Proteine di difesa Proteine regolatrici Proteine strutturali

Proteine di trasporto Catalizzatori biologici

 LE PROTEINE
Le proteine sono i biopolimeri piu' abbondanti negli organismi viventi
e svolgono funzioni biologiche di fondamentale importanza:

PROTEINE CATALITICHE Enzimi: maltasi, tripsina, lipasi, lisozima

PROTEINE REGOLATRICI ormone: insulina
PROTEINE DIFESA Veleni di serpente: Tetrodotossina e dendrotossina
Falloina (funghi), tossine batteriche (tetano e
botulino), anticorpi, gossipolo (cotone), ricina
PROTEINE STRUTTURALI Citoscheletro, cheratina (peli, lana, pelle, corno,
unghie), fibroina (seta), capside virale, collagene
(tendini e cartilagini),
PROTEINE DI TRASPORTO Emoglobina, citocromi, canali ionici
PROTEINE DI RISERVA Caseina, albumina, gliadina (grano), zeina (mais)
Chimicamente sono dei polimeri (poliammidi) composte da circa 20
alfa amminoacidi legati fra loro
In natura sono presenti moltissimi amminoacidi, ma nelle proteine
di qualunque organismo se ne' trovano solo 20 di tipo L

COOH
H2N H
R
carbonio alfa
catena laterale

Ad eccezione della prolina e dei suoi derivati, tutti gli amminoacidi

che si trovano comunemente nelle proteine possiedono questo tipo
di struttura.
 Strutture predominanti a pH 7
Amminoacidi con gruppi R apolari

Gly, G Ala, A
Pro, P, Val, V,

Phe, F

Leu, L Ile, I
Trp, W Met, M
 Amminoacidi con gruppi R polari

Ser, S
Thr, T Cys, C

Tyr, Y Asn, N
Gln, Q
Amminoacidi con gruppi R acidi Amminoacidi con gruppi R basici

Asp, D
Acido aspartico Acido Glutamico
Glu, E
Lys, K His, H
Stereochimica Arg, R

Gly = 0 Amminoacidi essenziali

Valina Arginina
Thr, Ile = 4
Leucina Istidina
Tutti gli altri = 2 Isoleucina Fenilalanina
Pro=ammina 2° Metionina Lisina
Treonina Triptofano
La selenocisteina (Sec, U) è un amminoacido naturale,
osservato per la prima volta nel 1986. Esso è il 21°
amminoacido conosciuto, considerato marginale fino alla
scoperta di un ulteriore amminoacido, il 22°, la
pirrolisina (Pyl, O) presente solo in alcuni archeobatteri,
scoperta nel 2004

N O
NH
OH
H3C H
O NH2
Amminoacidi non comuni
 PROPRIETA’ FISICHE
• Quando un amminoacido (sale con PF: 200°C) viene
sciolto in H2O diventa uno ione dipolare
(zwitterione) che può agire sia come acido
(donatore di protoni) che come base (accettore di
protoni): il gruppo carbossilico forma lo ione
negativo carbossilato (-COO-) mentre il gruppo
amminico viene protonato (-NH3+)
 pK1 pK2
a-amminoacido 3 lettere 1 lettera pkR gruppo R Pi %
-COOH -NH3+

Gruppi R apolari (9)

