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BiologiaMolecolaredegli Biologia Molecolare degli Eucarioti

Dott.ssaRenataTisi VpianoU4 Tel.0264483522

Lorganismomodellopisempliceper lecelluleeucarioti:illievito
Il li i un microrganismo unicellulare appartenente lievito i i i ll l al regno dei Funghi. Gli ascomiceti (li iti) pi studiati e i i ti i ti (lieviti) i t di ti impiegati industrialmente appartengono al genere Saccharomyces (nella produzione di bevande alcoliche alcoliche, lievito da pane, autolisati ed estratti, alcuni enzimi) e al g genere Candida (utilizzato come fonte di proteine). ( p ) I lieviti sono molto diffusi in natura e facilmente isolabili in laboratorio per la loro capacit di dare colonie caratteristiche su terreni colturali che possono essere resi selettivi

I lieviti preferiscono terreni colturali ricchi in zuccheri e hanno spesso esigenze per alcune vitamine e aminoacidi. p g p Per quanto riguarda il fabbisogno di ossigeno, il loro comportamento varia da specie a specie: i saccaromiceti, ad esempio sono tutti anaerobi facoltativi esempio, facoltativi.
temperatura ottimale di crescita tra i 20 e i 30C p pH ottimale intorno a 4,55,5. Le dimensioni sono molto , , variabili e vanno da pochi a 2030 di lunghezza. Tutte le cellule sono fornite di una parete

OggettodistudioeorganismomodelloSaccharomyces Oggetto di studio e organismo modello Saccharomyces cerevisiae,ilcuigenomastatosequenziatoperintero nel1996.

Il lievito Saccharomyces cerevisiae una specie eucariotica monocellulare, facile da manipolare e rapida nella crescita. Inoltre, un microrganismo riconosciuto come GRAS (G i i i i t (Generally R ll Recognized A S f ) i d As Safe). E un lievito fermentativo: anche in presenza di ossigeno, la quasi totalit del glucosio nel terreno viene consumata attraverso la fermentazione > effetto C bt ff tt Crabtree o repressione d glucosio, e l respirazione i d tt solo i da l i la i i indotta l a livelli molto bassi dello zucchero.
In particolare, concentrazioni di glucosio superiori a 0,25 g/L operano una repressione reversibile sulla biosintesi del citocromo A.

Shift diauxico

Fasedilag

Faseesponenziale

In campo biotecnologico ed alimentare vengono richieste grandi quantit di proteine alcune delle quali sono difficilmente reperibili in natura: grazie proteine, alla tecnologia del DNA ricombinante stato possibile introdurre del DNA eterologo in alcuni organismi, appositamente selezionati, per ottenere la sintesi di prodotti eterologhi eterologhi. S. cerevisiae capace di attuare la maggior parte delle modificazioni post traduzionali necessarie per la produzione di proteine di mammiferi biologicamente attive Presenta comunque alcuni svantaggi: infatti la resa attive. infatti, del prodotto solo dell 15% rispetto al totale e le proteine secrete, inoltre, subiscono spesso una iperglicosilazione, causa di eventuali diminuzioni dellattivit biologica. g Es.produzionedirennina(componenteattivadelcaglio;van der Berg et al.1990) al 1990) produzionedigalattosidasi ovina(Rocha et al.1996) dialbuminasericaumana(Fleer et al.1991a) diinterleuchina1umana(Fleer et al.1991b) Diglucoamilasi fungina(Buiet al.1997) di xilanasi termostabile batterica (Walsh e Berquist 1997) dixilanasi termostabilebatterica(Walsh eBerquist,1997)

Lievitocomemodello Lievito come modello


Vengonostudiatiprincipalmentetretipidilieviti di i i i l i i di li i i Saccharomyces cerevisiae:budding yeast. Importantecommercialmentenella fermentazionealcolicaenellapanificazione. p Schizosaccharomyces pombe:fission yeast. Principalmenteusatoinricerca,originariamente Principalmente usato in ricerca originariamente identificatonellabirraafricana. Candidaalbicans:fungopatogenico associatoa Candida albicans: fungo patogenico associato a pazientiimmunocompromessi.

