REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE

Cominciamo con un poco di numeri:

2% del genoma codifica per proteine
30% comprende sequenze in cis(che stanno cioè sul DNA) che regolano la trascrizione
10% elementi in trans(proteine sintetizzate che poi agiscono sul DNA) che regolano la
trascrizione. La maggior parte di questi lega il DNA in maniera sequenza specifica.
Ogni gene viene finemente regolato sia nel suo stato ON/OFF che nell’intensità dell’espressione
del gene stesso.
I fattori trascrizionali sono sicuramente uno degli attori di questo complicato sistema, quello a cui
siamo maggiormente abituati, ma non sono gli unici infatti essi utilizzano:
Proteine che legano il DNA in maniera sequenza specifica
Co-regolatori(attivatori e repressori)
Fattori di rimodellamento della cromatina ATP- dipendenti(ex SWI)
Enzimi che modificano gli istoni (HAT ed HMT)
Enzimi che modificano i F.trascrizionali ecc.
Il modo con cui viene regolata la trascrizione negli eucarioti è differente dai procarioti. Questi per
accelerare i tempi di replicazione hanno dovuto rinunciare ad alcun cose, ed hanno rinunciato ad
una fine regolazione della trascrizione. La trascrizione viene regolata ma i fattori che intervengono
sono minori.

Alcuni cenni sulla trascrizione.

In Biologia molecolare, la trascrizione è il processo mediante il quale le informazioni contenute nel
DNA vengono trascritte enzimaticamente in una molecola complementare di RNA.
La trascrizione presenta un meccanismo di controllo della fedeltà (o proofreading), ma esso è molto
meno efficace di quelli legati alla replicazione del DNA.Lo stesso meccanismo di sintesi dell'RNA,
nel quale l'enzima RNA polimerasi ha un ruolo centrale, comporta un numero di errori decisamente
maggiore.

La trascrizione consta essenzialmente di tre fasi: l'iniziazione, l'allungamento e la terminazione.

Dato l'elevato numero di geni presenti in un organismo eucariote, la trascrizione è un meccanismo
molto complesso perché necessita di un sistema di regolazione complicato che agisca su più livelli.
La complessità del genoma eucariocito è tale da giustificare la presenza di 3 RNA Polimerasi e dei
sistemi di regolazione che regolano , appunto, la funzionalità di questi enzimi.

Prima fase: legame con la TBP

Il riconoscimento del promotore da parte della proteinaTBP. Tutto ciò vale solo nei geni con
l'elemento TATA(infatti TBP sta per TATA binding protein). La TBP ha la funzione di produrre
due forti piegature al DNA (o kink) a livello della sequenza TATA che inducono in questo punto un
angolo di circa 90°. Questo forte angolo non sarà la causa dell’apertura del promotore ma ha la
funzione di allargare i solchi maggiori al fine di favorire una migliore interazioni delle altre proteine
del complesso di attivazione basale.

Seconda fase: assemblaggio del complesso DAB

La TBP intercetta la sequenza TATA spesso legata ad altri fattori chiamati TAF's, e in questa forma
viene chiamata TFIID (“TBP+TAF's” = TFIID)per formare il complesso di inizio preliminare. A
questo punto la topologia del DNA è tale da poter reclutare altri fattori di trascrizione ovvero il
TFIIA e il TFIIB. Tale complesso trimerico TBP TFIIA TFIIB e chiamato anche DAB. Il
complesso DAB così assemblato è capace di legare un quarto fattore di trascrizione che porta con se
la RNA Polimerasi II che è TFIIF. La funzione di TFIIF è quella di permettere il riconoscimento del
promotore alla RNA Polimerasi II.

Terza fase: superamento dello stallo

Quando TFIIF porta la RNA Polimerasi II sul promotore essa interagisce con la coda carbossi
terminale alla TBP. Tale interazione richiama sulla TBP altri 2 fattori di trascrizione la TFIIE e
TFIIH, la prima ha attività elicasica mentre la seconda attività chinasica sulla RNA Polimerasi II,
queste reazioni causano rispettivamente un’allargamento della bolla di trascrizione e un
cambiamento conformazionale alla RNA Polimerasi II che se opportunamente fosforilata nella
regione C-Terminale supera la fase di stallo e inizia a diventare processiva.

Quarta fase: pulizia del promotore e allungamento

Nelle prime fasi la velocità di trascrizione non può essere elevata a causa delle forti interazioni con
tutti gli altri fattori ancora legati alla RNA Polimerasi II. La fase di pulizia del promotore avviene
grazie al rilascio del DAB e di TFIIF che avevano inizialmente il solo ruolo di stabilizzare il
complesso di inizio. Tale rilascio avviene grazie a opportune fosforilazioni/defosforilazioni della
RNA Polimerasi II a livello del dominio C-Terminale che potremmo definire una sorta di pannello
di controllo su cui accedono molti altri regolatori della trascrizioni sia in fasi precoci che tardive.

Quinta fase: terminazione.

Procarioti

Eucarioti
Dalla figura è abbastanza chiaro di come il processo di trascrizione e di regolazione della
trascrizione sia estremamente semplice nei procarioti. Le poche regioni regolative superstiti servono
per la sopravvivenza.

