Tecniche di spettrometria di massa applicabili all’analisi del

proteoma
In proteomica, la spettrometria di massa non rappresenta soltanto la procedura di elezione per ottenere
misure precise della massa dei polipeptidi o dei loro prodotti di frammentazione proteolitica. Le
informazioni più rilevanti che si possono avere dalle analisi effettuate con le configurazioni più evolute dello
spettrometro di massa (tandem MS) consentono infatti di descrivere degli stessi polipeptidi anche la
struttura primaria e, quindi, di ottenerne la completa identificazione. Peraltro, l’elevata affidabilità delle
identificazioni ottenibili utilizzando i dati forniti dall’analisi spettrometrica si basa proprio sulla altissima
precisione con la quale si possono misurare le masse molecolari. La misura sperimentale della massa di un
polipeptide comporta infatti un errore non superiore allo 0,001%. Per fare un esempio la massa relativa di
un polipeptide di PM 35.000 si determina con un errore inferiore a 4 unità di massa atomica. Con questa
precisione delle misure è quindi possibile rilevare con accuratezza anche modificazioni post-traduzionali
delle proteine allo studio. Diminuendo la Mr delle molecole, la precisione delle misure è ancora più elevata.
Per esempio, la misura della massa di un oligopeptide di Mr = 1000 dà un errore minore di 10 ppm. Come è
fatto uno spettrometro di massa Sono applicabili all’analisi proteomica molteplici configurazioni strumentali
dello spettrometro di massa. Tali configurazioni si differenziano per il sistema di ionizzazione, per il sistema
di rivelazione e, soprattutto, per l’analizzatore, cioè per il componente che definisce l’intervallo delle masse
rilevabili e conferisce allo strumento le sue caratteristiche di sensibilità e risoluzione. Ogni spettrometro di
massa è costituito di tre componenti fondamentali: 1. la sorgente di ioni, dove le molecole (che nell’analisi
proteomica sono peptidi) vengono ionizzate. 2. l’analizzatore; applicando un campo elettrico, i peptidi
carichi vengono trasferiti dalla sorgente all’analizzatore dove sono separati in funzione del valore del loro
rapporto massa/carica (m/z). il detector; una volta separati nell’analizzatore, gli ioni vengono rilevati dal
detector e i dati (intensità del segnale per ciascun valore di m/z) sono raccolti in un foglio elettronico dal
quale viene esportato in forma grafica lo spettro di massa (valore m/z in ascisse e intensità del segnale in
ordinate).Le molecole dell’analita vengono ionizzate nella sorgente e gli ioni sono accelerati da un campo
elettrico. L’analizzatore separa gli ioni provenienti dalla sorgente in base al loro rapporto massa/carica
(m/z). Per ogni valore del rapporto m/z il detector rileva la quantità degli ioni che provengono
dall’analizzatore. I dati rilevati vanno a popolare una tabella alla quale fanno riferimento i successivi
processi di elaborazione informatica. Nell’analizzatore e nel detector si mantiene un alto vuoto per limitare
la probabilità che collisioni con molecole gassose disturbino la migrazione degli ioni provenienti dalla
sorgente. La sorgente di ioni Le modalità di introduzione del campione nella sorgente di ioni dipende dal
tipo di sorgente presente nello strumento. In alcune sorgenti il materiale da analizzare deve venire
introdotto “manualmente” mentre in altre viene trasferito da un sistema cromatografico o elettroforetico
opportunamente interfacciato. La ionizzazione che si produce nella sorgente può essere elettronica o
chimica, le due tecniche storiche di ionizzazione per piccole molecole volatili e termolabili. Si può produrre
la ionizzazione anche mediante protonazione o per bombardamento con atomi veloci (Fast atom
bombardment,. Nella sorgente, oltre alla ionizzazione, si ha il passaggio dell’analita dallo stato solido o di
soluzione allo stato aeriforme. Sorgente MALDI (Matrix assisted laser desorption ionisation) La tecnologia
MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization) e la sua evoluzione denominata con l’acronimo SELDI
(Surface-Enhanced Laser Desorption Ionization) sono basate su un metodo di desorbimento/ionizzazione
che permette di studiare in maniera semplice ed altamente produttiva molecole non volatili quali proteine
e acidi nucleici tramite spettrometria di massa. La tecnologia di ionizzazione MALDI si basa sull’eccitazione
delle molecole del campione con un raggio laser per produrne la vaporizzazione e la ionizzazione. Nella
sorgente MALDI il campione contenente un peptide o una miscela di peptidi viene dissolto in un eccesso di
matrice (acido sinapinico o alfa-ciano-4- idrossicinnamico), sostanze che assorbono le frequenze emesse
dalla sorgente laser che viene utilizzata per l’eccitazione. Struttura chimica di due acidi frequentemente
utilizzati come matrice nelle sorgenti MALDI Un piccolo volume della miscela (1-2 µl) viene deposto in uno
dei pozzetti scavati sulla superficie del target. In un’analisi-tipo si fa in modo che la quantità di campione
contenuto in ciascun pozzetto sia dell’ordine delle picomoli. L’operazione viene ripetuta per tutti i campioni
da analizzare. Dopo avere allontanato il solvente, quando la miscela campione/matrice contenuta in
ciascun pozzetto si trova allo stato di solido amorfo. La sorgente viene messa sotto vuoto e quindi, in
sequenza, i pozzetti vengono investiti da un raggio laser pulsato (337 nm). Quando uno dei pozzetti viene
investito dal raggio laser, le molecole della matrice assorbono l’energia della radiazione incidente (le
molecole dei peptidi disciolti nella matrice non vengono direttamente eccitati dai fotoni della luce incidente
e quindi non subiscono modificazioni chimiche di alcun genere, ad eccezione di un processo di
protonazione . I pozzetti del target contengono gli analiti disciolti in un eccesso della matrice. Dopo avere
posizionato il target, nel comparto sorgente si fa il vuoto. I pozzetti vengono colpiti in sequenza dal raggio
laser pulsato. L’energia assorbita dalle molecole della matrice è sufficiente a portarle dalla fase di solido
amorfo alla fase di vapore. In questo processo di vaporizzazione della matrice anche le molecole di soluto
(peptide) vengono trascinate in fase vapore. Gli ioni peptidici in fase vapore sono sottoposti ad un forte
campo elettrico che li accelera verso la griglia, superata la quale entrano nell’analizzatore.

L’ESI (electrospray ionization) è una delle più semplici e flessibili tecniche di ionizzazione che si possono
adottare per l’analisi di massa dei peptidi, opera a pressione ambiente e a temperature moderate ed è
probabilmente il metodo di ionizzazione più blando. Questo metodo di ionizzazione può venire applicato
all’analisi spettrometrica di molecule polari, quali sono i polipeptidi, in un range di massa compreso fra 102
e 106 Da. Nella ionizzazione ESI il campione, trasportato da un flusso di 1-2 µl/min di solvente contenente
tracce di un acido volatile (acido metanoico o trifluoroacetico), emerge da un capillare di acciaio di
diametro interno 75-100 µm (in rosso nella figura). Un flusso coassiale di gas inerte (azoto) produce la
formazione di un aerosol all’uscita del capillare metallico. Fra il capillare metallico e il controelettrodo è
applicata una differenza di potenziale di circa 5000 V. In queste condizioni, le molecole di soluto dissolte
nelle particelle liquide che formano l’aerosol assumono carica positiva. Nel breve spazio che separa il
capillare e il controelettrodo, per evaporazione del solvente, si ha un aumento della carica All’analizzatore
di massa ioni della matrice Miscela peptidi-matrice Laser pulsato ioni del peptide specifica delle particelle di
liquido che, per repulsione coulombiana fra cariche omologhe, si frammentano in particelle di minori
dimensioni. Il processo di frammentazione si ripete più volte fino alla completa evaporazione del solvente
ed alla formazione di una popolazione di ioni positivi singoli non solvatati. Nel campo elettrico applicato gli