Lievitogemmanteelievitoafissione Lievito gemmante e lievito a fissione

cellulamadre

cellulafiglia

g gemma

vacuolo

nucleo

paretecellulare

settodiseparazione

Ciclovitaledellievitogemmante Ciclo vitale del lievito gemmante

Lostatodiploideproteggedallemutazioni Lo stato diploide protegge dalle mutazioni


Le cellule aploidi h ll l l d hanno una singola copia d ogni gene. Mutazioni l di inattivanti in geni essenziali sono perci letali. Nelle cellule diploidi si pu invece avere una situazione di eterozigosi per p p g p cui le mutazioni inattivanti in geni essenziali non sono letali e possono essere ottenute e propagate. La segregazione degli alleli durante la sporulazione mette poi in evidenza il fenotipo terminale associato alla p letalit.

Analisidelletetradi

S.cerevisiae eglistudidifunzione g

cloning by functional complementation

Cloning by functional complementation

Perclonaregenieterologhi dimammiferoinS.cerevisiae occorreeliminaregliintroni,chesonorariinlievito.Siprepara occorre eliminare gli introni che sono rari in lievito Si prepara unabancadiespressionedicDNA.

Libreriedimutantiincellule aploidi
Interecollezioni(LIBRERIE)di mutantipossonoesseregenerate tramiteclassicimetodidi mutagenesi: agentichimici ad a o radiazioni Imutantipossonopoiessereisolati tramitescreeningdicrescitain tramite screening di crescita in condizionirestrittive

Imutantipossonoessereincrociatipermappare igeniestudiarnelerelazionigenetiche
medianteanalisidelletetradi(prodotto dellemeiosi)possiamodeterminaresei duegenisonolinked ecalcolarela due geni sono linked e calcolare la distanzagenetica dall analisi dallanalisi del fenotipo dei doppi mutanti si possono stabilire le relazioni genetiche tra i geni mutati (effetto additivo dei difetti, soppressione di fenotipi etc.)

Ex.mutants impaired ingrowth ongalactose as acarbon source p g g

Illievitocomemodello:ilciclocellulare

START

LaviadiRasedellaPKA
Ras2p p
GDP

Cdc25p, Sdc25p Ira1,2p

Ras2p p
GTP

ClonaggiodiGEFs daaltri organismi

LeproteineRasincelluledimammifero

StudiodellecascateMAPchinasiche:la coniugazione i i

Viaditrasduzionedelsegnale Via di trasduzione del segnale


Identificazionedimutantinella Identificazione di mutanti nella coniugazione Dissezionegeneticadelpathway
Studibiochimicisulleattivitele interazionideiprodottigenici

Specificitdelsegnaleeproteinescaffold Specificit del segnale e proteine scaffold


s

Aging
By following the mothercell y g pedigree microscopically over many generations, changes in phenotype are observed, including cell enlargement and sterility. This process leads to a loss of division potential after about 20 divisions yielding a senescent mother cell that has a blebby, wrinkled appearance

Aging
Saggi di longevit: longevit replicativa: una cellula newborn viene fatta replicare su supporto solido, e le figlie vengono rimosse per micromanipolazione; il numero di figlie prodotte una misura della RLS (replicative life span) longevit cronologica: le cellule vengono mantenute in uno stato di quiescenza attraverso carenza di nutrienti;
Periodicamente, delle aliquote vengono testate per la capacit di riprendere a germinare tramite deposizione su supporto solido Il tempo necessario per perdere tale solido. capacit la chronological life span (CLS). g Questo modello ha fornito informazioni sul coinvolgimento della via di trasduzione del segnale di Ras, dei ROS (radicali liberi derivanti dallossigeno), della calorie restriction, della formazione di ERCs (rDNA extracromosomale) nel fenomeno dellinvecchiamento cellulare.