Fatto questo accenno alla trascrizione negli eucatioti possiamo dire che il processo di assemblaggio
di questo macchinario può avvenire in 3 modi:
COSTITUTIVAMENTE: per geni che in ogni tempo ed in ogni condizioni devono essere
trascritti;
REGOLATA: per geni che devono essere trascritti solo in determinate condizioni;
MAI: geni che sono spenti e quindi mai trascritti.
Sono presenti molti elementi di regolazione sia a valle che a monte del promotore, siti di legame per
proteine che funzionano come repressori, attivatori o repressori/attivatori della trascrizione. Ma un
momento fondamentale, senza il quale tutto ciò non potrebbe mai verificarsi, è il rimodellamento
della cromatina.
Se ci concentriamo maggiormente sui fattori trascrzionali ci rendiamo conto che essi sono degli
oggetti che non hanno cognizione di quello che fanno, la loro funzione è dettata dalla loro forma e
dalla capacità di cambiare forma, chi detta questi cambiamenti conformazionali sono le interazioni
covalenti e non che queste proteine stabiliscono con altre molecole vicine. La regolazione
trascrizionale viene definita di tipo combinatoriale per cui la regolazione della espressione di un
gene viene fatta da più proteine. I F.trascrizionali dimerizzano ed agiscono in maniera sincrona con
elementi in CIS sul DNA.
Raramente in F.trascrizionali che legano il DNA in maniera sequenza specifica hanno una attività
enzimatica in sé, nella maggior parte dei casi questi fattori reclutano proteine che non interagiscono
direttamente con il DNA ma sono dotate della attività regolatoria vera e propria. Per cui oltre che
combinatoriale la regolazione della trascrizione è anche modulare .
Ma i F.trascrizionali possono fare ben poco se il DNA è riluttante nell’interagire con loro, se è
condensanto al max. Quindi un altro meccanismo, il principale, di attivazione e repressione della
trascrizione si basa sul grado di accessibilità della cromatina.
Il DNA si addensa in livelli maggiori fino ad arrivare ad uno stato di condensazione tale da non
vederlo bene nemmeno al microscopio. Questa struttura non è casuale , dobbiamo pensare che il
DNA è estremamente delicato quindi lo stato di ipercondensazione lo protegge da eventuali danni
meccancici. Il DNA , data la sua delicatezza deve essere esposto solo in casi strettamente necessari,
per la replicazione, per la trascrizione e per riparare eventuali danni al DNA.
La cromatina è costituita da nucelosomi(istoni attorno a cui sono avvolti un giro e un poco di DNA.
Il giro e un poco di DNA attorno all’istone è circa 140bp) 13 nm
Bene tutto questo casinotto per arrivare a parlare degli ISTONI . Gli istoni sono delle proteine
terminalmente evolute, hanno portato a termine il loro processo evolutivo per cui se guardiamo gli
istoni di lievito questi sono uguali ai nostri. Inoltre gli istoni svolgono in tutti gli esseri la stessa
funzione e sono identici ,quindi uguale è anche il DNA , dato che la loro unica funzione è quella di
legare il DNA. Sono delle proteine globulari dalla struttura estremamente semplice. Si tratta di una
catena ad α elica lunga collegata a 2 α eliche più piccole. Questa struttura fondamentale viene
definita Histon Fold(la struttura è molto simile ad una Z) ed è presente in tutti gli istoni. Le eliche
sono importanti per formare dimeri, tetrametri ed ottametri.
H2A ed H2B formano un dimero, lo stesso fanno anche H3 ed H4. i due dimeri insieme formano un
tetrametro e i due tetrametri un ottametro. Tutti i legami sono di tipo non covalente.
Attorno all’ottamero gira il DNA. Porzione molto importante degli istoni è la coda N-terminale, è
una struttura molto flessiile ed è la parte più carica positivamente della proteina, infatti interagisce
con il DNA che è risaputamente carico negativamente. L’interazione DNA coda N-terminale
dell’istone crea una interazione molto stabile basata su legami di tipo non covalente. Infatti tra il
DNA e gli istoni si creano interazioni tipo legame a H , e tra il DNA e la coda N-terminale si creano
dei ponti salini.
La sequenza di Dna che lega l’istone è differente dalla sequenza di DNA che lega i vari nucleosomi
tra di loro. La sequenza di legame agli istoni è più ricca di coppie AT-TA anziché GC-CG perché le
basi A e T consentono una maggiore flessibilità e quindi il DNA può più facilmente ripiegarsi ed
assumere la struttura elicoidale. Non a caso la coda N-terminale è ricca in Lys – Argi- Gly –Ser-
Treo che sono aa che agevolano i movimenti ed infatti la Gly a ingombro sterico pari a zero.
Le cariche positive dell’Arg e della Lys vengono coperte (le lisine soltanto vengono coperte dal
gruppo acetile che fa da tappo), ser e tro non sono carichi positivamente ma accettano gruppi
fosfato che sono negativi e quindi repellono il legame con il DNA.
Gli istoni H2A e H2B possono essere acetitati o fosforilati
Gli istoni H3 ed H4 sono quelli maggiormente studiati oltre ad essere quelli più complessi ed
apparentemente sembrano coloro che dettano il legame al DNA.
Le modificazioni post-traduzionali possono interessare sia la coda N-terminale che l’Histon fold e
possono essere:
Metilazione, per attivazione o repressione della trascrizione può essere mono-di e tri metilazione(su
H3 MeK4 repressione, MeK9 attivazione trascrizione). La lisina può essere mono-di e tri metilata,
la metilazione non maschera la sua carica positiva la Argina può essere mono e di metilata con i
metili tutti dallo stesso lato o su lati opposti;
Acetilazione;
Mono-ubiquitinazione: non ha alcun legame con la degradazione è una modificazione che serve a
reprimere o stimolare la trascrizione;
ADP ribosilazione;
Deiminazione(arginina diventa citrullina);
Isomerizzazione della prolina:. La prolina ha un ruolo importante, non è scelto perché ha poco
ingombro, anzi, in corrispondenza della prolina si crea un ginocchio e se la prolina passa dalla
posizione cis a quella trans cambia tutta la struttura dell’istone;
Fosforilazione di serina e treonina;
Sumoilazione.

Gli enzimi che svolgono tutte queste funzioni sono tantissimi perché sono tessuto-specifici ,
agiscono in base alla posizione del residuo da modificare (per la lys in posizione 1 per esempio
agisce un enzima differente da quello che agisce sulla lys 2 e così via) oppure sono regolati da
differenti segnali (Specificità di funzione) per cui in base ad ogni segnale viene attivato un
differente enzima. Gli attori sono molti e le spiegazioni anche.
Tra tutto questo pullulare di enzimi possiamo cmq fare una selezione di quelli maggiormente attivi,
almeno nell’ambito della Acetilazione. Gli enzimi HAT più famosi fanno parte di tre famiglie:
GNAT di cui ricordiamo PCAF;
MYST di cui ricordiamo TIP60;
P300/CBP che comprende appunto P300e CBP.
La lys è substrato accettare di gruppo acetile; il cofattore della reazione è acetilCoA.
GNAT

MYST

L’apparteenza ad una stessa famiglia dipende dal fatto che anche gli enzimi che modificano gli
istoni sono molto conservati ed hanno una struttura molto conservata. Domini molto importanti e
conservati sono il Br dominio ed il Cr dominio.
Questi enzimi vengono usati molto spessi come co-attivatori trascrizionali , ma questo non esclude
che questi stessi enzimi possano essere coinvolti anche nella soppressione della trascrizione.
Studi in vitro utilizzando enzimi ricombinanti , si potuto vedere quali sono gli istoni favoriti
nell’attività dell’enzima in questione. Questo banale esperimento ci ha consentito di capire che gli
enzimi della famiglia GNAT preferiscono generalmente l’istone H3 mentre quelli della famiglia
MYST preferiscono maggiormente H4; ci sono domini conservati CrDominio e BrDominio.
Un ruolo importante è anche quello svolto dalle HDA oltre a quello delle HAT, ma mentre di
quest’ultimi si sa molto, delle HDA si sa molto meno. Si sa che ci sono tre gruppi : I,II e IV che
sono zinco/dipendenti e strappano il gruppo Acetile ed un gruppo, il III , che non strappa l’Acetile
ma viene trasferito al NAD che diventa NICOTINAMMIDE ed un altro composto caratterizzato da
due adenosine legate da fosfati.

E’ intuitivo capire che se c’è molto NAD ossidato , gli enzimi del gruppo III lavorano meglio. Se
una cellula è in intensa attività metabolica, produce molto ATP, avrà molto NADH e poco NAD e
quindi questi enzimi saranno meno attivi e quindi anche la trascrizione genica sarà maggiore.
Quindi:
+ NADH+ metabolismo+trascrizione genica+ benessere+ radicali
prodottiinvecchiamento.
Questo schemino per dire che questi enzimi ci liberano un poco dei radicali liberi, ma per
invecchiare il più lentamente possibile dovremmo praticamente poltrire tutto il giorno(bello ma
difficile)però cmq ci evita di andare sempre al max altrimenti saremmo morti a 20 anni..
Si sono creati inibitori delle HDA e se ne stanno cercando altri migliori perché possono essere usati
per la cura del cancro. E’ chiaro che una cromatina più rilassata è maggiormente sensibile ai danni
sa radiazioni (radioterapia) quindi se inibiamo le HDA favoriamo la condizione rilassata della
cromatina. Se potessimo creare un inibitore specifico per la cellula trasformata sarebbe l’idela.

