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BIOLOGIA & GENETICA

28/03/18

MECCANISMI E
REGOLAZIONE
DELL’ESPRESSIONE GENICA
Nelle lezioni precedenti sono stati trattati i meccanismi e la regolazione
dell’espressione genica in linea generale e a livello trascrizionale, il quale è stato poi
approfondito in quanto tipico, ed unico, meccanismo degli organismi procarioti. In questa
lezione si considerano basilari alcune nozioni impartite precedentemente, perciò è
consigliato lo studio propedeutico delle lezioni BIOLOGIA 22/03 E 27/03.

Per concludere il discorso sui meccanismi e sulla regolazione dell’espressione genica a


livello della cromatina e della trascrizione, è importante ricordare che tali processi avvengono
in risposta ad un segnale extra-cellulare (o dall’ambiente circostante o dalle altre cellule),
tramite meccanismo di traduzione del segnale: tali segnali attiveranno o inibiranno i geni che
controllano l’espressione genica nei suoi primi due livelli. I segnali che inducono
cambiamenti dell’espressione genica, indipendentemente dal fatto che siano interni o esterni,
sono generalmente transitori.
Questo fattore è fondamentale nelle cellule eucariote per il loro differenziamento
cellulare; tali segnali non verranno poi “dimenticati” ma bensì conservati definendo il destino
della cellula. Nelle varie divisioni cellulari si pensa che tali differenziazioni possano perdersi
in quanto il nuovo materiale genetico non è stato in alcun modo predisposto al segnale
transitorio. Però tale problema non sussiste nella progenie cellulare perché in essa sono
presenti alcuni meccanismi responsabili della memoria dello schema di espressine genica.
1) CIRCUITI A FEEDBACK POSITIVO DI FATTORI TRASCRIZIONALI: un
segnale transitorio esterno accende l’espressione di una specifica proteina la quale non
veniva precedentemente prodotta perché era richiesta per la trascrizione del proprio gene
(quest’ultimo è quindi silente), da qui in poi la suddetta proteina fungerà da fattore
trascrizionale il quale, oltre ad altri bersagli, continuerà ad attivare il gene che la codifica.
Tale proteina verrà poi distribuita nelle cellule figlie che “ricorderanno”, quindi, l’ormai
disperso segnale transitorio.
2) EREDITABILITA’ DELL’ETEROCROMATINA: durante la duplicazione del
DNA, le proteine che caratterizzano la struttura dell’eterocromatina si separano dalle
proprie unità nucleosomiche lasciando delle lacune sui semi-nuovi filamenti di DNA.
Questi, infatti, presenteranno nuovi ottameri istonici (frutto del riciclaggio degli istoni

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parentali con unità istoniche neosintetizzate) con parziali modifiche specifiche a cui solo
alcune proteine caratteristiche dell’eterocromatina possono riassociarsi. Ma grazie alla
capacità di quest’ultime nel reclutare un enzima capace di catalizzare la stessa modifica
su istoni adiacenti, i quali recluteranno a loro volta le mancanti proteine caratteristiche
dell’eterocromatina. Esempio di questo meccanismo di ereditabilità dell’eterocromatina è
la proteina (dell’eterocromatina) Hp1, la quale riconosce l’istone H3 metilato e forma un
complesso con l’enzima (una mutilassi istonica) SUV39H, capace di catalizzare la
metilazione dell’istone H3 dei nucleosomi adiacenti.

3) EREDITABILITA’ DEL PATTERN DI METILAZIONE DEL DNA: anche il


quadro di metilazione del DNA (= pattern) può essere ereditato. Nei mammiferi la
metilazione del DNA è un meccanismo di silenziamento genico quasi esclusivamente
associato alle citosine dei dinucleotidi CpG (Citosina legato al gruppo fosfato che a sua
volta si lega con la Guanina  le due basi sono consecutive l’una a l’altra ed essendo
anche fra loro complementari questo sequenza gode di simmetria nel DNA a doppia
elica); tale modifica non è casuale ed avviene grazie all’enzima (DNMT) DNA-
metiltrasferasi che rende la citosina del dinucleotide CpG una 5-metilcitosina. La
simmetria nel DNA a doppia elica è estesa anche alla metilazione, quest’ultima però si va
a perdere nella divisione cellulare, ed è qui che entra in gioco la DNA-metitrasferasi1
(anche detta “di mantenimento”), che, agendo unicamente sul DNA emimetilato,
riconosce le citosine neosintetizzate e quindi non metilate e ne promuove, la metilazione.
Tale meccanismo di mantenimento garantisce la conservazione del pattern di metilazione
nella progenie.
Questi meccanismi non possono essere definiti genici, dato che provocano solo
alterazioni stabili riguardo l’espressione genica senza intaccare in alcun modo la struttura
fondamentale, ed è per questo che sono definiti epigenetici, ovvero al di fuori della genetica
(convenzionale). Questi meccanismi si manifestano nel corso dello sviluppo embrionale e
sono mantenuti durante le divisioni cellulari, intervengono anche negli organismi adulti, ma
solo come risposta a cambiamenti ambientali; esistono casi in cui essi contribuiscano allo
sviluppo di fenotipi aberranti (nella quantità o nella continuità di produzione, chiaro

