attacco nucleofilo. L’altro catione
degli errori in quanto i nucleotidi esistono in due
stabilisce dei legami con gli ossigeni dei fosfati in
conformazioni teutoniche diverse. Quando uno dei
modo tale da far rimanere il nucleotide in
nucleotidi si trova in questa conformazione, le
posizione corretta.
capacità di appaiamento sono diverse e crea un
tasso di errore della DNA polimerasi.
Questa può inserire o un nucleotide sbagliato
oppure incorpora il nucleotide in conformazione
tautomerica in posizione sbagliata.
La DNA polimerasi compie un errore ogni
1/10alla quinta. Il tasso di mutazione è pari 1/10
alla 10. La DNA polimerasi, tuttavia, ha un
meccanismo di correzione di bozze che consente
di risolvere questi errori abbassando il tasso di
errore a 1/10 alla 7.
Il meccanismo di correzione di bozze è stato
compresso anch’esso grazie all’analisi della
struttura 3D e la DNA polimerasi ha un’attività
enzimatica di tipo esonucleasica in direzione 3’-
5’.
Come avviene la correzione di bozze?
La Dna polimerasi è in grado di tagliare l’ultimo
nucleotide incorporato ed eliminarlo.
Nel caso di un nucleotide sbagliato e quindi che
non si appaia, la conformazione del substrato
dell’innesco-stampo perde la sua affinità per
quella regione dell’enzima e si sposta all’interno
dell’enzima legandosi ad una regione dell’enzima
responsabile dell’attività esonucleasica. In questa
regione si taglia il nucleotide sbagliato e la
molecola si lega di nuovo nel sito attivo
dell’enzima.
Funzioni delle diverse subnità della DNA
polimerasi III in E.coli
La polimerasi III è responsabile della replicazione
del cromosoma ed è costituita da diverse subunità.
L’analisi delle funzioni delle diverse subunità fu
fatta associando un approccio genetico, con
isolamento dei mutanti e proteine, e una serie di
esperimenti detti “di complementazione in vitro”.
La subunità α è la subunità catalitica, quindi, ha
attività polimerasica 5’-3’.
La subunità ε ha attività esonucleica 3’-5’ o
correzione di bozze
La subunità θ ha la funzione di stimolare
l’attività esonucleica.
Queste tre proteine sono sempre trovate
insieme e costituiscono il Nucelo catalitico o
“core”.
La subunità τ è responsabile della
trimerizzazione. La subunità τ era in grado di
interagire con un’altra subunità tao per formare un
dimero. In realtà sono tre le subunità che
interagiscono
La subunità β rappresenta la subunità legata al
DNA in grado di mantenere tutto l’enzima al
DNA (sliding clamp)
Alla fine, abbiamo un gruppo di subunità che
prendono il nome di Caricatore della pinza o
“clamp loader”
Funzioni delle diverse subunità
La DNA polimerasi è un enzima estremamente
processivo, ovvero che la polimerasi, una volta
legata al substrato stampo-innesco, in presenza di
nucleotidi catalizza la sintesi di molti nucleotidi
successivi e quindi catalizzare dei tratti molto
lunghi.
Esperimenti in vitro
Gli esperimenti in vitro permettevano di
ricostruire tutto il sistema di sintesi del DNA
aggiungendo le componenti necessarie.
Aggiungendo le singole subunità si poteva
analizzare l’attività delle singole subunità.
Per questi esperimenti si utilizzava un DNA
stampo di origine fagica a singolo filamento, il
primer accoppiato, deosseonucleotidi di cui uno
marcato con un buffer. In seguito veniva misurata
la lunghezza del DNA sintetizzato con
elettroforesi su gel di poliacrilammide.
Analizzando il nucleo catalitico, si scoprì che α, θ
e ε costituivano questo nucleo perché erano in
grado da sole di sintetizzare filamenti di Dna corti
(10 nucleotidi).
Aggiungendo τ aveva l’effetto di far dimerizzare
l’enzima. Non più una subunità costituita dal
nucleo catalitico ma due quindi i filamenti di
DNA che potevano essere sintetizzati erano più
lunghi (60 nucleotidi).
Quando veniva aggiunto il caricatore della pinza i
nucleotidi erano 200.