Ma come hanno fatto a studiare tutte queste, come si è visto che esistono tutte queste modificazioni
post-traduzionali.
Come si studia la cromatina?
Gli studi sulla cromatina sono cambiati , si sono evoluti nel tempo perché sono state introdotte
tecnologie sempre più all’avanguardia. Inizialmente gli studi si facevano utilizzando l’enzima
NUCLEASI MICROBICA. Si tratta di un enzima enorme che raglia il DNA ma per farlo ha
bisogno di molto spazio per posizionarsi. L’esperimento era molto semplice bastava estrarre la
cromatina da cellule e/o tessuti e metterla a contatto con questo enzima per un determinato
tempo(deciso da noi). L’enzima ovviamente lavorerà tagliando il DNA nei soli punti dove questo
non è supercondensato e gli unici punti accessibili sono quelli in corrispondenza del DNA linker(il
frammento di DNA che intercorre tra un nucleosoma e l’altro). Avremo quindi dei frammenti di
circa 140bp (la lunghezza del giro e mezzo che circonda l’istone).
A secondo del tempo di azione dell’enzima possiamo più o meno LADDER frammenti di circa
140bp o multipli di 140bp oppure , se l’enzima agisce per poco tempo possiamo avere pochissimo
ladder e una sola banda che rappresenta la cromatina non processata assolutamente. La grandezza
dei frammenti dipende ovviamente dall’accesssibilità della cromatina, se la cromatina è più acetilata
avremo maggiore digestione e quindi frammenti di grandezza inferiore ai 140bp. Con questo
esperimento possiamo vedere quale è lo stato di condensazione della cromatina di cellule differenti
o di un stessa cellula in condizioni differenti. Es: usare la Nucleari microbica su cellule non trattate
(1) e cellule trattate con inibitori delle HDA, che hanno la cro più lassa (2)
Questa tecnica è chiaramente molto grossolana, per migliorarla e renderla più precisa e più
informativa possibile dovremmo avere Ab che riconoscono precisamente un istone in una
determinata condizione di metilazione o acetilazione (.Ex l’Ab che riconosce precisamente ll’H3
metilato in posizione 14 ). Ci sono Ab che riconoscono una sola modificazione pot-traduzionale ed
enzimi che riconoscono gruppi di modificazioni a carico di uno stesso istone.
Una tecnica più avanzata e che ricorre proprio all’utilizzo di questi Ab è la tecnica CHIP.
Questa tecnica prevede una serie di passaggi che possiamo riassumente così :
Sonicazione random della cromatina prelevata da cellule o tessuti. Si cerca di ottenere
frammenti di max 1000bp per ridurre il numero di nucleosomi che ci possiamo ritrovare
dentro. In un frammento di 1000bp ce ne sono circa 7 quindi se i frammenti sono più piccolè
anche meglio;
Incubazione della cromatina con Ab che riconoscono e legano la cromatina con una
determinata modificazione post-traduzionale, selezioneremo tutti i frammenti che sono
rimasti adesi alla matrice;
I frammenti selezionati vengono immunoprecipiati dalla matrice e vengono sottoposti a PCR
con una coppia di oligo che amplifichino la regione gnomica che comprende il gene di cui
volgiamo conoscere lo stato di acetilazione degli istoni. Se abbiamo amplificazione vuol
dire che il gene sta in quella batteria di frammenti selezionati in base a quella modificazione
ed è anceh acetilato poiché si ha la amplificazione, il sistema è accessibile se non abbiamo
amplificazione vuol dire che il nostro gene non sta in quella batteria di frammenti ma sta tra
i frammenti sonicati e non positivi all’Ab e quindi non ha quella modificazione. E’ ovvio
che se i frammenti sono grandi possimoa vere un gran numero di nucelosomi di cui solo
alcuni con quella modificazione e per questo positivi all’Ab , ma altri no ,per questo si cerca
di ottenere frammenti sempre piccolini o cmq si possono utilizzare olignt che amplificano
una ragiona molto piccola che si può ritrovare in più di un frammento. Se volgiamo vedere
lo stato di acetilaizone possiamo amplificare la regione vicina alla regione di inizio se
vogliamo vedere lo stato di mutilazione è meglio scegliere una regione a valle. La cosa
migliore sarebbe quella di fare più chip in modo da creare una mappa degli istoni.in una
determinata regione del genoma.

Un’altra tecnica può essere quella di pesare i frammenti ottenuti dalla processazione di cromatina
immunoprecipitata con Ab che riconoscono una determinata modificazione istonica. Questa tecnica
si avvale della spettrometria di massa. In questo modo possiamo conoscere anche modifiche
associate sullo stesso istone: purifico dalla cro immunoprecipitata l’H4 e per spettrometria di
massa ne identifico le modificazioni.

Tutti le tecniche che abbiamo illustrato prevedono una selezione dei frammenti. Nel senso che
dobbiamo prima isolare con Ab istoni e porzioni di cromatina, ma se volessimo analizzare la
cromatina intera nelle sue condizioni fisiologiche e non? Come facciamo?
E’ ovvio che in condizioni fisiologiche , uno stimolo che porta alla attivazioni di processi di
modificazione della cromatina coinvolge parecchi geni e non uno solo. Ex il fattore trascrizionale
CREB è stato studiato. Se vogliamo sapere il programma di espressione genica innescato da CREB
per modificare la cromatina possiamo fare una CHIP on CHIP. Si tratta di un chip sul quale sono
adese porzioni di genoma come sonda. Prima facciamo l’immunoprecipitazione dei frammenti di
cromatina scasssati(una classica chip). Tutti i frammenti positivi a quella modificazione istonica li
andiamo a posizionare sul chip dopo averli marcati in modo da avere un segnale e poterlo
individuare. Fatto questo avremo dei segnali in corrispondenza delle zone del chip in cui è avvenuto
il legame , in questo modo potremo vedere quali geni sono stati coinvolti da quella modificazione
istonica in seguito ad attivazione di CREB. Per rendere l’analisi reale dobbiamo fare lo stesso
esperimento anche in condizioni basali senza l’attivazione di CREB. In seguito ad attivazione di
CREB vedremo che ci sarà un gran numero di geni che hanno subito delle modificazioni a carico
della cromatina.
Si sta cercando di creare una mappa delle varie modificazioni degli istoni in seguito a stimoli di
varie molecole ma attualmente le informazioni sono ancora incomplete. Quello cjhe però è venuto
fuori da questi studi e che complica ulteriormente la situazione è che questi enzimi che acetilano,
deacetilano ecc, non sono coivolti solo in questo. C’è qualcosa di più , sarebbe impensabile che tutti
questi enzimi differenti tra di loro che fanno al stessa cosa possano servire solo a condensare e
decondensare la cromatina , esiste un codice istonico dettato da tutte queste modificazioni un codice
che fa in modo che tutto avvenga in modo ordinate. Per esempio un enzima che modifica una lisina
funziona solo se riconosce un’altra modificazione in un altro punto o nella stessa posizione operata
da un altro enzima.

Studi su drosophila , e precisamente sul colore degli occhi del moscerino si è visto che la
colorazione non era uniforme ma variegata. Questa variegazione è dovuta al riarrangimento genico.
Continuando nello studio si sono trovati dei loci genici associati a questo fenotipo:
Soppressore of variegation Su(Var)
Enhancer of variegation E(Var)
Questi loci se mutate possono sopprimere o aumentare il positional effect variegation.
In base a tutto quello che abbiamo detto, in corrispondenza della cromatina condensata avremo geni
spenti ed in corrispondenza della cromatina decondensata avremo geni accesi ed attivi. Può capitare
che un locus genico che prima si trovava in una regione eucromatica si sposta accanto ad una zona
eterocromatica e diventare eterocromaic a sua volta e quindi i geni di quel locus si spengono. Ma
come lo spieghiamo tutto questo?
Questo modello rappresenta il sistema sperimentale ideale per studiare le basi molecolari del
fenomeno. Studiando il fenotipo ci si è chiesti quali fossero i geni coinvolti e sono stati trovati
alcuni geni Su (Var) ed altri E(Var):
Su(Var): HDAC, PTPase, SAM-sintetasi
E(Var) componenti del complesso SWI/SNF(sistema di rimodellamento della cromatina
ATP-dipendente)

Per Su(Var) di intendono tutti gli elementi che stimolano la condensazione della cromatina,
vediamo e HDA e anche la SAM che è donatore del gruppo CH3 spesso essenziale per la
condensazione della cromatina.
Ovviamente tutti i geni E(Var) fanno l’effetto contrario.
La eucromatina presenta maggiorea cetilazione degli istoni mentre la eterocromatina silente è
meno acetilata , più mutilata (mutilazioni più frequenti son su H3K9,H3K27,H4K20). La
eucromatina può essere presente in due differenti stati:
Eucromatina in attiva trascrizione (geni costitutivi e geni tesutospecifici) e ci sono alti
livelli di acetilazione e trimetilazione a carico di H3K4, H3K36 e H3K79
Standby: per geni che possono essere trascritti , ci sono bassi livelli di mutilazione,
acetilazionee fosforilazione.
Ci sono poi anche dei domini bivalenti dove sono presenti modificazioni che possono sia attivare
che sopprimere la trascrizione ex la metilazione di H3K27 e contemporaneamente metilazione di
H3K4.
Una cellula staminale ha questa bivalenza, perché ancora non è stato determinato il suo destino.
Dalla scelta del dominio bivalente dipenderà il suo destino. Una domanda che ci poniamo è: ma è
ragionevole che anche modificazioni differenti a volte presenti sullo stesso nucleosoma abbiamo
come effetto la sola condensazione e decondensazione della cromatina?
In realtà la risp è facile nel senso che non tutto viene lasciato al caso, si fa anche una differenza tra
trascrizione e riparazione del danno al DNA.
Quando abbiamo un danno al DNA, questo deve diventare accessibile al macchinario del riparo e
quindi la cromatina deve rilassarsi. Se però ogni volta che ripariamo un danno, decondensando la
cromatina abbiamo il rischio di trascrivere una miriade di geni che non dovrebbero essere trascritti
saremmo rovinati. Per questo una cosa sono le modificazioni della cromatina quando ci deve essere
trascrizione ed una cosa sono le modificazioni in caso di riparo. Dobbiamo sì rilassare la cromatina
ma dobbiamo cmq sfavorire la trascrizione. Per questo esiste il codice istonico, segni che
consentono alle molecole di comunicare tra loro. Le molecole comunicano tra di loro così come
anche le modificazioni comunicano tra di loro:
 Modificazioni incompatibili tra loro. Se un residuo è metilato per far avvenire la acetilaione
dobbiamo prima demetilare e poi acetilare, se non demetiliamo abbiamo voglia di
aggiungere HAT non avremo mai acetilaizone;
Una modificazione può ostacolare il legame di una proteina ad un’altra molecola. Ex
MeH3K19 è la modificazione che consente il legame di una proteina, se abbiamo
contemporaneamente PH3K10 la proteina non si lega. Quindi lo stato di un istone detta lo
stato di un altro istone;
Una modificazione può ostacolare l’attività di un enzima modificatore oppure può favorire
la modificazione di un altro residuo.