Sonomostratiglieffettididue diversidisaccoppianti diversi disaccoppianti mitocondriali: DNPdinitrofenolo => DNP dinitrofenolo => diminuisceilivellidiROS

CCCP=>carbonyl cyanide 3 chlorophenylidrazone,provoca unaccumulodiROS

Restrizionecaloricainlievito

Kaeberlein,Nature464,513519

TORcontrolsthegrowthofproliferatingyeast,flyandmammaliancellsinresponseto nutrients

complex2(TORC2)containsTor2butnotTor1andcontrolspolarityoftheactin cytoskeletonviatheRho1/Pkc1/MAPKcellintegritycascade

Nervousyeast:modelingneurotoxic celldeath
reviewonTIBSVolume35,Issue3,March2010,Pages135 144 review on TIBS Volume 35, Issue 3, March 2010, Pages 135144

L espressione diproteine Lespressione di proteine neurotossiche pu portare a diverseforme distress cellulare,quali l attivazione cellulare, quali lattivazione della risposta allo shocktermico, stressmitocondriale edellER,o anche stressossidativo (viaROS) ( ) edisfunzioni vacuolari e dellautofagia.Tali stress possono attivare diversi pathwaydimorte cellulare che coinvolgono Yca1p,Aif1p,eil citocromo c.

Gli oligomeri amiloidi extracellulari causano tossicit in lievito. La proteina amiloide intracellulare stabile solo se fusa ad un tag di grandi dimensioni, come la GFP, e induce una risposta di heat shock. loverespressione di sinucleina in lievito inibisce il traffico vescicolare tra ER e Golgi, che pu essere ovviato dalloverespressione della piccola GTPasi, Ypt1p. Lapoptosi legata a stress ossidativo (via ROS), notevole danno mitocondriale e stress dellER a causa del difetto di trafficking. Yca1p contribuisce alla morte cellulare solo durante la fase di crescita esponenziale. le proteine poliQ formano oligomeri chaperone e prionedipendenti e aggregati simili a fibrille, causando danni ai mitocondri e all ER, provocando stress ossidativo e morte cellulare. Gli aggregati oligomerici possono essere detossificati dal trasporto in zone di raccolta perinucleari e perivacuolari attraverso la proteina di controllo qualit dellER Cdc48p. la fosforilazione di tau umana espressa in lievito dipende da Pho85p e Mds1p, gli omologhi in lievito delle chinasi di tau umane. Tau forma filamenti in lievito, ma ha un effetto trascurabile sulla sopravvivenza. lespressione di TDP43 umana in lievito causa aggregazioni nucleari e citoplasmatiche, rallentamenti della crescita e maggior mortalit. I meccanismi molecolari di tali effetti rimangono elusivi.

Evaluationofgrowth,survivalandcelldeath uponexpressionofneurotoxic proteins.The flowchartillustratesthemultipleexperimental approachestotheanalysisofneurotoxicityand h h l f d neurotoxic celldeathandcellstressinyeast.

BiologiaMolecolaredellievito g
Metodiditrasformazionedellievito: t f trasformazionediPROTOPLASTI i di PROTOPLASTI trasformazioneconLITIOACETATO ELETTROPORAZIONE

Ilplasmide2micron p
S. S cerevisiae e molti altri lieviti presentano naturalmente delle molecole di DNA extracromosomali. Il DNA esogeno pu essere quindi mantenuto facilmente in questa forma. Il plasmide 2 una molecola di DNA circolare di 6.3 kb, extracromosomale, che si trova nel nucleo della maggior parte dei ceppi di Saccharomyces cerevisiae. Non d apparentemente nessun vantaggio selettivo Viene mantenuto in un numero di copie da 50 a 100 per genoma aploide E rivestito d nucleosomi come il genoma e viene replicato una di l l l volta per ciclo a partire da unorigine di replicazione autonoma (ARS)

Lalto numero di copie del plasmide 2u pone due problemi: come si possono accumulare tante copie della molecola se la sua replicazione viene iniziata una sola volta per ogni ciclo l l l l cellulare? come vengono di t ib it l copie t madre e fi li alla distribuite le i tra d figlia ll divisione cellulare?