Quello che fece aumentare la processività e
produrre filamenti molto lunghi erano le subunità
beta. Si costituiva l’intero oloenzima e in due
copie di Oloenzima c’erano 4 copie di beta. Si
scoprì che questa era in grado di legare il DNA e
quindi assicurare che la DNA polimerasi non si
dissociasse.
Oloenzima
Con gli esperimenti in vitro, si è visto che
l’olenzima è in grado di assemblarsi e legarsi al
DNA in maniera ordinata
 Si forma un complesso con il caricatore
della pinza, detto sub-complesso gamma
che contiene tre subunità gamma e le altre
subunità in un’unica copia e si associano a
tre copie della subunità τ.
 Questo complesso è una proteina che ha
attività ATPasica e l’idrolisi dell’ATP è
necessario per permettere l’associazione
della subunità beta al DNA
 Dopo l’idrolisi dell’ATP si forma un
complesso tra gamma e beta legate al
DNA.
 Questo legame aumenta l’affinità del
complesso per il nucleo catalitico
dell’enzima. (alfa, epsilon e teta)
 Si formano due complessi catalitici a
questo complesso a due delle tre subunità
tao presenti.
 La pinza, legata al caricatore, viene
caricata e spostata sul core catalitico per
rimanere associato al DNA
 Si forma l’oloenzima attivo che sarà
responsabile della sintesi di entrambi i
filamenti di DNA contemporaneamente
Come funziona in vivo?
Il DNA per essere copiato deve essere aperto.
Una volta aperto si forma la forca replicativa,
ovvero il punto di passaggio tra DNA non
replicato e quindi ancora a doppio filamento e
DNA in via di sintesi. I due filamenti, però, sono
antiparalleli e la DNA polimerasi può sintetizzare
solo in direzione 5’-3’. I due core catalitici
potrebbero replicare i due filamenti
contemporaneamente.
Essendo i filamenti antiparalleli, un filamento può
essere sintetizzato di continuo (quindi verso
destra) e questa sintensi procede nella stessa
direzione della forca di replicazione. L’altro
filamento, invece, non viene sintetizzato in
maniera continua. Non si forma un unico
filamento ma tanti frammenti detti di Okazaki in
senso 5’-3’. Di conseguenza, mentre il primo
filamento necessita di un unico innesco, l’altro
filamento (ritardato o lagging) necessita un
innesco per ogni frammento di Okazaki.
Sintesi del primer
L’innesco è dato dal gruppo OH che si lega al
fosfato per formare il primo legame
fosfodiesterico.
Il primer è una molecola di RNA di circa 11
nucleotidi sintetizzata da un enzima che è un RNA
polimerasi specializzata chiamata PRIMASI.
Per ciascuno dei frammenti di Okazaki viene
sintetizzato da una PRIMASI un breve primer
ogni 500-2000 nucleotidi. Questi primer
presentano una certa specificità di inizio, ovvero
questa primasi riconosce come siti d’inizio
sequenze CTG e CTA.
La DNA Elicasi (dnaB)
L’apertura del doppio filamento avviene grazie ad
un enzima chiamato DNA elicasi. E’ un enzima
che idrolizza molecole di ATP e questo consente
di far passare il filamento 5’-3’ attraverso un foro
che si forma attraverso l’associazione di 6
subunità di questa proteina che legano e
idrolizzano l’ATP rompendo i legami idrogeno tra
le basi.
SSB: single-strand DNA-binding proteins
Il passaggio della DNA Elicasi produce un singolo
filamento instabile che andrebbe nuovamente ad
appaiarsi. Questo è evitato dal legame da una
serie di proteine ovvero le SSB. Si legano in
forme di monomeri e in numero elevato in legame
cooperativo (il legame delle prime molecole
velocizza e facilita il legame delle molecole
successive).
La SSB si lega al DNA in forma di tetramero con
subunità identiche e il DNA si avvolge attorno alla
struttura.
Proteine presenti alla forca di replicazione
Le due polimerasi sintetizzano
contemporaneamente i due filamenti in direzione
5’-3’. Il filamento continuo viene sintetizzato
senza interruzioni.