Le proteine comunicano tra loro toccandosi, come abbiamogià detto, e i domini di interazione tra
proteina e proteina sono i Br ed i Cr domini, che legano proteine e riconoscono proteine in
corrispondenza di determinate modificazioni post-traduzionali. Ex i Cr-domini (domini tudor,
WD40) riconoscono Me-K, mentre i Br-domini riconoscono Ac-K.
Un esempio di proteine che contengono Br-domini sono PCAF ,P300 che sono delle HAT e legano
le proteine in porzioni acetiate riconosciute grazie al Br-dominio ed agiscono come acetilasi . le Var
funzionano così, leggendo le informazioni scritte sugli istoni riscrivono anche zone che si trovano
in una condizione differente quindi se una zona eucromatina si sposta vicino ad una eterocromatica ,
le HAT che si legano alla cromatina in base al codice scritto, acetilano tutto uguale cosa se
abbiamo interazioni di HDA quando una zona eterocromatica trasloca accanto ad una eucromatica.

Ora possiamo porci una domanda, date tutte le spiegazioni avute e tutte le nuove cose imparate.
Ammettendo che la eterocromatina non nasca tale perché altrimenti non avrebbe motivo di esistere
proprio, che ci conserviamo a fare geni che non sono mai stati trascritti e che non saranno mai
trascrittti?
Se pensiamo questo concludiamo che eterocromatina si diventa e non si nasce.
Quindi ora analizziamo il silenziamento della eterocromatina e della eucromatina.

SILENZIAMENTO ETEROCROMATINA

Sui domini bivalenti intervengono delle HDA che deacetilano le sequenze istoniche;
Intervengono poi delle HMT che mutilano la lisina 9 di H3
Hp1 lega MeK9 H3 e polimerizza favorendo la condensazione della cromatina.

SILENZIAMENTO DELLA EUCROMATINA

Quando dobbiamo spegnere determinati geni dobbiamo stare attenti che i geni vicini che devono
rimanere accesi non siano coinvolti.
E2F, una proteina coinvolta nel ciclo cellulare sta normalmente lavorando nelle cellule. Ipotizziamo
che si verifichi un danno al DNA che deve essere riparato e prima di tutto di deve bloccare il ciclo
cellulare. La proteina retinoblastoma(Rb) sta tranquilla nel suo stato inattivo , ma non appena c’è il
segnale di danno Rb-P viene defosforilata e si dirige nel nucleo portandosi con se SUV(è una HMT)
ed HP1. nel nucleo Rb trova E2F seduta sui geni di cui stimola l’espressione, e vi si lega sfruttando
la presenza di E2F su quei geni per spegnerli. Rb legato ad E2F porta con sé SUV edHP1 che
lavorano su quei geni. SUV metila ed HP1 si lega alla MeK9-H3 e condensa la cromatina in quel
punto, bloccando i geni che intervengono nel ciclo cellulare in modo che questo non proceda. Nel
frattempo la cellula ripara il danno e la fase S del ciclo cellulare può ripartire, Rb viene fosforilato e
se ne va lasciando E2F libera di agire. Rimane però la metilazione sulla lisina ) che sarà poi tolta da
una HDM.

Abbiamo parlato dei danni al Dna e di come Rb insieme a SUV e HP1 evitino la trascrizione di geni
che consentono di avanzare nel ciclo cellulare ma non abbiamo parlato di cosa succede sul luogo
del danno al Dna. Al Break point si lega una proteina nota come TRRAP. Questa proteina è un
cofattore delle HAT ed insieme TRRAP/HAT acetilano tutti gli H per consentire il rilassamento
della cromatina e riparare il danno. Una volta riparato il danno la situazione ritorna perfettamente
alla normalità, ma ci sono ipotesi secondo le quali il processo di mutilazioni delle regioni riparate
non sia lo stesso in seguito al riapro del danno. A livello del punto di rottura si crea una cicatrice
(segnale epigenetico del danno) per cui sarebbe possibile individuare quali regioni hanno subito dei
danni che però sono stati correttamente riparati ma che è meglio trattare con maggiore delicatezza.
Si è parlato di TRAPP ed è stata indicata come specifica proteina che lega il break point, ma noi
sappiamo che non sarà di certo la sola ma perché tutto questo interesse su TRRAP? Per una serie di
esperimenti che facilmente illustreremo.

I ESPERIMENTO

Si sono create cellule KO per TRRAP e si sono studiate e si è visto che le cellule TRRAP nulle
sono più sensibili al danno al DNA. Sono stati questi risultati che hanno acceso l’interesse verso
TRRAP. Allora partiamo per gradi. Prima si sono dovuti creare i KO e si possono ottenere in due
modi:
Generare un topo KO da cui prendere le cellule. Questo metodo è stato abbandonato perché i
topi omozigoti morivano;
Generare un KO eterozigote, epoi far diventare le cellule KO omozigoti. Le cellule KO
eterozigoti hanno su un allele il gene codificante per TRRAP sostituito con una sequenza
qualunque che non crea danni l’altro allele invece è stato modificato in modo da avere la
regione genica di TRRAp fiancheggiata da due siti LoxP. Quindi le cellule saranno KO
eterozigoti per TRRAP e KI per i sii LoxP. I siti LoxP vengono riconosciuti e tagliati da un
enzima di E.coli noto come CRE ricombinasi che appunto taglia a livello dei siti e ricombina
le due estremità.
La tecnica utilizzata è ovviamente la seconda dato che la prima non ci dava niente però anche le
cellule KO-/- non sopravvivevano allora si è fatto in modo da far esprimere la CRE solo
transientemente quindi transiente era lo stato di KO-/-. Si è partiti da questo punto per avere cellule
che esperimessere transientemente la CRE , poi si è passati alla CRE inducibile. Una CRE presente
nelle cellule ma non attiva , viene attivata solo quando alle nostre cellule diamo l’induttore. In
seguito all’induzione la CRE agisce ed avremo quando vogliamo il nostro KO -/-. Per alcune ore,
dipende anche dal tournover della cellula, avremo un certo numero di cellule KO -/-.
Una volta ottenute le cellule come noi le desideriamo le confrontiamo con le cellule eterozigoti e
facciamo tutti i nostri studi.
1. il primo studio che si è fatto è stato il COMET ASSAY. Il saggio prevede l’induzione del
danno alle cellule, sia le KO -/- che le KO-/+. Una volta indotto il danno le cellule vengono
inserite in un gel d’agarosio e vengono sottoposte ad elettroforesi.. Dopo la corsa
elettroforetica il gel viene sottoposto ad un processo di colorazione per evidenziare la
migrazione e viene analizzato al microscopio analizziamo tutto quello che è successo.
Quello che si vede è una cometa, c’è il nucleo tutto colorato pieno di DNA e poi abbiamo
una coda in direzione della corsa elettroforetica. La grandezza della coda e l’intensità di
luminosità è una misura indiretta dell’entità del danno riportato. Il programma è in grado
anche di calcolare, direttamente il TALE moment.
2. tutte le cellule sia eterozigoti che omozigoti vengono irradiate. Tutte riportano danno al dna
ma dopo 6 ore le cellule eterozigoti hanno riparato mentre quelle omozigoti, che tra l’altro
riportavano un danno maggiore, non avevano ancora riparato niente.
FIGURA 1