Alanina Ala A 2.34 9.69 5,97 7,8
Glicina Gly G 2,34 9,60 5,97 7,2
Prolina Pro P 1,99 10,96 6,48 5,2
Valina Val V 2.29 9.74 6.0 6,6
Leucina leu L 2,36 9,60 5,98 9,1
Isoleucina Ile I 2,36 9,68 6,02 5,3
Metionina Met M 2,28 9,21 5,74 2,3
Triptofano Trp W 2,38 9,39 5,89 1,4
Fenilalanina Phe F 1,83 9,13 5,48 3,9
Gruppi R polari (6)
Serina Ser S 2,21 9,15 5,68 6,8
Treonina Thr T 2,11 9,62 5,87 5,9
Asparagina Asn N 2.02 8.80 5.41 4,3
Cisteina Cys C 1,96 10,28 8,18 5,07 1,9
Glutamina Gln Q 2,17 9,13 5,65 4,2
Tirosina Tyr Y 2,20 9,11 10,07 5,66 3,2
Gruppi R basici
Arginina Arg R 2,17 9,04 12.48 10.76 5,1
Istidina His H 1,82 9,17 6,00 7,59 2,3
Lisina Lys K 2,18 8,95 10,53 9,74 5,9
Gruppi R acidi
Acido Aspartico Asp D 1.88 9.60 3.65 2,77 5,3
Acido Glutamico Glu E 2.19 9.67 4.25 3.22 6,3
 H Acido aspartico
HOOC-CH2-C-COOH +1 Isoelectric point is the
NH3 +
average of the two pKa
pK1 = 2.1 flanking the zero net-
charged form
H
2.1 + 3.9
HOOC-CH2-C-COO- 0 2
= 3.0
NH3+
Punto isoelettrico
pK2 = 3.9

H -2
-OOC-CH -C-COO-
2 -1 pK3
-1
NH3+
pK2
pK3 = 9.8 0
H pK1
+1
-OOC-CH -C-COO-
2 -2 [OH]
NH2
Istidina
 STRUTTURA PROTEINE
AMMINOACIDO
C-TERMINALE

O O O R1
R R1
OH + OH -H2O R
N
OH

NH2 N H2N H O
H H
AMMINOACIDO LEGAME
N-TERMINALE PEPTIDICO

2-7 aa = oligopeptide
8-49 aa = peptide
> 50 aa = proteina
 2° aa 4° aa

+ H 3N

1° aa 3° aa 5° aa
Caratteristiche di un legame peptidico
1. Inerte
2. Planare per permettere la coniugazione
3. Rotazione impedita attorno al legame
ammidico, trans
4. Rotazione dei gruppi R e R’ legati al
legame ammidico relativamente libera
infatti non tutti gli angoli di rotazione
sono permessi a causa degli ingombri
sterici delle diverse catene laterali e dello
scheletro stesso.
Combinazioni possibili con 20 aa
202 = 400 dipeptidi diversi 203 = 8000 tripeptidi diversi
Una proteina contenente una copia di ognuno dei 20 aa potra’
avere circa 20!=20x19x18x17…= 2 x 1018 diverse sequenze

O H O CH3 O
H3N+ N H N
N H N H O-
H O O
HO

OH
Seril-glicil-tirosil-alanil-leucina (Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu)
 PROTEINE
PROTEINA M.M. AA SUBUNITA’

INSULINA 5733 51 2

CITOCROMO C 13000 104 1

MIOGLOBINA 16.890 153 1

EMOGLOBINA 64500 574 4

ESOCHINASI 102.000 972 2

RNA POLIMERASI 450.000 4158 5

Le proteine possono
essere separate con
metodi cromatografici
ed elettroforetici
sfruttando le differenze
in dimensioni, carica
elettrica e polarità
dopo essere state
estratte da un tessuto o
da una cellula
microbica attraverso
omogeneizzazione e
centrifugazione
differenziale:
 Tecniche di separazione e purificazione delle proteine

1.Cromatografia per
esclusione molecolare
(gel filtrazione)
2.Cromatografia per
affinità
3.Cromatografia a
scambio ionico

4.Elettroforesi
CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO
Si usa una resina anionica
come fase stazionaria;
le proteine senza carica o
con carica netta negativa
passano attraverso la
colonna;
le proteine con carica netta
positiva si legano alla resina
spostando gli ioni sodio;
alla fine si aggiunge un
eccesso di ioni Na+ che
permettono il distacco e
l’uscita delle proteine;
la purificazione è scarsa
 CROMATOGRAFIA AD ESCLUSIONE MOLECOLARE

