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CLINICA
BIOLOGIA MOLECOLARE
CLINICA
Lezione 1
• Prognostiche
- Un singolo test, o gruppi di test, possono essere utilizzati per fornire
informazioni prognostiche. Predire lo sviluppo di una patologia.
- livelli di transaminasi in corso di epatite
- livelli dell’antigene carcino-embrionale (CEA) in corso di carcinoma
Principali finalità della biochimica
clinica
Follow up e monitoraggio terapeutico
Un test può essere usato per monitorare il decorso di una malattia
Fluidi e campioni
Sangue, Urine, Plasma, Liquor,
Biologici Biopsie, Ago aspirato
INFORMAZIONI
Lo scambio di informazioni:
Lundberg’s loop
Il percorso di un esame di laboratorio dalla richiesta alla risposta
e conseguente intervento medico è conosciuto con il termine
americano di Total Testing Process (TTP).
1. Raccolta ed etichetta
2. Accettazione e verifica
campione (inserimento nel
LIMS)
3. Preparazione del
campione
4. Suddivisione
5. Analisi
6. Validazione Risultato
7. Eventuale ripetizione
8. Referto
“Lundberg’s Loop ”
1. Quesito clinico/richiesta
2. Selezione test Lo schema ha subito, nel tempo,
3. Richiesta test numerose integrazioni e
4. Raccolta campione rivisitazioni fino a riconoscere il
5. Indentificazione ruolo centrale del PAZIENTE
6. Trasporto
7. Preparazione Il valore di un test viene misurato
8. Analisi sulla base dell’impatto che ha sul
9. Tipologia di Risposta paziente e il percorso
10. Interpretazione assistenziale
11. Azione/decisione clinica
0,1
Variaz. Rapportata alla Concentr.
0,05
calcio
magnesio
0
3 6 9 12 15 18 21 24 potassio
-0,05
-0,1
ora
Fonti di variabilità nella fase del prelievo
Pre-analitica
• Applicazione prolungata del laccio
• Contaminazione da infusione venosa
• Non corretta preparazione del Paziente (cibo, stress,
riposo, esercizio fisico, farmaci, postura, …)
• Incompleto riempimento della provetta
• Uso di provette con anticoagulanti e conservanti non
idonei
• Errata identificazione del Paziente o delle provette
• Mancata indicazione del tipo di prelievo (arterioso, ora
del prelievo, …)
Effetto della postura
Chimica od osmotica
Disinfettanti, detergenti, H2O o altre sostanze chimiche sulla pelle al
momento del prelievo,
Disinfettanti, detergenti, H2O o altre sostanze chimiche nell’ago della
siringa o nei contenitori
Fisica
Conservazione del campione in condizioni non idonee: il congelamento
provoca la cristallizzazione dell’acqua endo-eritrocitaria con rottura
delle membrane
Pre-analtica: Emolisi
calcio
11 proteine totali
9 albumina
emoglobina
7
5
3
0 2 4 6
minuti
Effetto della postura
5
potassio
glucosio
3
1
0 4 8 24
ore
Conservazione e stabilizzazione dei campioni
Esempio per la preservazione di campioni di urine in relazione
ai principali esami biochimici
Variabilità analitica (Va)
• La misura di un analita non è altro che una stima di una grandezza(
massa, concentrazione, conta….). Lo scostamento tra misura e valore
reale è definito errore totale della misura
Bisogna determinare le
caratteristiche analitiche
(Performance) di ciascun
test di laboratorio per
poterne valutare l’utilità
clinica
Errori di Misura
Gli errori grossolani sono quelli che vengono commessi in seguito
ad un'inappropriata applicazione del metodo analitico
92 92 1
92 91
90 2
90 89 89 3
88
88 87 4
86 5
86
84
82
80
metodo automatico metodo manuale
metodi di analisi
Calcolo della precisione analitica
CV%
Metodo Metodo
Misurazione n°
Automatico Manuale
1 92 92
2 90 89
3 91 86
4 88 87
5 89 94
Media µ 90.0 89.6
SD 1.6 3.4
CV%=SD/µ*100 1.8 3.8
Curva di Distribuzione Gaussiana e
Qualità
Valore reale
Prevenzione degli errori
Standardizzazione Post-Analitica
• Pianificazione ed organizzazione della refertazione
• Refertazione cartacea ed elettronica
• Modalità di invio dei referti
• Valutazione dei tempi di risposta (routine - urgenze)
• Misura degli errori post-analitici (n° di errori % sul totale dei
campioni)
• Determinazione dei valori di riferimento (valori di “normalità”)
– Valori di riferimento relativi all'età, sesso, clinostatismo, ortostatismo,
ora del prelievo, etc
• Determinazione della variabilità biologica (intra- ed
interindividuale)
• Attendibilità diagnostica dei test di laboratorio
Variabilità Biologica
L’insieme delle caratteristiche morfologiche, biochimiche e funzionali di un
organismo
Lifestyle Drugs
Diet Environment
Age Microbiome
Variabilità Biologica
Response
Metaboliti
Response
Proteine
Response
Geni
Time
Variabilità Biologica
• La variabilità biologica è influenzata da diverse componenti:
– Individuali (età, sesso, ecc..)