FIGURA 2

Nella figura 1 abbiamo cellule eterozigoti ed omozigoti non irradiate e vediamo che quando non
viene indotto il danno le cellule omozigoti sono perfettamente normali.
Nella figura 2 vediamo le stesse cellule però sottoposte a radiazioni e facciamo un time corse a
varie ore dopo l’irradiazione. La cosa che notiamo è che a 3 ore e 6 ore il danno nelle cellule
omozigoti è leggermente diminuito e allora che significa? Le cellule omozigoti non sono in grado di
riparare il danno. Questo possiamo spiegarlo in due modi almeno:
1. i sistema sperimentale è caratterizzato da popolazioni cellulari miste che hanno subito
l’azione della CRE ed altre no e il saggio considera tutte le cellule.
2. quando facciamo il KO di TRRAP avremo, fino a quando tutta la proteina endogena viene
eliminata, una certa quota di proteina che continuerà a funzionare e funziona ancora a 6 ore
perché l’emivita della proteina è di circa 3 ore quindi dopo 6 ore avremo ancora il 25 %
dell’attività proteica e per questo abbiamo un minimo riparo del danno.

II ESPERIMENTO

Abbiamo bisogno di una tecnica che ci consenta di misurare il fenomeno di ricombinazione

omologa che sta alla base della maggior parte dei meccanismi di riparo del DNA.
L’esperimento che illustro essenzialmente si basa sull’utilizzo di un enzima di restrizione (SceI) che
non h nemmeno un sito di riconoscimento nel genoma umano e murino. Quindi trasfettiamo le
nostre cellule con un costrutto contenete la sequenza di riconoscimento per SceI che avrà solo quel
sito di taglio e vediamo che succede.
Questo è il costrutto che abbiamo sintetizzato. Andando dal 5’ al 3’ vediamo che c’è la sequenza
che codifica per l’enzima SceI che faremo esprimere alle cellule, seguita dalla sequenza che
codifica per la GFP, si tratta di una sequenza mutata che porta ad una proteina tronca non
funzionante, all’ interno della GFP abbiamo la sequenza riconosciuta e tagliata da SceI. A valle di
questa zona abbiamo una GFP tronca che manca del pezzo al 5’ e quindi non può funzionare così.
Inserendo questo costrutto nelle nostre cellule oi potremo valutare il fenomeno di ricombinazione
omologa semplicemente guardando le cellule al microscopio.
Una volta inserito questo costrutto nelle cellule avremo espressione di tutto quello che contiene,
dell’enzima SceI e delle due GFP che non funzionano. L’enzima SceI andrà a tagliare la sequenza
presente nel costrutto, che noi abbiamo inserito perché il genoma di topo normalmente non la
contiene.

SceI taglia la sequenza che riconosce. Il taglio operato deve essere ricucito e quindi il frammento
che rimane appeso dopo il taglio dovrà cercare qualcuno con cui legarsi per ricostruire la sequenza.
Ma la GFP noi normalmente non la esprimiamo quindi potrà, per ricombinazione omologa e
complementarietà, solo legare la sequenza di GFP che avevamo messo a valle e che era mancante
della parte iniziale. Dopo la ricombinazione avremo una sequenza fatta della parte iniziale della
prima GFP e la parte finale della seconda GFP. Questa GFP è funzionante e quindi le cellule si
coloreranno di verde.

Alla fine dell’esperimento andremo a leggere al FACS tutte le cellule verdi che indicheranno il
numero di cellule in cui la ricombinazione è avvenuta correttamente. Ovviamente il costrutto che
abbiamo inserito nelle cellule è stato messo in un posto in cui non dà fastidio.
Risultato della lettura. La percentuale di cellule TRRAP -/+ che hanno riparato il danno sono il
doppio rispetto a quelle TRRAP -/- .

III ESPERIMENTO
E’ un esperimento altrettanto semplice. Si basa sempre sul costrutto precedente. Le cellule
contenenti questo costrutto vengono sottoposte ad immunoprecipitazione della cromatina con Ab
che riconoscono H4Ac oppure H3Ac. I frammenti selezionati vengono amplificati per PCR con
oligo vicici alla regione in cui SceI taglia. Cellule che non hanno subito il taglio di SceI hanno
bande della stessa intensità sia se sono eterozigoti per TTRAP che KO. La conseguenza della
mancanza di TRAPP si avrà solo nella zona danneggiata
Quando il taglio di SceI avviene abbiamo che le cellule TRRAP-/+ aumentano i livelli di acetilazione
e quindi avremo più amplificato mentre le cellule TRRAP -/- non acetilano(questo utilizzando sempre
oligo che amplifichino la regione di rottura). Se usiamo oligo lontani non avremo amplificazione
perché quella regione essendo troppo lontana dal danno non subirà acetilazione e quindi non
immunoprecipiterà. Su H4 si ha mancanza di acetilazione dopo danno; TRAPP è importante per
acetilare questa zona. Su H3 invece il comportamento è analogo sia in +/- che in -/-

In queste acetilazioni TRRAP c’entra qualche cosa dato che è cofattore di alcune HAT tra cui
Tip60.

IV ESPERIMENTO
Vengono utilizzate cellule KO -/+ e KO-/- trattate con la SceI e si vede se e quando Tip60 iene
reclutata sul luogo del taglio. A 36’ le Tip60 corre sul sito del taglio, nelle cellule KO -/+ ma non in
quelle -/-.

Come possiamo chiaramente vedere dalla foto, nelle cellule KO -/- non viene reclutato né Tip60 né
TRRAP.

V ESPERIMENTO

Entrano in gioco altri attori. La proteina 53Bp1 lega i siti di rottura sul DNA e segnale P53 del
danno in corso.
L’esperimento è organizzato così:
Irradiamo le cellule e con Ab contro 53BP1 andiamo a vedere se questa si accumula in
corrispondenza del danno. Al microscopio confocale vediamo la formazione di foci nelle cellule
TRRAP-/+ irradiate mente non li vediamo nelle cellule TRRAP-/-.
Questa stessa analisi la facciamo anche per BRCA1 e RAD51, il risultato è lo stesso foci nelle
TRRAp-/+ e niente foci nelle TRRAP-/-.
Questo primo step già ci aiuta a capire un poco di cose, il fatto che TRRAP sia implicato nella
acetilazione e più precisamente ne riparo perché quando non c’è TRRAO si riduce la acetilazione e
quindi le proteine del riparo non possono accedere al DNA.
Questo risultato lo possiamo interpretare e cercare di spiegare almeno in due modi differenti.
1. l’assenza di TRRAP determina una interruzione della via di segnalazione alle proteine del
riparo
2. il segnale non è intaccato ma è una questione di riduzione del rimodellamento della
cromatina per cui le cellule non hanno spazio da occupare. Quindi il problema è una
interruzione del codice istonico.
La via di segnalazione non ha problemi, infatti ATM, una proteina coinvolta nella segnalazione non
subisce riduzioni di attivazione nelle cellule TRRAP-/-. Lo stesso risultato si ottiene anche
considerando altre proteine.(cdc25: blocco del ciclo cellulare)
Per quanto riguarda il codice isotnco il problema è legato al fatto che non si come sia fatto e come
studiarlo.
E’ stato fatto un esperimento in cui vengono inibite le HDA, utilizzando Sodio Butirrato. In seguito
al trattamento abbiamo un aumento dei foci nucleari di alcune proteine e si vede anche una
riduzione della acetilaizone dell’H4 da parte di Tip 60 indice di un riparo del danno non
completamente corretto.
Ma chio dice a Tip60 e TRRAP di andare sul sito del danno? E come viene attivata la via di
segnalazione? Come tutto ciò influisce sul cancro?
Queste proteine sono già presenti nelle cellule anche prima del danno tanto è vero che un topo che
sovra- esprime C-Myc viene messo in un background eterozigote per Tip60 lo sviluppo neoplastico
è accelerato, dal momento che il macchinario del riparo insufficiente predispone al cancro.