In questo tipo di cromatografia, detta anche a gel filtrazione, le molecole

vengono separate in base alle dimensioni
 CROMATOGRAFIA PER AFFINITÀ
La miscela di proteine
viene caricata su una
colonna contenente un
polimero che porta legato
un ligando specifico S per
la proteina di interesse
P1 .
Le proteine P2 e P3 non di
interesse vengono lavate
via dalla colonna
La proteina di interesse è
eluita dalla soluzione di
ligando aggiungendo un
alta concentrazione di
ligando libero
ELETTROFORESI

Elettroforesi si basa sul movimento in

un campo elettrico di particelle
cariche verso l’elettrodo di carica
opposta.
Le macromolecole (aminoacidi,
proteine, nucleotidi e acidi nucleici)
hanno una differente mobilità in
funzione della loro carica, forma e
dimensione.
 Il supporto più utilizzato è un gel costituito da poliacrilammide
(PAGE) o agarosio dove viene depositato il campione attraverso dei
pozzetti, successivamente viene applicato un campo elettrico che
consente la separazione delle macromolecole. Il gel viene poi
colorato con ninidrina (AA) per visualizzarle.

O O O-
COOH Calore
2 O + H2N H N + CO2 +4H2O + RCOH
15 min
R
O O O

Azzurro/violetto e giallo
 Struttura primaria: sequenza degli
amminoacidi legati tra loro da
legami covalenti peptidico
 Struttura secondaria: disposizione
regolare e ricorrente in una
dimensione dello spazio della
catena peptidica per mezzo di
legami a idrogeno
 Struttura terzaria: descrive tutte le
curve e i ripiegamenti
tridimensionali dovuti
principalmente a legami secondari
 Struttura quaternaria: unione di
piu’ catene proteiche dette
subunita’
STRUTTURA PRIMARIA
Ordine con cui gli
amminoacidi si susseguono
nella catena polipeptidica
Tale ordine non è casuale,
ma è rigorosamente
immutabile per ogni
particolare proteina di un
organismo.
Ogni proteina ha in ogni
individuo appartenente alla
stessa specie sempre la
stessa composizione in
amminoacidi, legati l'uno
all'altro sempre con lo
stesso ordine.
Struttura Primaria dell’insulina

ponti disolfurici
 DETERMINAZIONE STRUTTURA PRIMARIA

 Le differenze nelle funzioni delle proteine derivano da differenze

nella loro composizione e nella loro sequenza
 In particolare la struttura primaria di una proteina determina il
suo ripiegamento in una specifica struttura tridimensionale, che a
sua volta stabilisce la funzione della proteina stessa
 La proteina da sequenziare deve essere scissa in frammenti
sufficientemente brevi da poter essere sequenziati
individualmente, poi, partendo dalla sequenza dei tratti
sovrapposti, si ricostruisce la struttura primaria della proteina
intatta
1) Idrolizzare la proteina con HCl 6M a 100°C per 12-36 ore
(distruzione o modifica di parecchi amminoacidi); attraverso la
cromatografia a scambio ionico o HPLC e si determina il tipo e la
quantità di AA liberi (nessuna informazione sulla sequenza)
2) Determinazione degli amminoacidi N-terminali reattivo di Sanger
(DNFB); NB: ci sono proteine formate da più catene
polipeptidiche (2 inizi e 2 fine) oppure proteine chiuse (ne inizio
ne fine)

Sanger
3) La proteina è tagliata in frammenti più piccoli: ognuno viene
separato e poi sequenziato con la degradazione di Edman;
Degradazione di Edman: rimozione di un amminoacido alla volta
dall’estremità N-terminale; dopo circa 40 cicli diventa difficile
determinare la sequenza amminoacidica. Infatti dopo un numero
elevato di cicli, gli effetti cumulativi di reazioni incomplete e di
reazioni secondarie del processo rendono impossibile una
identificazione certa dell’amminoacido rilasciato e quindi della
sequenza amminoacidica. Per tale motivo la proteina da
sequenziare è scissa in piccoli frammenti polipeptidici.
a) Rompere i legami disolfuro irreversibilmente
b) Effettuare diverse idrolisi parziali per via chimica, ma soprattutto
per via enzimatica utilizzando enzimi specifici che portano alla
formazione di frammenti peptidici piu’ piccoli:
Tripsina: Lys, Arg (lato C)
Chimotripsina: Phe, Tyr, Trp (lato C)
Bromuro di cianogeno: Met (lato C)
Pepsina: Phe, Tyr, Trp (lato N)
1. Il reagente di Edman,
fenilisotiocianato,
reagisce con il gruppo
amminico N-terminale
di un polipeptide in
condizioni blandamente
alcaline, per formare il
feniltiocarbamile
2. Tale addotto è
trattato con acido
trifluoroacetico anidro
(F3CCOOH), che libera
il residuo N-terminale
sotto forma di
derivato tiazolinonico,
senza idrolizzare gli altri
legami peptidici
 Le principali strutture secondarie di una proteina

