TERRENO DI COLTURA

Miscela di composti biologici o sintetici, organici o

minerali, capace di fornire un ambiente ottimale per la
crescita di un particolare tipo di microrganismo
 TERRENI DI COLTURA
 I microrganismi vivono in natura in popolazioni che
sono dette miste, costituite da un’ampia varietà di
differenti tipi di microbi. I microrganismi necessitano
di ambienti favorevoli e di sostanze nutritive adatte. Il
terreno di coltura deve contenere principi nutritivi
essenziali per lo sviluppo di una coltura microbica e
deve fornire condizioni ambientali adatte alla crescita,
vale a dire condizioni ottimali di: pH, pressione
osmotica, ossigeno atmosferico,ecc.
 TIPI DI TERRENI
 TERRENI COMPLESSI: non si conosce la loro esatta
composizione chimica; sono i più comunemente usati; x es.:
Brodo Comune, Brodo di Malto, MRS.
 TERRENI DEFINITI o SINTETICI: si conosce l’esatta
composizione chimica; formato da composti chimici puri,
aggiunti a concentrazione nota.
 TERRENI SELETTIVI o DI ARRICCHIMENTO: terreni di
coltura aventi una combinazione di nutrienti che in
combinazione con opportune condizioni fisiche permettono
l’isolamento di SPECIFICI microrganismi (x es. con l’uso di
antibiotici)
 TERRENI DI COLTURA

 Nutrient Broth
 Nutrient Agar
 peptone 5 g
 estratto di carne 1 g
 estratto di lievito 2 g
 sodio cloruro 5 g
 acqua dist. 1000 ml
 Sospendere i componenti in acqua dist. fredda poco a poco per
evitare la formazione di grumi, agitare e portare all'ebollizione
fino a completa soluzione. Aggiustare il pH fino a 7,4.
 Sterilizzare in autoclave.
 X BATTERI
X LIEVITI E MUFFE
 De Man Rogosa Sharpe (MRS) per LATTOBACILLI
 Peptone from casein 10.0g;
 meat extract 8.0g;
 yeast extract 4.0g;
 D(+)-glucose 20.0g;
 dipotassium hydrogen phosphate 2.0g;
 Tween® 80 1.0g;
 di-ammonium hydrogen citrate 2.0g;
 sodium acetate 5.0g;
 magnesium sulfate 0.2g;
 manganese sulfate 0.04g;
 agar-agar (not present in MRS broth) 14.0g
 acqua dist. 1000 ml
 TERRENI DI COLTURA
 LIQUIDI: sono chiamati BRODI (BROTH)
 SOLIDI: contengono AGAR.

 agar
 - È un polisaccaride contenente zolfo estratto da un’alga
marina. Reperibile in commercio in forma essiccata pura. Si disidrata
facilmente. Ci sono vari tipi di agar che hanno proprietà fisiche diverse.
 - Non è un nutriente, ma utilizzato come agente solidificante
nei terreni di coltura.
 Dal punto di vista chimico è un galattano, carboidrato complesso formato da
molecole di galattosio.
 - Liquefazione a 97/100°C; solidificazione a 42/ 45°C
 I terreni agarizzati possono essere incubati a tutte le temperature.
 Possono essere anche utilizzate gelatina o gel di silice
 CRESCITA IN SUBSTRATI
LIQUIDI
 Se il terreno è liquido la crescita può dar luogo a: 1) Intorbidamento 2)
Formazione di una pellicola 3) Sedimento (lievito) 4)Mucosità
 INGLOBAMENTO O
INCLUSIONE

 Il terreno viene seminato mentre è ancora liquido

I microrganismi ad occhi nudo: crescita in
substrati liquidi
 I MICRORGANISMI AD OCCHIO
NUDO:CRESCITA IN SUBSTRATI SOLIDI
( SLANT)
 L’agar inclinato è una provetta di terreno a base di agar che viene posta obliqua durante il
raffreddamento e si presta per essere seminata con l’ansa o con l’ago. Sono più facilmente
osservabili le colture che producono pigmento
 I MICRORGANISMI AD OCCHIO
NUDO:CRESCITA IN SUBSTRATI SOLIDI
(SLANT)
 LA SEMINA DEI TERRENI DI
COLTURA
 SEMINA DI TERRENO SOLIDO
 SPATOLAMENTO
STRISCIO
 I MICRORGANISMI AD OCCHIO
NUDO:CRESCITA IN SUBSTRATI SOLIDI
(PIASTRE DI PETRI)
Se si aggiunge una sostanza solidificante ad un brodo che contiene cellule batteriche, si
verificherà che queste rimangono intrappolate ciascuna al proprio posto invece di
galleggiare (terreno liquido) e , moltiplicandosi produrrano una massa visibile di
cellule, detta COLONIA.
 I MICRORGANISMI AD OCCHIO
NUDO:CRESCITA IN SUBSTRATI SOLIDI
(PIASTRE DI PETRI)
 Se le cellule si raggruppano ad una certa distanza, ciascuna sarà in grado di
sopravvivere e genererà una colonia isolata. Colonie di microrganismi
diversi differiscono per misura, colore e struttura.Per questo motivo
l’aspetto di una colonia è importante per l’identificazione di una coltura.
 I MICRORGANISMI AD OCCHIO
NUDO:CRESCITA IN SUBSTRATI SOLIDI
(PIASTRE DI PETRI)
 TECNICA DELLA STRISCIATA SU PIASTRA
 Si può trasferire una coltura microbica sulla superficie dell’agar di una
piastra petri con l’ansa o con l’ago incurvato; questa tecnica viene
chiamata di trasferimento per striscio ed una piastra così preparata viene
detta strisciata. Esistono varie tecniche di striscio su piastra. Attenzione!
Bisogna flambare e
far lasciare raffreddare l’ago o l’ansa
ad ogni passaggio.
 L’obiettivo della tecnica dello striscio