CELLULE STAMINALI

Le cellule sraminali sono cellule dotate di due caratteristiche:

Self-renewal. Dividersi generando cellule in tutto e per tutto uguale a sé stesse;
Differenziare in tipi cellulari differenti da cui origineranno tessuti differenti.
Ci sono SC sia nell’adulto, e si tratta di cellule con limitata capacità differenziativa, differenziano
solo in alcuni o pochi tipi cellulari, ma mantengo il self-renewal . e SC embrionali (ESC) che son in
grado di generare un individuo intero.
Le SC rappresentano il futuro sia nella medicina farmacologica che in quella sostitutiva.
La divisione di una SC viene definita di tipo ineguale perché dividendosi è in grado di dare origine
ad una cellula uguale a sé stessa e ad una cellula COMMITTED verso un determinato
differenziamento.
Si parla di cellule TOTIPOTENTI, come le ESC che generano tutti i tipi cellulari in teoria perché
in realtà la cellula staminale totipotente dà origine ai progenitori di una determinata linea cellulare,
ceh sono cellule PLURIPOTENTI che daranno origine ad un più ridotto numero di tipi cellulari
che vengono definite cellule MULTPOTENTI che danno origine ad uno o pochissimi tipi cellulari.
Quello che a noi interessa maggiormente , noi intesi come comunità scientifica è al cellula
totipotente , la ESC. Tale concetto di totipotenza si concentra nello zigote che rappresenta la cellula
uovo fecondata da uno spermatozoo. Il concetto di totipotenza permane fino al momento in cui lo
zigote non diventa embrione che si impianta nell’utero.
Lo zigote(cellula uovo appena fecondata) dopo 3-4 divisioni cellulari diventa
MORULA(mucchietto di cellule senza nessuna polarità e non ancora impiantate nell’utero). La
Morula, dopo alcune divisioni cellulari diventa BLASTOCISTI in cui le cellule sono
strutturalmente organizzate. C’è uno strato di cellule esterne che avvolge una cavità piena di liquido
e al centro di questa cavità(più o meno al centro) c’è l’INNER CELL MASS (ICM). Saranno le
cellule dell’ICM a dare origine all’individuo completo mentre le cellule esterne formeranno i tessuti
extra- embrionali.

Da questo punto in poi avremo il differenziamento:

Dall’ICM si origina prima l’ endoderma primitivo da cui si originerà il cordone ombelicale e
tutte le strutture che mettono in connessione la madre con il bambino;
Impianto della blastocisti nell’utero (egg cilinder) e formazione dei vari tessuti;
Formazione dell’endoderma primitivo da cui si genereranno i tre foglietti
embrionali(ectoderma, mesoderma ed endoderma) e le cellule della linea germinale.
Le cellule che possiamo prelevare e che conservano ancora completamente la totipotenza sono le
cellule della ICM della blastocisti. Si crescono in coltura; se subiscono una mutazione generalmente
muoiono. Ci sono anche delle cellule di carcinoma embrionale che sono molto simili alle ES ma che
ES non sono.
Come dimostrare la totipotenza delle ES?
1. Piastrando le ES raccolte dalla blastociste , propagarle i coltura e poi sollecitarne il
differenziamento in tutti i tipi cellulari;
2. iniettandole sotto cute ad un topo immunodeficiente e analizzare l’eventuale formazione di
teratomi che sono formati da una serie di abbozzi tissutali;
3. possiamo prendere due topini di colore differente tipo neri e bianchi per facilitare l’analisi.
Prendiamo le ES dalla blastocisti della topine nera e le impiantiamo nella blastocisti di una
topina bianca e la blastocisti la mettiamo in una topina bianca pseudo-gravida(FOSTER). Al
parto avremo dei topini che hanno parte del corpo bianca e parte de corpo nera qualora le
cellule delle topina nera siano andate a colonizzare le cellule del bulbo pilifero, se le cellule
della topolina nera sono andate a colonizzare la linea germinale avremo che tutta la progenie
di quel topino tutto bianco o mezzo bianco mezzo nero saranno tutti neri.
Le ES in coltura possono diventare progenitrici dell’endoderma, mesoderma, ectoderma e
trofoblasto. Per quanto riguarda la line germinale ci sono dei dubbi, c’è chi dice che derivi
anch’essa dall’ES c’è chi dice che derivi da momenti differenziativi successivi do uno dei tre
foglietti embrionali. Ricordiamo che i progenitori delle ES sono cellule pluripotenti e non
totipotenti. E le cellule pluripotenti noi le possiamo tranquillamente trovare anche nell’adulto e
queste SC sono spesso causa di sviluppo tumorale. E’ ovvio che una cellula differenziata nonpuò
dare origine ad un tumore per il semplice fatto che no è in grado di proliferare e crescere. Inoltre ci
sono SC nell’adulto di cui non capiamo la presenza, ex i neuroni , infatti quando un neurone muore
non si può fare niente allora a che servono le NSC.
Detto questo focalizziamo maggiormente il punto di interesse. Ma quali sono le basi molecolari
della staminalità?
Capire la basi molecolari è estremamente importane, ma voi riuscite ad immaginare a quello che
potrebbe succedere se fossimo in grado di generare ESC ? potremmo rigenerare tessuti, potremmo
sostituire cellule malate ecc.
Dopo studi estenuanti si sono trovati i protagonisti, si tratta di 3 fattori trascrizionali senza i quali
non vi è staminalità. OCT4, NANOG e Sox2.
Un esempio rapido che ci dimostra l’importanza di queste proteine nella staminalità è il seguente
esperimento.
Semplicemente le cellule sono state private di uno di questi fattori e cosa succede?
Se togliamo OCT4 lo sviluppo embrionale si ferma a morula, tutto diventa essenzialmente
trofoblasto, non si forma la ICM e nient’altro.
Se togliamo NANOG lo sviluppo embrionale si ferma poco dopo al livello della bastocisti
precoce senza formazione della ICM. Si perde la staminalità e i ha differenziamento sempre
il trofoblasto.
Se togliamo Sox 2 abbiamo un esito molto simile a quello ottenuto togliendo OCT4 infatto
OCT4 forma un dimero con Sox2. c’è però una differenza, mentre OCT4 può funzionare
anche da solo, Sox 2 no. Dai risultati ottenuti possiamo generalizzare dicendo che OCT4e
Sox 2 bloccano il differenziamento verso trofoblasto mentre Nanog blocca il
differenziamento in endoderma primitivo.
Questi fattori bloccano il differenziamento e consentono di mantenere la staminalità quindi sono sia
dei repressori che degli attivatori perché per ottenete questo risultato bisogna attivare qualcosa ma
reprimere altre cose. Il sistema formato da questi fattori si automantiene. Il promotore di Nanog
presenta siti di legame per il dimero Sox2-OCT4 oltre ad avere anche un sito per Nanog. Il
promotore di Oct ha 4 regioni di regolazione, una per Oct-Sox, una per Nanog. Questi fattori si
autoregolano e quidi per spegnere questo circuito ci vuole una decisione forte eche sembra essere
irreversibile.
A livello molecolare possiamo fare un altro passettino in avanti indicando quali sono i pathway che
regolano l’attivazione o meno di questi fattori.
Per quanto riguarda OCT4 e Sox 2 questi sono controllati dal pathway di Wnt, integrine, BMP4. Per
quanto riguarda Nanog non si sa ancora bene ma si pensa possa essere coinvolto il recettore per il
LIF (Leukemia Inducine Factor), che lega LIF-R sulla membrana, che attiva Jak, che attiva la
proteina STAT3 che ah una funzione simile a Nanog.
In merito al LIF possiamo dire qualcosa in più, infatti le cellule in coltura devono essere mantenute
sempre con il LIF altrimenti differenziano immediatamente. Bene questo non succede in vivo infatti
il topo KO per STAT3 ha il blocco molto a valle. Non si sa bene come la necessità del LIF si
comincia a sentire intorno a 8.5 giorni(la gravidanza del topo dura circa 18 giorni)e cmq il topo
senza LIF nasce, è vero che nasce morto ma con tutti i tessuti perfettamente formati.
Ci sono inoltre delle evidenze che indicano un ruolo da parte di questo sistema nel regolare STAT3.
Ma ora la questione è differente perché in un certo senso ci siamo fermati. Conosciamo più meno
quali sono i pathway, conosciamo quali sono i protagonisti principali ma non sappiamo su chi
questi protagonisti agiscono. Potrebbero essere fattori trascrizionali a loro volta e potremmo andare
avanti così per ore o giorni. Il topo KO per Oct: possiamo confrontare il profilo di regolazione e di
espressione genica con il wild type, ma non avremo molte informazioni perché molti geni regolati
da Oct sono essi stessi fattori trascrizionali quindi non abbiamo una chiara definizione dei geni
regolati direttamente da Oct.
Possiamo fare un’analisi combinata di espressione genica ed accoppiare questo risultato con un
esperimento che ci consente di vedere su quali geni si siede per esempio OCT4 ma potrebbe essere
Nanog o altri, basta immunoprecipitare con l’Ab diretto contro OCT4 o Nanog ed in base al profilo
di espressione valutare se i geni su cui è seduto OCT4 sono espressi e come. Per esempio se quando
togliamo OCT4 vediamo che si accendono 1000 geni andiamo a vedere quali di quei geni hanno
OCT4 seduto sopra.