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riferimento alle cellule tumorali). È plausibile anche la riprogrammazione di tali alterazione
epigenetiche; infatti esistono molti studi che stanno sviluppando farmaci capaci di alterarle in
modo funzionale e strumenti capaci di veicolare questi farmaci con precisione dove essi sono
necessari.
Il flusso dell’espressione genica non ha solo punti di controllo nelle fasi pre-
trascrizionale e trascrizionale ma si estende bensì oltre l’intera post-trascrizione fino a
giungere a controlli traduzionali e post-traduzionali.
Dopo lo svolgimento del DNA e dopo la trascrizione del gene vi sono altri fattori di
controllo, detti post-trascrizionali: il processamento dell’RNA, il flusso di mRNA attraverso
il rivestimento nucleare, la demolizione dell’mRNA, il blocco traduzionale; e ulteriori dopo
la traduzione, detti post-traduzionali: modifiche per la maturazione del polipeptide e la
demolizione della proteina.

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CONTROLLO DELLA MATURAZIONE DELL’RNA MESSAGGERO
La maturazione dell’RNA implica le modificazioni delle estremità (il trascritto iniziale
possiede un cappuccio ed una coda di poli-A utili per riconoscimento molecolare) e la
rimozione degli introni mediante splicing; dopo ciò l’RNA è considerato maturo e può uscire
dal nucleo per giungere dunque al citoplasma.
È la regolazione dello splicing a fungere da punto di controllo post-trascrizionale 
infatti per esso esistono sia una regolazione attiva che una negativa.
Nella regolazione negativa dello splicing vi è un trascritto primario di RNA su cui è
presente un sito di splicing al quale solitamente il macchinario di splicing si lega per
promuovere il taglio degli introni, ma (essendo una regolazione tessuto-specifica) è possibile
che su tale sito si presenti un repressore specifico che legandosi vieti al macchinario di
splicing di avvicinarsi impedendo quindi il taglio del trascritto che rimarrà tale senza
maturare.
Nella regolazione positiva, invece, sul trascritto primario di RNA, oltre al sito di
splicing, è presente un sito di enhancer di splicing su cui si legherà un attivatore specifico. Il
macchinario di splicing però non riesce a legarsi al proprio sito se l’attivatore specifico è
assente, bloccando quindi la maturazione dello scritto; la presenza dell’attivatore sul sito di
enhancer veicola il legame tra macchinario e sito di splicing, il quale quindi promuoverà il
taglio degli introni e condurrà il trascritto alla maturazione.
È lo splicing alternativo, una regolazione dello splicing, che permette alle cellule di
creare una varietà di molecole di mRNA dallo stesso trascritto primario.
Di tale splicing alternativo vi sono 5 modalità:

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-salto dell’esone: un esone viene eliminato dal trascritto primario.
-esoni mutuamente esclusivi: solo uno di due esosi può restare nel trascritto, non
entrambi.
-sito di splicing alternativo 5’: il sito di splicing al 5’ viene considerato l’estremità 3’
dell’esone a monte.
-sito di splicing alternativo 3’: il sito di splicing al 3’ viene considerato l’estremità 5’
dell’esone a valle.
-introne conservato: non viene tagliato un introne nel trascritto.

Un buon esempio di splicing alternativo è la produzione diversificata di tropomiosine,


tale fatto dimostra come differenti modalità di splicing in tessuti diversi determinino la
presenza di un contenuto peculiare di esoni dell’mRNA per la proteina prodotto in ogni
tessuto.

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Sono circa 25.000 i geni che utilizzano lo splicing alternativo per produrre più proteine
diverse, per un totale che oltrepassa le 100.000.