The2ucirclehastwocopiesofa599bp invertedrepeatsequence(called "flip"sites)andencodesasitedirectedrecombinase calledFLP(the"flip" protein)thatpromotesrecombinationbetweentheserepeats. Recombinationbetweentheflipsequencesinvertstheadjacentregionsof theplasmidasshowninthefigurebelow. the plasmid as shown in the figure below.
"flip"sites p

"flip"sites

Replicazionedi2micron:rolling Replicazione di 2 micron: rolling circle

A model for the role of the cohesin complex in the segregation of the 2 micron plasmid.
Mehta S et al. J Cell Biol 2002;158:625-637

Cohesinmediated pairingofreplicated pairing of replicated plasmidclustersoccurs duringtheSphaseas doesthepairingofsister chromatids.Theplasmid clustersaretetheredto clusters are tethered to sisterchromatids,likely byacohesin independent mechanism.

Cohesinmediatedpairing p g andunpairing arecommon tothechromosomesand theplasmidclustersasin A.Theplasmidsare partitioned,however, partitioned however withoutphysical attachmenttothe chromosomes.

2002 Rockefeller University Press

Ivettoriperlievito:originidireplicazione
Per i vettori extracromosomali necessaria una sequenza autonoma di replicazione che pu essere: ARS (Autonomous Replication Sequence) isolata dal genoma consente la genoma, replicazione; CEN: contiene un centromero cromosomico, si trova in vettori YCp (yeast centromeric plasmid); 2 : una parte della sequenza del plasmide naturale 2 micron; in vettori YEp (yeast episomal plasmid); I plasmidi originless: YIp (yeast integrating plasmid) non possono replicarsi autonomamente, devono integrarsi nel cromosoma di lievito.

Sitrattasempredivettorishuttle,cioin gradodiesseremantenutiinlievitoma grado di essere mantenuti in lievito ma anchediesserereplicatiinE.coli,ospite dielezioneperlamaggiorpartedelle proceduredellatecnologiadelDNA d d ll t l i d l DNA ricombinante.

Trasformazioneintegrativa Trasformazione integrativa

Permantenereunaltonumerodi P t lt di copie: Leu2d=>geneparzialmente Leu2d => gene parzialmente difettoso,induceselezionedei cloniconaltonumerodicopie delplasmidepercuiilprodotto del plasmide per cui il prodotto diLeu2driesceacomplementare lafunzioneepermettelacrescita

Marcatoridominanti
Agentetossico Marcatore Aminoglucoside3 fosfotransferasi ( f f f (Gene KanR) Igromicina B Fosfotransferasi (Gene hph) GeneZeo/ble da Streptoalloteichus hindustanus Genenat

G418(Geneticina) ( )

cassettadiespressionederivante cassetta di espressione derivante dauntrasposone diE.coli Aminoglicosidi:inibisconola sintesiproteicacausandoerroridi riconoscimentodeicodoni Glicopeptidi:intercalanoilDNA causandonelaframmentazione

Igromicina B

Zeocina/fleomicina/ bleomicina Nurseotricina

ADE1 e ADE2 I geni ADE1 and ADE2 codificano per la fosforibosilaminoimidazolo fosforibosilamino imidazolo succinocarbozamide sintetasi e la fosforibosilaminoimidazolocarbossilasi, rispettivamente, due enzimi della via biosintetica dell adenina. I mutanti ade1 e ade2 producono un pigmento rosso apparentemente d i t t ti d 1 d 2 d i t t t derivato dalla polimerizzazione dellintermedio fosforibosilaminoimidazolo (AIR). Quindi ceppi ade2 sono rossi, mentre gli ade3 e il doppio mutante ade2 ade3 sono bianchi.