Una tecnica molto costosa secondo il mio modesto punto di vista è quella basta sul sequenziamento.
Il primo passaggio prevede l’immunoprecipitazione della cromatina con un Ab(facciamo l’esempio
con OCT4) diretto contro OCT4 , quindi tireremo giù tutti i pezzi che contengono OCT4 da qualche
parte.
All’immunoprecipitazione segue il clonaggio.in modo da isolare dei tag di Dna più piccoli. Alle de
estremità dell’inserto ci sono le sequenze di riconoscimento per enzimi di restrizione che tagliano a
17 nt di distanza, all’interno del nostro inserto, dal sito di riconoscimento. Dopo il taglio le due
estremità vengono ligate e quindi avremo un inserto fatto da 17+17 nt, quelli ottenuti dal taglio.
Questi 34nt sono sufficienti per identificare una regione di DNA.
Se un frammento di 17+17 noi lo vediamo una sola volta non gli diamo importanza se invece uno lo
ritroviamo più volte lo consideriamo perché l’Ab ha tirato giù quel frammento parecchie volte.
Per quanto riguarda i siti dove maggiormente troviamo OCT4 e Nanog abbiamo:
Al primo posto con la percentuale più alta gli introni
Al secondo posto abbiamo il 5’ prossimale (a 10Kb dal sito di inizio). Circa il 18,6% di
OCT4 e il 12,8% di Nanog siedono lì
Al terzo posto abbimo il 5’ distale con il 7,5% di OCT4 e il 7,3% di Nanog.
Bene oggi è stato praticamente completato il profilo di espressione delle cellule ES wt, delle Es
indotte a differenziare con acido retinico, delle Es con OCT4 silenziato e Nanog silenziato.
Abbiamo già precedentemente detto quanto potrebbe essere importante utilizzare le Ec in medicina
basti pensare alla possibilità di rigenerare tessuti interi o parte di esse e anche organi sia dal punto di
vista anatomico che funzionale. L’utilizzo delle Es eterologhe , per il trattare un danno tissutale per
esempio, porta gli stessi problemi che porta un qualsiasi altro trapianto d’organo , prima di tutto il
rigetto. Ovviamente la clonazione supera i problemi del rigetto perché manipolando le cellule a
partire da un donatore una cellula somatica possiamo generare un individuo che è quasi identico al
donatore della cellula somatica e quindi viene evitato il problema della compatibilità.
Però la clonazione non si può effettuare però vediamo cmq come si fa sia mai che poi venga resa
libera almeno lo sappiamo fare.
Bene si prende una cellula uovo e cambiamo il suo nucleo(con corredo aploide) con il nucleo di una
cellula somatica(diploide) di un donatore. Ovviamente anche l’uovo deve essere donato. Bene la
cellula uovo così modificata è in gradi di dare origine ad una blastociti e da qui ad un individuo
senza passare per la fecondazione.
Bene questa tecnica si potrebbe usare per prelevare dalla blastocisti le cellule Es della ICM che
avranno il genoma della cellula somatica mentre il genoma mitocondriale della cellula uovo e sono
proprio gli RNA che sono espressi dal genoma mitocondriale e a tutte le proteine presenti nel
citoplasma della cellula uovo che detteranno le prime divisioni cellulari e la formazione della
blastocisti.
Effettivamente detto così noi riusciamo a vedere solo i benefici di tutto ciò, ma come in tutto ci
sono anche dei limiti:
1. Non dimentichiamo che non si può escludere una risp immunitaria nei confronti del genoma
mitocondriale.
2. le Es così ottenute possono essere utilizzare per la cura delle malattie somatiche non quelle
genetiche
3. le Es hanno gran parte del genoma non mutilato perché effettivamente tutti i geni devono
essere pronti per essere trascritti mentre una cellula somatica ha delle regioni mutilate per
quei geni che non devono essere trascritti. Bene quando la cellula somatica diventa
staminale bisogna non solo inattivare le mutilasi ma anche attivare delle demetilasi che
eliminino a tappeto tutti i gruppi CH3, però questo meccanismo non sarà regolato come lo è
nelle Es
4. viene cancellato anche l’imprinting e quindi i geni portatori di imprinting possono
manifestarsi in un fenotipo malato se l’imprinting viene perso.
5. ma la morale di tutto ed il principale problema è che questa tecnica effettivamente non
differisce tanto da quella che prevede il prelievo delle cellule direttamente dalla blastocisti
ottenute tramite una normale fecondazione.