CONTROLLO DEL TRASPORTO E DELLA LOCALIZZAZIONE


CITOPLASMATICA DELL’RNA MESSAGGERO
[nel nucleo è presente la lamina nucleare, un reticolo costituito dalle proteine fibrose
denominate lamine sottostante alla membrana interna. La lamina è importante in quanto
interagisce sia con la membrana nucleare interna che con la cromatina, della quale, si pensa,
gestisca l’organizzazione e il grado d’avvolgimento. Nel nucleo è presente un grosso
aggregato di macromolecole, il nucleolo; esso non è delimitato da membrana ed è il frutto
della decondensazione in anse di DNA contenenti i geni per l’RNA ribosomiale di 10
cromosomi interfasici (13, 14, 15, 21, 22). La sua composizione chiarisce la sua funzione
all’interno della cellula: sintesi dei ribosomi. In esso sono presenti i geni per gli rRNA, gli
rRNA precursori, gli rRNA maturi, gli enzimi di modificazione degli rRNA, proteine
ribosomiali e subunità ribosomiali parzialmente o totalmente assemblate. Il nucleolo, essendo
principalmente composto da DNA, durante la mitosi non compare più fino alla fine del
processo, dove i cromosomi riassumono la loro organizzazione lassa.]

TRASPORTO DELLE MACROMOLECOLE ATTRAVERSO IL NUCLEO


Importante per il funzionamento sia del nucleo sia del citoplasma è il trasporto di
materiale da uno all’altro e viceversa; infatti tutte le proteine sono prodotte nel citoplasma
incluse quindi le proteine ribosomiali, le proteine della cromatina (istoniche* e non), quelle
codificanti fattori trascrizionali e quelle necessarie per la replicazione; anche se queste
agiscono unicamente nel nucleo. Viceversa nel nucleo vengono prodotti tutti gli RNA
(messaggero, ribosomiale, e transfer) che agiscono esclusivamente nel citoplasma. È quindi
logico pensare che tale processo di trasporto sia predisposto e soprattutto regolato.
*anche se qui elencate, le proteine istoniche passano attraverso la membrana nucleare
per semplice diffusione.
Ed è il “complesso del poro nucleare” a formare la barriera che controlla il passaggio
delle macromolecole (discorso a parte per le molecole di dimensioni più piccole che possono
attraversare le membrane per semplice diffusione), le quali vengono trasportate tramite
segnali di smistamento che si differenziamo in base al verso del trasporto:
-NLS, segnale di localizzazione nucleare, se le proteine devono essere importate nel
nucleo; la suddetta andrà a legarsi poi con l’importina, proteina recettoriale che legandovisi le
media il movimento al poro.
-NES, segnale di esportazione nucleare, se le proteine devono essere esportate dal
nucleo; diametralmente al NLS, questa andrà a legarsi con l’esportina, proteina recettoriale
che veicola le molecole a cui si lega verso il poro nucleare.

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Questi meccanismi di trasporto attivo vedono come protagonista il complesso
GTP/GDP-RAN, il quale ciclicamente si lega al complesso recettore-proteina per farle
rilasciare la proteina e per riportare, poi, il recettore dove esso possa essere riutilizzato. La
RAN è una proteina che si lega alla GTP, permettendo a quest’ultima di formare un
complesso con i recettori specifici; la RAN è quindi il fulcro dei vari complessi che possono
viaggiare attraverso l’NPC, ovvero il complesso del poro nucleare. I meccanismi di
importazione e di esportazione sono identici riguardo la localizzazione della RAN-GTP e
RAN-GEF (fattore di scambio dei nucleotidi guanilici) nel nucleo e della RAN-GDP e RAN-
GAP (proteina/fattore attivante la GTPasi) nel citoplasma; cambia solo la finalità del legame
fra la RAN-GTP (l’unica che interagisce con il recettore): nell’importazione il legame con la
RAN-GTP permette al complesso, già nel nucleo, di poter rilasciare la proteina e di ritornare
nel citoplasma, mentre nell’esportazione essa promuove il legame dell’esportina con il
complesso ribonucleico (gli RNA uscenti si legano ai NES), da qui il complesso fuoriesce dal
nucleo ed entra in contatto con la RAN-GAP che idrolizzando la GTP in GDP la RAN rompe
il legame con il complesso ribonucleico che viene rilasciato nel citoplasma. Alla base di
questi due meccanismi ciclici c’è un gradiente di concentrazione della RAN-GTP che rende il
passaggio della membrana di per sé spontaneo, tale gradiente però è mantenuto dal lavoro di
GEF (nel nucleo) e GAP (nel citoplasma); l’ultimo, come già detto, idrolizza la RAN-GTP in
RAN-GDP mantenendo così la concentrazione della RAN-GTP bassa nel citoplasma, mentre
il GEF favorisce la sostituzione del GDP legato alla RAN con il GTP, mantenendo così alta
la concentrazione nucleare della RAN-GTP. La RAN-GDP viene riportata nel nucleo dal
trasportatore nucleare NTF2.