è quella di formare da una sospensione di

cellule,
delle colonie ben separate.
 All’inizio di una striscio le cellule sono strettamente compatte,
ma con il proseguire lo striscio le cellule rimangono sempre
meno sull’ago, trasferendosi sempre più distanziate sull’agar
formando colonie sempre più separate.
 Poche strisciate frettolose non producono colonie separate; una
buona piastra è il risultato di molti movimenti continui dell’ansa
o dell’ago. Si inizia con una goccia di coltura sul bordo della
piastra.
 In una delle tecniche si sterilizza alla fiamma l’ago per lo
striscio o l’ansa e si raffredda sul bordo dell’agar. Si tiene
sempre semicoperta la piastra di petri. La goccia deve essere
opposta a voi e strisciate verso di voi
 CONCETTO DI STERILITÀ

 STERILIZZAZIONE: distruzione di ogni organismo vivente,

(comprese le endospore di Bacillus e Clostridium).
 DEVE essere assoluta In un laboratorio di microbiologia. Nelle
industrie alimentari è un concetto statistico (tempi di riduzione
decimale).
 Il più usato ed efficace strumento per sterilizzare è il CALORE
 PERCHÉ? Perché le proteine denaturano
 Lo strumento principale di sterilizzazione in microbiologia è:
 L’AUTOCLAVE: sterilizza attraverso il vapore sotto pressione

(assai più efficace del CALORE secco)

 L’AUTOCLAVE

 sovrapressione di 1atm =
121°C;
tempo di 15 minuti
 il vapore deve poter entrare
in contatto con le soluzioni
(tappi di cotone; bottiglie aperte)

 P/T minori e
tempi maggiori per
limitare il danno ai composti organici
(imbrunimento, caramellizzazione)
 N.B.: Molti zuccheri e
gli antibiotici devono essere sterilizzati per
filtrazione
 LAVORARE IN STERILITÀ

 Pipette
 Ansa
 Spatola
 Becco Bunsen
 Si lavora con fiamma ossidante

(azzurra, più calda, più stabile),

 NON riducente (gialla)
 Tutti i terreni di coltura dovrebbero essere controllati
prima dell'uso per contaminazione e data di scadenza.
 L’area iniziale di semina deve ricoprire una superficie
compresa fra un terzo ed un quarto dell’area
complessiva dell’agar utilizzato. Possono essere
utilizzate in funzione delle circostanze piastre intere,
a metà od a quattro settori. I campioni devono essere
seminati per ottenere colonie isolate, o diffusi
direttamente su un intera porzione di una piastra e
posti ad incubare senza successiva diffusione del
materiale.
 Le anse metalliche devono essere flambate portando la loro estremità nella
parte inferiore della fiamma di un Bunsen fino a che l’intera ansa non
assume colore rosso per il calore. Riporle a raffreddare su un supporto
prima del loro utilizzo. Ciò può essere eseguito prima e dopo il loro
utilizzo e fra la semina di piastre di agar.
 E’ consuetudine utilizzare due anse per consentire un adeguato
raffreddamento di ciascuna dopo la flambatura mentre si sta utilizzando
l’altra ansa. Possono essere utilizzate per ciascuna piastra anse monouso
diverse. Le anse di metallo devono essere riscaldate con la fiamma di un
Bunsen con la parte terminale dell’ansa rivolta verso basso fino ad
arroventarsi, poi rimosse e lasciate raffreddare.
 Tutti i terreni devono essere incubati il più presto possibile. La piastre per
l’incubazione anaerobica devono essere incubate il più presto possibile per
prevenire la perdita di vitalità
 TECNICA ASETTICA

 Quando si manipolano campioni o culture, la tecnica

asettica risulta importante per evitare la loro
contaminazione e proteggere chi lavora da infezione
proveniente dal campione.
 Se il lavoro viene svolto su un banco aperto, uno
sterilizzatore Bunsen dovrebbe essere collocato in
stretta prossimità per flambare le anse o i fili
metallici.
 · Quando si aprono i contenitori delle culture
mantenere il campioni lontano dal viso
 INCUBAZIONE DEI
MICRORGANISMI

 I brodi o i terreni agarizzati seminati devono essere posti ad una

TEMPERATURA, per un TEMPO e nelle CONDIZIONI ottimali per
permettere la crescita del microrganismo con sui si sta lavorando
 Esempi:
 Bacillus stearothermophilus
 G+, anaerobio facoltativo, termofilo
 Bifidobacterium bifidum
 G+, anaerobio stretto, mesofilo
 Incubazione a 60°C per 8-12 h Incubazione a 37°C per 36-48 h
 Le piastre vanno incubate in posizione capovolta.
 Scrivere nome, data e tipo di contenuto