Nel frattempo, la polimerasi sintetizza il
frammento di okazaki numero due fino a quando
non si arriva all’estemità del frammento di
okazaki 1. Questo corrisponde all’aumento delle
dimensioni dell’ansa.
Il complesso si dovrà associare al primer
successivo in modo tale che possa sintetizzare il
frammento di okazaki 3.
Le sliding clamps sono 3, una è associata alla
polimerasi che sintetizza il filamento continuo e
rimane associata fino alla fine. La sliding clamps
che è associata alla polimerasi che sintetizza il
frammento di okazaki 2, quando arriva al numero
1 si dissocia grazie alla dissociazione della pinza
beta. Questa, associata al complesso gamma,
viene spostata sul frammento di DNA e quindi
sulla polimerasi che sintetizzerà il frammento di
okazaki 3.
Sliding clamp => è la pinza beta associata ad un
doppio filamento. Rimane associata sempre alla
polimerasi quando sintetizza il DNA. E’ la
subunità che conferisce la maggiore processività
alla DNA polimerasi
Modello della DNA polimerasi III
Dagli studi recenti, sembra che la DNA polimerasi
associata alla forca di replicazione. Ci sono le tre
proteine tao e le copie del nucleo catalitico non
sono due ma sono tre.
E’ anche stato scoperto che alcune di queste
proteine interagiscono tra di loro e sono
fondamentali per la progressione della forca
replicativa e la velocità di sintesi del DNA.
La DNA elicasi interagisce con le subunità τ e
questo fa aumentare la velocità di sintesi del DNA
e la velocità di separazione dei filamenti.
Questo è stato dimostrato perché, inserendo delle
mutazioni al livello delle elicasi che impediscono
queste associazioni, veniva rallentata la velocità di
sintesi del DNA e la separazione dei filamenti.
Interazione elicasi-primasi
E’ fondamentale per garantire l’inizio della
sintesi del primer. L’elicasi e la primasi
interagiscono, l’elicasi inizia a sintetizzare il
primer. Quando il primer è stato sintetizzato,
contemporaneamente la DNA polimerasi
sintetizza il frammento di Okazaki. In
corrispondenza del caricatore della pinza è
presente un caricatore nella forma associata
all’ATP.
Una volta sintetizzato il primer, la primasi viene
rilasciata. Il tratto di DNA associata ad esso viene
legato dalla pinza legato al caricatore. L’idrolisi
dell’ATP legato al caricatore della pinza permette
al caricatore di lasciare la pinza stessa e si trova in
corrispondenza della seconda polimerasi associata
al filamento lagging. Abbiamo due polimerasi che
lavorano sul filamento discontinuo: una che
finisce la sintetizzazione e una che inizia.
La struttura del caricatore della pinza è stata
modificata in seguito all’idrolisi dell’ATP. Il
cambiamento conformazionale ha fatto
dissociare la pinza beta dal caricatore e
lasciarla associata al DNA in corrispondenza del
primer appena sintetizzato.
La “prima” polimerasi del filamento discontinuo,
quando arriva in corrispondenza del frammento di
okazaki sintetizzato, si dissocia dal DNA e dalla
sliding clamp. Questo porta il filamento del DNA
a dissociarsi, nel frattempo l’altra polimerasi
continua con la sintetizzazione del frammento di
Okazaki e la pinza beta ritorna ad associarsi ad un
nuovo caricatore e ad una nuova molecola di ATP.
Interazione tra caricatore-pinza
L’interazoine avviene solo quando il caricatore è
legato a più molecole di ATP. Il caricatore e la
pinza hanno un’elevata affinità per il DNA con un
complesso innesco-stampo. Il legame del dNA
innesca l’attività di idrolisi dell’ATP con rilascio
della pinza dal caricatore e la pinza rimane
attaccata al DNA. L’ADP rimane legato al
complesso e per poter legare la pinza beta, l’ADP
deve essere allontanato grazie ad una proteina.
Forche di replicazione eucariotiche
In corrispondenza della forca è presente una
proteina esamerica, che ha attività di elicasi
(MCM). Si associa ad altre proteine importanti per
la regolazione dell’inizio della duplicazione.
Le polimerasi sono simili a quelle dei procarioti.
La polimerasi ε sintetizza il filamento continuo
mentre δ sintetizza il filamento lagging.