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Il meccanismo di esportazione è strettamente vincolato alla maturazione degli mRNA,
infatti solo quelli maturi presentano fra le giunzioni degli esoni dei recettori per
l’esportazione che dimostrano la conclusione dello splicing e quindi della rimozione degli
introni. Tali recettori permetteranno l’interazione fra l’mRNA e il NES e quindi la
formazione del legame che si andrà poi formare per giungere all’esportazione.
Sia l’importazione sia l’esportazione possono essere promosse o inibite, infatti sono
noti moltissimi esempi di regolazione dell’importazione nucleare di fattori trascrizionali.

Alcuni mRNA sono localizzati in regioni specifiche del citoplasma, tale localizzazione
è favorita da 3 meccanismi specifici che trasportano gli mRNA nelle regioni prestabilite:
1) Trasporto diretto sul citoscheletro: l’mRNA viene direttamente veicolato nella
regione.
4) Diffusione casuale e intrappolamento: l’mRNA casualmente naviga fino alla
regione dove gli viene concessa stabilità molecolare.
5) Degradazione generale in combinazione con protezione per intrappolamento: la
degradazione garantita dalla instabilità degli RNA, riduce la concentrazione di questi
nelle regioni in cui non gli è garantita alcuna stabilità molecolare.

CONTROLLO DELLA VELOCITA’ DELLA TRADUZIONE E BLOCCO


TRADUZIONALE
Esso può avvenire tramite due modalità dette globale (generico) e mRNA-specifico.
Il controllo globale si basa sulla fosforilazione del fattore di inizio della traduzione elF-
2, esempio utile alla comprensione di questo meccanismo è la regolazione della traduzione da
parte dell’eme durante la maturazione degli eritrociti. Questo meccanismo coinvolge una
chinasi chiamata HCI (inibitore controllato dall’eme), la cui attività è regolata dalla
concentrazione del gruppo prostetico: se presente esso agisce da regolatore allosterico e
l’HCI è inattivo, mentre in assenza dell’eme l’HCI fosforila specificamente l’elF-2
inibendola, e quindi blocca il complesso di inizio della traduzione, in particolare modo, della
emoglobina. Tale meccanismo evita la produzione di emoglobine inutili se data l’assenza del
gruppo prostetico a cui legarsi.

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Il controllo mRNA- specifico è, invece, basato su repressori che si legano alla regione
5’ non tradotta (antecedente al sito di legame per il ribosoma). Questa porzione di mRNA
tenderà a formare una forcina che verrà utilizzata come sito di riconoscimento dalla proteina
repressore della traduzione. Un esempio di questo meccanismo di controllo della traduzione
dell’mRNA ci viene dato dalla ferritina. La ferritina è una proteina di immagazzinamento del
ferro, la cui sintesi è selettivamente stimolata dalla presenza del metallo. Nella regione 5’ non
tradotta è presente l’IRE (elemento responsivo al ferro), ovvero una sequenza “a forcina” di
28 nucleotidi che tende a legarsi con una proteina regolativa e allosterica, chiamata Proteina
Che Lega l’IRE, solo quando vi sono basse concentrazioni di ferro; così facendo il complesso
IRE-proteina inibisce la traduzione dell’mRNA della ferretina. Essendo però allosterica
l’attività della Proteina Che Lega L’IRE è controllata dal legame con il ferro, il quale le
cambia la conformazione rendendo impossibile il legame con l’IRE e quindi rendendo
possibile la traduzione dell’mRNA per la ferritina.