ADE3 encodes for acytoplasmic trifunctional enzyme C1 tetrahydrofolatesynthase

La pigmentazione rossa dei mutanti ade1 e ade2, e la reversione della colorazione da parte della mutazione ade3, sono stati utilizzati per la creazione di diversi test genetici di stabilit genomica, plasmidica e nello studio dei sistemi di ripartizione dei cromosomi. ade2ade3background

YRp with ADE3and essential gene

intheessential gene

redwhite sectored colonies

Two steps genereplacement gene replacement

Genedisruptionandsinglestepgenereplacement
TheYFG1+ geneisdisruptedbytransformingthe strainwithalinearfragmentcontainingaURA3 selectablemarkerflankedbyhomologoussequences. ThechromosomalsegmentisreplacedbythisURA3 h h l l db h containingfragmentafterintegrationbyhomologous recombinationatthetwoends. TheURA3 markerintroducedintheYFG1 locus,can beexcisedifURA3 isalsoflankedbydirectrepeatsof DNA,preferablynotoriginatingfromyeast. Homologousrecombinants,selectiononFOA medium,lacktheURA3 markerandretainasingle copyoftherepeatedDNA. g pg p Singlestepgenereplacementofmutantalleles,such asyfg11,canbecarriedoutbyfirstreplacingthe YFG1 genebyURA3,transformingthestrainwith linearfragmentencompassingtheyfg11 mutation, andselectingtransformants onFOAmedium,inwhich URA3 isreplacedbyyfg11.

Genereplacement Gene replacement

Plasmid shuffling
The chromosomal copy of YFG1 is replaced by the yfg1 deletion, but the Yfg+ phenotype is maintained by the YCp plasmid containing YFG1 and URA3. The strain is transformed with a mutagenized LEU2 plasmid having the YFG1 gene. R Recessive yfg1x mutations are i f 1 t ti manifested by selecting for strains on FOA medium. The strain will not grow on FOA medium if YFG1 is an essential gene and if the yfg1x mutation is not functional.

Comesipurivelarechetipodiintegrazioneavvenuta?
Southern blot PCRsuDNAgenomico

Southern blot:richiamo

singolocrossingover g g

genereplacement

ricombinazione nonomologa

VerificadelezionegenicatramitePCRsuDNAgenomico Verifica delezione genica tramite PCR su DNA genomico

Yeast Artificial Chromosome (YAC)

ClonareinunoYAC

Ilceppoospitemutatoin ade2 ecan1 (arginina permeasi:trasporta anchelacanavanina,chetossica) InpresenzadeltRNA soppressoreSUP4 le mutazioninonsensodeiduemarcatori sonosoppresse ilceppodiventaade+ eritornasensibile allacanavanina

Ipromotoridilievito

Allison,Fondamentidibiologiamolecolare,ed.Zanichelli

Ipromotoridilievito:studiodelleUAS

URSupstream regulatory sequence UASupstream activating sequence

Promotoridieucariotisuperiori Promotori di eucarioti superiori


Enhancers : vi si legano specifici :visileganospecifici fattoriditrascrizione,chealoro voltainteragisconoconifattori ditrascrizionepostisul di t ii ti l promotoreeconlaRNA polimerasi. agisconoadistanzemolto ampie agisconoinentrambigli orientamenti effettiindipendentidalla p posizione(amonteoavalledel gene)

Promotoricostitutivi
Promotore PGK(phospholycerate kinase) k ) GAPDH(glyceraldehyde3 phosphatedehydrogenase) ENO1,ENO2 TPI(triose TPI (triose phosphate isomerase) ADH1(alcohol dehydrogenase I) Caratteristiche Efficiente/2 5%glucosio Efficiente/25% glucosio Efficiente/25%glucosio Efficiente/25%glucosio Efficiente/25%glucosio ff / l moderat.efficiente/25% glucosio