La pinza beta prende il nome di PCNA e la single
strand protein prende il nome di RPA. E’ presente
una pol α primasi ed una FEN1 oligasi.
Sintesi del primer (Eurcarioti)
Nel filamento lagging, il primer è costituito da un
breve tratto di RNA, quindi la sintesi è a carico di
una RNA polimerasi. In questo caso però si tratta
di un enzima costituito da più subunità chiamato
DNA polimerasi α. Ha sia attività di DNA
polimerasi e ha una subunità con attività di RNA
polimerasi. Si chiama DNA polimerasi α
primasi.
La primasi è costituita dalla subunità più piccola.
La pol α primasi si lega nei siti in cui deve avere
inizio la sintesi del primer. Viene sintetizzato
prima il primer di RNA e poi allungato di un
breve tratto da parte della pol α. Quindi si ha un
tratto di RNA e subito dopo un tratto DNA.
Dopo la sintesi di questo breve tratto di DNA, la
pol α viene sostituita dalle DNA polimerasi ε e δ
(a seconda dei filamenti) associate alle sliding
clamp che proseguiranno la sintesi dell’intero
tratto.
Rimozione del primer
Quando sono stati sintetizzati tutti i filamenti di
Okazaki, il filamento discontinuo presenta ancora
il primer. Questo filamento risulta costituito da
frammenti di DNA inframmezzati da primer
costituiti da RNA con un’interruzione.
I primer vengono rimossi con enzimi diversi che
sostituiscono l’RNA con il DNA.
Negli eucarioti
Interviene una ribonucleasi H in grado di tagliare
i legami fosfodiesterici che tengono unito un
filamento di RNA. Questa RNAsi ha una
specificità per doppi filamenti ibridi tagliando
il filamento di RNA. Sono endonucleasi, quindi
tagliano all’interno del filamento e lasciano
l’ultimo nucleotide del primer associato al DNA.
Interviene quindi una esonucleasi Fen1 che lo
rimuove. Il frammento di okazaki precedente
fungerà da innesco per la sintesi per il tratto di
DNA mancante. La DNA polimerasi allunga il
filamento e le due estremità saranno collegati
dalla ligasi.
Nei procarioti
Interviene la DNA polimerasi I, a differenza delle
altre, ha un’attività enzimatica esonucleasica
5’-3’. E’ in grado di catalizzare la scissione dei
legami fosfodiesterici in un filamento di DNA
nella stessa direzione di polimerizzaizone. Questa
riconosce il nick (il punto di interruzione) e taglia
l’RNA. Con l’attività 5’-3’ esonucleasica crea un
nick allargato e il dominio polimerasico che
riconosce l’estremità 3’H lo usa come innesco per
sintetizzare il filamento di DNA mancante.
L’enzima è un unico polipeptide organizzato in tre
domini distinti: il dominio polimerasico, dominio
esonucleasico 3’-5’ e quello esonucleasico 5’-3’.
Ultimo step condiviso
Dopo la sostituzione di tutti i primer con
deossinucleotidi, l’enzima che catalizza la
giunzione dei nick tra i frammenti di Okazaki
adiacenti è la DNA ligasi. Usa l’ATP o il NAD
per catalizzare la reazione.
1. La reazione passa attraverso la formazione
di un intermedio tra enzima e la AMP
derivante da ATP o NAD.
2. Un residuo di lisina forma un legame con
l’AMP. Questo complesso legasi-ATP si
lega attraverso il fosfato dell’estremità
libera con l’O legato al fosfato. Si attacca
al fosfato dell’AMP con formazione di
DNA adelinerato.
3. Viene interrotto il legame covalente
formato con l’enzima
4. A partire dal DNA adenilato, con un
attacco nucleofilo da parte dell’estremità
OH rimasta libera sul fosfato del DNA
adenilato, si forma il legame
fosfodiesterico tra le due estremità di
nuova sintesi con rilascio di ATP.
Topoisomerasi II
Osservando l’avanzamento del complesso di
replicazione che continua ad aprire il doppio
filamento grazie all’alicasi, la continua apertura
provoca la formazione di superavvolgimengti
positivi che impediscono la progressione del
complesso. Le topoisomerasi II tagliano il doppio
filamento creando superavvolgimenti negativi.