– Etniche
– Ambientali
– Fisiologiche (ritmi veglia-sonno, …)
– Patologiche
– Farmaci e droghe
– Alimentazione
– Attività fisica
I parametri ematochimici variano fisiologicamente in ciascun individuo in funzione
del complesso sistema di equilibrio metabolico
• La capacità di determinare il peso relativo di ciascuna di queste
componenti costituisce un prerequisito fondamentale per
l’interpretazione del dato di laboratorio (risultato)
• Possiamo distinguere:
– Variabilità intra-individuale: variazioni nel tempo o longitudinali
– Variabilità inter-individuale: variazioni trasversali tra diversi soggetti
Variabilità Biologica
Variabilità biologica Variabilità biologica
inter-individuale intra-individuale
• Sesso • Ritmi circadiani
• Età • Variazioni
• Razza stagionali
• Massa corporea • Dieta
• Fumo • Periodo
• Alcool mestruale
• Farmaci • Gravidanza
0,1
Variaz. Rapportata alla Concentr.
0,05
calcio
magnesio
0
3 6 9 12 15 18 21 24 potassio
-0,05
-0,1
ora
Digiuno?
310
270
concentrazione
230
albumina
190 proteine
150 ALP
Colesterolo
110
70
30
0 8 16 24 32 40
settimane
L’esercizio muscolare
Se intenso e su individui non allenati, causa modificazioni della
concentrazione di molti parametri di laboratorio. Questi effetti
possono essere
Transitori
rapida diminuzione, e seguente aumento, nella concentrazione
degli acidi grassi liberi
marcato aumento dell’alanina e dell’acido lattico (triplicato).
Duraturi
variazioni a carico degli enzimi plasmatici: CK, aldolasi, LDH,
transaminasi; l’attività della CK può risultare raddoppiata nelle 12-
30 ore dopo attività sportiva intensa e ancora dopo 50 ore si può
riscontrare un aumento fino al 40%.
Calcolo della Variabilità biologica (VB)
• La VB può essere collocata nella fase pre-analitica del
processo diagnostico
• VB interindividuale:
– Calcolo teorico approssimato (ricomprende anche l ’ errore
analitico):
• Intervallo di riferimento/4 = SD
• (SD/valore medio dei valori di riferimento)*100= CVBinter
• Es: Cloro: (108-98)/4= 2,5
• CVBinter = 2,5/103*100 = 2,4%
• VB intraindividuale:
– Calcolo sperimentale
– Si effettuano almeno 3 prelievi al soggetto in esame in giorni diversi
– Si conservano i campioni fino al momento della determinazione
– Sui valori ottenuti si calcola: media, Deviazione Standard e CV%
– Il CV% ottenuto rappresenta la CVBintra
I VALORI DI RIFERIMENTO
Il dato di laboratorio serve per poter decidere un comportamento
verso un paziente. Bisogna quindi avere il mezzo per confrontare il
dato ottenuto con quello della popolazione da cui il paziente stesso è
tratto.
200
150
n° di soggetti
100
95%
50
0
60 70 80 90 100 110 120
2,5% 2,5%
concentrazione
Intervalli di Riferimento
300
Glicemia soggetti di
riferimento
250 Glicemia soggetti
diabetici
200
150
n°
100
50
0
70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 200
glicemia
Variabilità Totale intraindividuale (VTi) e
differenza critica
• La VTi si ricava dalla somma della variabilità analitica + la
variabilità biologica:
CVTi% = √(CVa)2 + (CVBintra)2
• La variabilità analitica deve essere sempre inferiore a quella
biologica
– Rapporto ottimale: CVa < 1/2 CVBintra
• Differenza critica > 2,77 * CVTi dell’analita
– Ci permette di calcolare se due risultati sono statisticamente differenti
in seguito alla terapia
– Es: CVTi del colesterolo = √(3%)2 + (8%)2 = 8,5%
– DC = 2,77*8,5 = 24%
– 1° Valore: 310 -2° Valore: 260= 50/310*100 = 16%
– 2.77x 8.5%= 23.54%
– La riduzione del 16% non è significativa
Attendibilità diagnostica dei tests di
laboratorio
• Prima di utilizzare un qualsiasi test di laboratorio è necessario
valutare la sua capacità di diagnosticare in modo corretto
• Il processo di valutazione consiste nel saggiare il test su campioni di
pazienti malati (VP) e non malati (VN), in modo da ottenere 4
possibili risultati:
– Vero Positivo: test positivo in presenza di malattia
– Vero Negativo: test negativo in assenza di malattia
– Falso Positivo: test positivo in assenza di malattia
– Falso Negativo: test negativo in presenza di malattia
150 VN VP
N°
Cut-off
100
50
FN FP
0
50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200
concentrazione
Affidabilità vs Validità
1
0,9 80 Cut-off point
90
0,8
110
0,7
0,6
120
VP
0,5
VP
0,4
0,3
130
0,2
0,1
0
0 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
FP