Promotoriinducibili Promotori inducibili


Promotore GAL1GAL10(galactokinase GAL1 GAL10 (galactokinase UDPGal epimerase) ( p p ) PHO5(acidphosphatase) CUP1(metallothionein) CYC1 (Cyt. c1) ADH2(alcohol dehydrogenase II) d h d Caratteristiche Efficiente/galattosio Moderat.Efficiente/inibito daPi d Pi Moderat.Efficiente/Cu Reprimibiledaglucosio Efficiente/0.10.2%glucosio / g

Promotoriinducibili
GAL1 Promoter The most commonlyused regulated promoter for yeast studies is PGAL1. There are two regulatory proteins, Gal4p and Gal80p, which effect the transcription of the indicated structural genes:

Gal80 binds to Gal4, repressing its transactivation activity. Gal3p appears to be required for the production of the intracellular inducer from galactose. The UAS of the divergently transcribed GAL1 and GAL10 is contained within a 365bp g y p fragment, denoted UASGAL. The sequence responsible for glucosedependent repression is URSGLC.

GAL1 Promoter The most commonlyused regulated promoter for yeast studies is PGAL1.

glucose repression

g galactose induction

PGAL1 is sufficient for maximal galactose induction and thorough glucose repression. PGAL1 can rapidly induce the expression of downstream fusedgenes over 1000fold after the fused genes 1000 fold addition of galactose to cells growing in media with a nonfermentable carbon source. Furthermore, PGAL1 can be turned off by the addition of glucose to the galactose containing medium.

ProprietdiGal4 p

duedominiindipendentiperlegameal DNA(BD)etransattivazione (AD) illegamediGal4alDNAinibitodalla presenzadiglucosionelmezzo

Mig1

ExperimentstomaptheDNAbindingand activationdomainofyeastGAL4 activation domain of yeast GAL4 protein

Esperimentodiscambiodeidomini BDeADtraGal4eLexA

Il repressore LexA inibisce i geni coinvolti nella la risposta SOS, che codificano per le DNA polimerasi preposte al riparo d l DNA. l del In caso di danni al DNA RecA si lega a LexA sui suoi siti di legame sul DNA causandone l t d lautoproteolisi. t li i

Induzionedagalattosio

Repressionedaglucosio

M.RubioTexeira /FEMSYeastResearch5(2005)11151128

M.RubioTexeira /FEMSYeastResearch5(2005)11151128

Aploinsufficienza:screeninggeneticobasatosul dosaggiogeniconeidiploidieterozigoti

(herpessimplexvirus)

es.

Notabene:ildominioattivatorediVP16rendeiltTA unattivatoretrascrizionale, nonostanteildominioDNAbinding provengadaunrepressore nonostante il dominio DNA binding provenga da un repressore

ThepTetOffAdvancedvectorconstitutively expressesthetetracyclinecontrolled transcriptionaltransactivator,TetOff Advanced.Thisengineeredproteinconsists oftheE.coliTetR proteinfusedtothree minimal"Ftypeactivationdomainsderived i i l "F t ti ti d i d i d fromtheherpessimplexvirusVP16protein (Baronetal.,1997,Triezenberg etal.,1988).

ThePTight compositepromoterwas originallydevelopedasthePtet14 promoterinthelaboratoryofDr. H.Bujard andconsistsofa modifiedTetResponsiveElement (TREmod)containing7direct repeatsofthetet operator sequence,tetO,whichisjoinedto aminimalCMVpromoter(PCMV) (Clontechniques,April2003). ( l h l )

TetOff: The TRE is located upstream of the minimal immediate early promoter of cytomegalovirus (PminCMV) which is silent in the absence of activation tTA binds the (PminCMV), activation. TREand thereby activates transcription of Gene Xin the absence of Tc or Dox.

Cineticadi induzione/repressione
HeLa S3TetOff trasfettate conplasmide recantecoding sequence perBcl2sotto promotoreTRE. RepressioneconTetraciclinaalle concentrazioniindicate.Westernblot.

CelluleCHOesprimentitTA sonostate trasfettate conuncostruttoper lespressionedellaluciferasi sotto promotoreTRECMV.