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CONTROLLO DELLA STABILITA’ DELL’RNA MESSAGGERO
Questo tipo di regolazione si basa su tre fattori:
-la quantità di mRNA che dipende dall’equilibrio tra la velocità di trascrizione e
velocità di degradazione
-la stabilità di mRNA che dipende dalla sequenza, dalla struttura secondaria e dalla
lunghezza della coda di poli-A
-la stabilità di mRNA che può essere regolata in risposta ad uno stimolo
Il controllo della stabilità dell’mRNA è basato su proteine regolatrici che si legano alla
regione 3’ non tradotta (posteriore al codone di stop, vicina alla poli-A).
Un modo per regolare la stabilità dell’mRNA deriva dall’attività del ferro, il quale
svolge anche un ruolo nel controllo della degradazione dell’mRNA del recettore della
transferrina. Se il ferro è scarso, la sintesi del recettore per la transferrina è stimolata da un
meccanismo che protegge gli mRNA per il recettore dalla degradazione; infatti la Proteina
Che Lega L’IRE non cambia conformazione e si può legare all’IRE dell’mRNA
proteggendolo dagli enzimi degradativi; mentre alte concentrazioni di ferro promuovono il
cambiamento conformazionale della proteina allosterica, la quale perde la sua capacità di
legarsi all’IRE e non può più proteggere l’mRNA dagli enzimi degradativi; così facendo la
sintesi della proteina recettoriale è inibita. [Ovviamente IRE e Proteina Che Lega l’IRE di
questo esempio non sono le stesse discusse nell’esempio sulla ferritina.]

INTERFERENZA MEDIATA DA RNA (RNAi) O SILENZIAMENTO GENICO


POST-TRASCRIZIONALE (PTGS)
Esistono sistemi particolari capaci di bloccare la traduzione, tramite l’utilizzo di diversi
tipi di piccoli filamenti di RNA non codificanti (20/30 nucleotidi) che guidano nucleasi
distruttive in corrispondenza di specifici RNA codificanti, degradandolo; o che ne bloccano
la traduzione.

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Questi sncRNA si dividono in:
-miRNA: ne esistono alcune migliaia nell’uomo e regolano almeno un terzo dei geni
umani. Hanno geni abbastanza grandi e vengono trascritti dalla RNA-polimerasi II. Il
trascritto primario del miRNA forma una struttura a doppio filamento che inizia a essere
processata nel nucleo, dopo un primo accorciamento, per maturazione, il pre-miRNA esce dal
nucleo e viene subito tagliato dal DICER, un enzima che taglia il miRNA in filamenti maturi
a singolo filamento lunghi circa 21-22 nucleotidi. Dopo il taglio del Dicer il miRNA entra in
un complesso di assemblaggio RISC (complesso di silenziamento indotto dall’RNA), in cui
sono presenti varie proteine, una fra tutte l’Argonauta*. L’insieme di questo complesso (nel
libro denominato miRISC) andrà a silenziare l’espressione degli RNA contenenti sequenze
complementari a quella del miRNA; se l’appaiamento al messaggio-bersaglio è perfettamente
complementare quest’ultimo va incontro a degradazione rapida, mentre se l’appaiamento
mostra solo un parziale complementarietà il messaggero contenente il messaggio-bersaglio
non sarà degradato ma ne verrà inibita la traduzione (spesso l’effetto inibitorio è temporaneo,
ma riduce notevolmente la traduzione).
*L’Argonauta è una proteina che fa parte del complesso RISC ed ha molteplici
funzionalità in quanto è capace di tagliare e scartare uno dei due filamenti del miRNA, di
facilitare l’appaiamento del miRNA con l’mRNA e di tagliare l’RNA bersaglio
(ribonucleasi).

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-siRNA: meccanismo naturale di autodifesa tipico di piante, funghi e vermi; molto utile
a livello sperimentale. Questi si dividono in Exo-siRNA (introdotti in modo esogeno, tipico
di virus a RNA, transposoni e transgeni) ed Endo-siRNA (derivati da loco genomici
endogeni), i primi provocano una risposta simile ad una risposta immunitaria; ovvero sono
frutto del processamento di un RNA estraneo a doppio filamento che, dopo essere stato
tagliato dall’enzima Dicer, viene segmentato in piccole porzioni a doppio filamento
(siRNAs), le quali andranno ad attaccare gli stessi RNA che li ha prodotti; o legandosi al
RISC e seguire le due vie mostrate nei miRNA, oppure legandosi ad un altro complesso, in
cui l’argonauta è sempre presente, detto RITS, con cui può provocare la repressione al
proprio gene tramite la metilazione istonica o la metilazione del DNA. Gli Endo-siRNA,
invece, seguono meccanismi dissimili e poco chiari; di essi sappiamo che hanno fra le varie
funzioni la regolazione dell’espressione genica.

CONTROLLO POST-TRADUZIONALE RIMANDATO ALLA PROSSIMA LEZIONE.

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