REPROGRAMMING

Il mio pane quotidiano, ragazzi io faccio questo dalla mattina alla sera. Il principio di tutto è quello
di prendere una cellula somatica perfettamente differenziata e cancellare tutto quello che è
riportandola al suo passato, la facciamo diventare una ESC.
Se ci pensate non è una cosa così impossibile da concepire perché confrontando il genoma delle
ESC e delle cellule somatiche non troviamo differenze se invece andiamo ad analizzare il pattern di
mutilazione di geni e promotori, solo per fare un esempio, vedremo che le cellule sono differenti.
Bene la chiave sta qua delle modificazioni epigenetiche.
Per giungere ad una conclusione si è dovuti passare attraverso vari esperimenti estenuanti.
Si sono individuati SOX, OCT4 e Nanog come fattori della staminalità allora come prima
cosa si è cercato di far esprimere alla cellula somatica OCT4, SOX2 e Nanog, ma non
succedeva niente.
Allora si è pesanti “ma perché non prendiamo tutti i possibili geni caratteristici delle ES e li
facciamo esprimete?”. Dopo centinaia di prove e combinazioni è stata trovata la accoppiata
giusta: OCT4,SOX2,Myc e Klf4. Ma non finisce qui , per avere un reprogramming
efficiente, le cellule devono essere infettate con 4 virus che hanno il cDNA di questi 4 fattori
sotto il controllo delle promotore delle LTR, l’unico che consente di avere i livelli di
espressione adatti.
Ma anche così non era tutto rose e fiori perché dobbiamo ottenere una cellula, ex fibroblasti, che è
stata co-infettata da tutti e 4 i virus.
Ovviamente noi dobbiamo selezionare le cellule positive a questa multipla trasfezione e possiamo
fare trasfettando le cellule con un costrutto che contiene il gene di Nanog seguito dalla GFP quindi
quando il promtore di Nanog viene attivato avremo espressione di Nanog e anche della GFP e
quindi le cellule appariranno verdi. Bene il promotore di Nanog, nei cloni riprogrammati, viene
attivato da Nanog endogeno e questo perché cmq noi non infettiamo le cellule con il cDNA di
Nanog però è vero che il promotore di Nanog ha siti di legame per OCT4, si è vero però il segnale
della infezione dura solo pochi giorni serve soltanto a dare un impulso alle cellule che poi
continuano da sole. E se andiamo ad effetutar eun microarray degli mRNA espressi dai cloni e li
confrontiamo con le Es vediamo anche una riprogrammazione epigenetica. Oltre alla separazione
per FACS possiamo affidarci anche all’occhio umano selezionando i cloni che ci sembrano più Es,
ma la cosa più sicora è l’espressione genica, i geni espressi devono essere quelli delle ES e non
quelli dei fibroblasti.
Possiamo cercare di spiegare la funzionalità dell’infezione con Myc perché noi conosciamo che è
un protoncogene che può causare non pochi danni, infatti cmq si è visto che non è necessario per la
riprogrammazione. Cmq si è ipotizzato, am molto sicuramente è così, che la over-erspressione si
Myc viene avvertita come un danno al Dna che la cellula cerca di riparare. Per riparare un danno
abbiamo abbondantemente visto che è necessario la decondensazione della cromatina bene in risp a
Myc le cellule decondensano la cromatina in maniera molto estesa alla ricerca di un danno che
effettivamente non c’è. Questo sembra essere lo stimolo necessario di accensione del macchinario
di riprogrammazione.
I cloni riprogrammati possono essere paragonati a cloni di cellule KO per DMMT1 una metil
trasferasi.
Anche questa tecnica sperimentale ha degli intoppi e sono:
Myc rappresenta una bomba innescata infatti circa il 40% dei topini creano tumori
spontanei.
Per avere molti di questu cloniabbiamo dovuto creare un topo che esprimesse la GFP sotto il
controllo del promotore di Nanog, non possiamo certo fare la stessa cosa per l’uomo.
Ormai entrambi i problemi sono stati risolti perché è stato pubblicato un lavoro in cui si afferma che
myc non è essenziale ed inoltre possiamo selezionare i cloni per morfologia.
Abbiamo detto che le cellule riprogrammate lo sono anche dal punto di vista epigenetico ma quali
sono queste modificazioni?
Si tratta di trimetilazioni della lisina (K)4 e 27 dell’istone H3. e la mutilazione K27H3 è
essenzialmente spento ma spento non ci da nessuna informazione sulla qualità dello spegnimento.
Dobbiamo dire che per quanto riguarda Nanog abbiamo un codice particolare per cui non è
possibile che Nanog venga espresso in un fibroblasto a meno che non ci siano delle variazioni
epigenetiche cmq queste regole non si possono generalizzare per altri fattori.
I meccanismi che sono alla base della totipotenza e le vie di segnalazione sono note ma non si sa
come facciamo le cellule a mantenere queste potenza e a decidere, ad un certo punto, di
differenziare per questo si stanno facendo studi sulla potenza e sul differenziamento.
Si sono creati RNAi in gradi di sopprimere l’espressione di molti geni innativando i quali avremo
un determinato fenotipo, se interferiamo con geni che sono coinvolti nel mantenimento della
puripotenza avremo come risultato il differenziamento. Esiste una collezione si circa 66000 ShRNA
clonati in vettori con cui vengono trasformati ceppi batterici.
Per poter analizzare più di 60000geni abbiamo bisogno cmq di un saggio immediato e molto
semplice un esempio è quello di trasfettare le cellule Es con un costrutto che contiene la GFP sotto
il controllo di un promotore espresso solo nei neuroni quindi quando avremo il differenziamento in
neuroni le cellule appariranno verdi. Ah dimenticavo di dire che le cellule devono essere trasfettate
anche con ShRNAs altrimenti non interferiamo con nessun gene e quindi non avremo nessun
fenotipo. L’esperimento è molto semplice: prendiamo una miltiwell da 96 pozzetti e ci mettiamo
dentro le cellule trasfettate con il costrutto che contiene la GFP sotto il controllo del promotore
specifico del neurona e con una miniprep del plasmide di uno specifico ShRNA e vediamo se le
cellule, dopo 4 giorni, sono verdi. Se vediamo nero quindi nessuna cellula verde può voler dire che
nessun ShRNA bloccava la pluripotenza ma può anche voler dire che il blocco è precedente alla
espressione del marker neuronale .
Circa una 70ina di ShRNA fanno qualcosa e circa una 30ina fanno molto nell’ambito di
differenziamento e staminalità. Tra tutti i geni quelli più interessanti codificano per fattori
trascrizionali un esempio è KLF5(kruppel like factor). Ha un dominio zinc finger di legame al
DNA.
Si sono fatti molti studi su KLF sia 5 che 4 , si tratta di due fattori trascrizionali che comunicano tra
loro nella regolazione della proliferazione e non si trovano entrambe nella stessa cellula. Si sa che
l’omozigote KO di KLF5 non si può ottenere mentre l’eterozigote ha problemi cardiaci se
sottoposto a stress. Studi di espressione hanno evidenziano che KLF5 è espresso nelle cellule ES ma
non nelle cellule differenziate anche se avvenuto il differenziamento si può riesprimere in alcuni
tessuti.
Si sono fatti studi che hanno consentito di stabile che c’è una coespressione di OCT4 e KLF5 e di
KLF5 e Nanog. Inoltre cellule trasfettate con ShRNA diretti contro KLF5 perdevano la staminalità
e si aveva anche una drastica riduzione di Nanog, OCT4 e SOX2. Le cellule non sono più staminali
ma cmq stanno bene.
Le cellule sembrano strane se andiamo a fare la RT-PCR di geni di differenziamento vediamo che
questi non vengono espressi questo vuol dire che le cellule vogliono andare verso un determinato
differenziamento ma in realtà non si ottiene niente è un differenziamento abortivo le cellule
sopravvivono miracolosamente dopo la perdita di un fattore essenziale. Questo esperimento viene
fatto mantenendo il LIF, ma si sono fatte osservazioni anche in assenza di LIF e siero e ovviamente
senza LIF e siero le cellule differenziano. Ma se facciamo over-esprimere KLF5 e poi togliamo sia
LIF che siero le cellule rimangono staminali. Sono state contate le cellule positive per OCT4 e
Nanog in assenza di LIF e siero, le cellule sono poche ma se over-esprimiamo KLF5 il numero delle
cellule raddoppia.
Si è quindi giunti alla conclusione che KLF5 faccia parte del famoso trio di fattori della staminalità
e si sono quindi costruiti dei costrutti con il promotore di Nanog e OCT4 clonati vicino alla
luciferasi. Quando sovra-esprimiamo KLF5 vediamo che NAnog aumenta mentre OCT4 non tanto
ma se eliminiamo KLF5 abbiamo una diminuzione sia di OCT4 che Nanog. Questo non dimostra
che KLF5 agisca direttamente. Cmq KLF5 può interagire sia con il promotore di Nanog che con
quello di OCT4 ma abbiamo visto che OCT4 ha un sito di legame per Nanog e viceversa quindi non
può essere che siano OCT4 e Nanog a regolare KLF5? KLF5 è un gene altamente conservato non
nelle regioni esoniche ma a circa 200coppie di basi a monte del sito di inizio della trascrizione c’è
una sequenza altamente conservata dove si lega Nanog, questa sequenza si è individuata
immunoprecipitando la cromatina con Ab diretti contro Nanog.
KLF4 non sembra far niente nelle Es ma se aggiungiamo KLF4 alla miscela di fattori abbiamo delle
colonie PA positive(anche KLF2 che sembra essere il migliore).
Usare questi fattori sembra essere ottimo ma cmqsarebbe meglio se si potesse evitare la presenza
delle STr e anche ridorre la manipolazione genetica eccessiva. Per questo si sta cercando di trovare
quali sono i microRNa che inattivano i geni che rimodellano la cromatina e creare degli anti-MIR
che inattivando i MIR endogeni consentono l’espressione di geni che rimodellando la cromatina
agevolano la riprogrammazione. Individuarli non è molto semplice anche se i MIR espressi non
sono tantissimi(sono circa 400/500). Quindi si può fare come cosa anche perché gli anti-MIR
agiscono e poi scompaiono senza lasciare traccia.