ioni positivi vengono accelerati verso il polo negativo e, passando attraverso il cono campionatore, entrano
in una zona a bassa pressione dalla quale, attraversando lo skimmer, entrano nell’analizzatore dove è
praticato un vuoto molto più spinto. Nell’esempio sopra descritto la carica positiva dei peptidi è dovuta alla
protonazione di uno o più gruppi funzionali basici. È possibile operare anche mediante ionizzazione
negativa, aggiungendo alla soluzione carrier tracce di ammoniaca invece che di acidi (nella ionizzazione
negativa viene ovviamente invertito il campo elettrico fra capillare metallico e controelettrodo). Per l’analisi
di peptidi si usa sempre la ionizzazione positiva. d’altra parte è possibile conoscere lo stato di carica di un
peptide: se il peptide porta una sola carica elettrica lo ione monocarica (M+H)+ ha un rapporto m/z pari a
(M+H)/1 mentre se lo ione ha due cariche (M+2H)2+, il rapporto m/z sarà (M+2H)/2 e così via. Lo spettro di
massa è ovviamente più complesso di quello che si avrebbe se tutti i peptidi avessero carica unitaria ma
questa maggiore popolazione dello spettro di massa può essere semplificata valutando la corrispondenza
fra i valori di M che derivano, applicando un semplice calcolo, da diversi valori m/z. Un’altra apparente
complicazione deriva dalla presenza in natura di quantità non trascurabili di isotopi del carbonio con massa
13. Per ogni peptide, oltre alle righe spettrali con il valore di m/z atteso si possano quindi osservare righe di
minore intensità con rapporto m/z maggiore di una unità. Anche questa “complicazione”, dovuta al fatto
che nel peptide un atomo di carbonio di massa 12 è sostituito dall’isotopo naturale di massa 13, fornisce
un’ informazione importante: ci dice che lo ione analizzato è monocarica. Se lo ione fosse stato bi-carica
(due volte protonato), la differenza del rapporto massa carica fra la riga principale e quella a m/z maggiore
non sarebbe stata di una unità ma di 0,5 unità di massa. Un vantaggio importante della tecnica ESI sulla
tecnica MALDI è che la sorgente può essere facilmente interfacciata con un sistema cromatografico, ciò
consentendo di analizzare miscele complesse di proteine o peptidi, la cui separazione può venire effettuata
a monte dello spettrometro, senza bisogno di ricorrere alla loro separazione con metodi cromatografici o
elettroforetica off-line. In uno strumento MALDI-TOF, la massa degli ioni generati nella sorgente viene
misurata per mezzo di un analizzatore a tempo di volo (time of flight, TOF). In questo dispositivo, il rapporto
m/z (massa su carica) dello ione peptidico viene derivato dal tempo impiegato dallo ione, che nella
sorgente è stato accelerato dal campo elettrico, per percorrere il tubo di volo (uno spazio confinato, libero
da campi elettrici), e giungere al rivelatore. Considerando il tipo di misura che viene usato per ottenere i
valori di massa, è evidente la necessità di usare impulsi della sorgente laser di durata molto breve (quanto
più breve è la durata di ogni singolo impulso tanto maggiore è la precisione delle misure che si ottengono).
Analizzatore di massa a) TOF (analizzatore a tempo di volo) La spettrometria di massa MALDI-TOF è molto
usata in proteomica, essendo sensibile, veloce e affidabile. Un ulteriore vantaggio deriva dal fatto che
piccole quantità di sali non volatili presenti nel campione o residui dei tamponi comunemente utilizzati per
il trattamento delle proteine prima dell'analisi spettrometrica sono ben tollerate dallo spettrometro di
massa MALDI-TOF. Lo svantaggio che presenta questa tecnica è che, per poterla identificare con un sistema
MALDI-TOF, la proteina da studiare deve essere quasi pura. Se in uno spot ottenuto da ELETTROFORESI 2D
sono presenti più proteine e se queste non sono presenti nello stesso rapporto molare, la strumentazione
MALDI-TOF non consente talora una sufficientemente buona identificazione delle proteine componenti la
miscela.