TetOff switched offinthe


presence of theTet/Dox

TetOn T O switched oninthe


presence of theTet/Dox

TetOn: The reverse Tet repressor (rTetR) was created by four amino acid changes that p p g , reverse the proteins response to Dox. As a result of these changes, the rTetR domain of rtTA binds the TRE and activates transcription in the presence of Dox.

Regolazionemoltoefficace:inpresenzadiDox,tTA nonsilegaalmotivo TREdandounatrascrizionebasalemoltobassa TRE dando una trascrizione basale molto bassa altaspecificit:illegamedeltTA specificoperilpromotoretetO Dox eTet nonhannoalcuneffettonotosueucarioti Altaerapidaresponsivit :anchedimigliaiadivoltein30min,manon sempreriproducibileinognisistemacellulare Nota:ilsistemaTetOff rispondeaDox eTet,ilTetOn soloaDox Isistemiaregolazionepositivasonoingenerepifacilidamantenere completamentespentiedaaccendererapidamente completamente spenti e da accendere rapidamente IsistemiTet sonoutiliperlacreazioneditopitransgenici reversibilmenteinducibili

IlsistemaTet Off funziona Il sistema TetOff funziona perfettamenteancheneimammiferi,sia incelluleincolturacheinorganismiin toto,epuessereresotessuto specifico. toto, e pu essere reso tessutospecifico.

Watsonet al.,DNAricombinante2,Zanichelli

Yeast as a toolkit

Sistemideidueibridi
Powerful methods, denoted twohybrid systems, have been designed for screening and investigating interacting proteins. B i t ti t i Because of th ease of th f the f the assay, exploratory twohybrid screens are usually the first method of choice when information of interacting proteins are desired desired. (A) Normally, the Gal4 transcription activator binds to t DNA at th G l4 bi di t the Gal4p binding sites and activates it d ti t transcription of the lacZ reporter gene. (B) A hybrid of the Gal4 activation domain with the Yfg2 protein does not activate transcription because it does not localize at the Gal4 binding site. (C) A hybrid of the Gal4 DNAbinding site domain with the Yfg1 protein does not activate transcription of the reporter gene because of the lack of the transcriptional activation domain. (D) Proteinprotein interaction between Yfg1p and Yfg2p reconstitutes Gal4p function and activates transcription of the reporter gene.

GenereporterLacZ
The Escherichia coli lacZ gene which encodes galactosidase is the most commonly used reporter gene, galactosidase, with yeast and other systems; its activity can be assayed semiquantitatively on plates by the differential staining of colonies using Xgal (5bromo4chloro3indolylbDgalactoside) and fully quantitatively by enzyme assay of liquid cultures on ONPG or CPRG.

Twohybrid:protein interactions (not membraneproteins)

sistema LexA

human PKC C1domain legaDAG lega DAG rat RafC1domain legasmall lega small Gproteins

domainshuffling

3ATisacompetitiveinhibitoroftheHis3enzymeandonlybaitsthat exhibitgoodactivationofHIS3 reportertranscriptionwillbeableto growinthepresenceofthiscompound.

Criticitdelsistemadeldoppioibrido
FALSI NEGATIVI : non rileva interazioni deboli o transienti; non
si pu utilizzare con proteine che non possano localizzare nel comparto nucleare;

FALSI POSITIVI : un ibrido BD con una proteina acida pu


funzionare da transattivatore anche da solo; la trascrizione basale del d l reporter HIS3 non completamente assente => occorre t l t t t azzerarla con linibitore 3AM

Lanalisi richiede SEMPRE una validazione con altro metodo (es. coimmunoprecipitazione)

Coimmunoprecipitation

Onehybrid:BDorADfunctions

Threehybrid:adaptor proteins/chemicals

Membranerecruitment assay:Rasrescue cyto TRAP assay


LafusioneBaithSos pusopprimerela p pp letalitcondizionalediunmutantecdc25 ts solosereclutatainmembrana

inducible expression

YeastGFP :localization database