I fattori che determinano la struttura secondaria di una proteina e

che hanno l'effetto di rendere minima l'energia potenziale della
molecola sono:
• minimizzazione dell'ingombro sterico fra i gruppi R
• ottimizzazione della formazione di legami H intracatena

Il risultato di queste restrizioni fa sì che gli elementi di struttura

secondaria si possano ricondurre sostanzialmente a tre diverse
tipologie stabili:

anse o ripegamenti
 -foglietto I segmenti adiacenti
antiparallele parallele possono anche essere
lontani nella sequenza
amminoacidica
Le catene adiacenti
possono essere parallele
o antiparallele
I legami idrogeno si
formano tra catene
adiacenti
La conformazione beta si
estende a zig-zag invece
che a elica.
I gruppi R devono essere
abbastanza piccoli
(ingombro sterico).
 Irregolarità nelle strutture -foglietto e a-elica

Ripiegamento-: una comune irregolarità non ripetitiva che si ritrova

in foglietti -antiparalleli
 Ripiegamenti inversi
•Nelle proteine sono presenti tratti di catena apparentemente
disorganizzati, di lunghezza anche molto variabile: questi tratti, definiti
loop, fanno da collegamento fra α eliche o filamenti β.
•Sono relativamente flessibili e, soprattutto, consentono cambi di
direzione, anche repentini,
•Molto comuni sono i brevi loop di 3-5 residui che collegano due
filamenti β consecutivi, orientati in modo antiparallelo (β-turns).
•Nelle regioni loop è quasi costante la presenza degli amminoacidi
glicina o prolina
La struttura di “giro” di 180° comprende 4 aminoacidi di cui il primo
forma un legame idrogeno col quarto.
 Strutture supersecondarie
La combinazione di tratti a e  produce
a diversi tipi di strutture dette
supersecondarie (motivo)

I motivi si raggruppano per formare

strutture compatte dette domini
aa

Labirinto 

La chiave greca
:regolatrice, enzimatica
 STRUTTURA TERZIARIA
 E' la struttura tridimensionale della proteina ed è determinata
dall’interazione dei gruppi laterali della catena principale
mediante legami deboli (idrofobiche, idrogeno, dipolo) ma
anche forze elettrostatiche oppure covalenti come il ponte
disolfuro;

 La catena proteica tende a disporsi in modo da orientare i

gruppi R polari verso l'esterno dove vengono solvatati
dall'acqua, e i gruppi R idrofobi verso l'interno. In questo modo
la proteina si piega e si contorce per ottenere una
conformazione a minore energia.

 La struttura tridimensionale si ricava attraverso cristallografia ai

raggi X e spettroscopia di risonanza magnetica nucleare
bidimensionale NMR-2D
Ione metallico di
coordinazione

M2+
Proteine globulari di forma compatta, sferica, (struttura 2°
e 3°) solubili in acqua capaci di spostarsi nell'ambiente della
cellula (funzione catalica, trasporto, regolatrice, deposito)

Proteine fibrose sono costituite da catene polipeptidiche

disposte fianco a fianco in lunghi filamenti (struttura 2°).
Essendo insolubili in acqua, la natura le utilizza come
materiali costruttivi come muscoli, tendini, zoccoli, corna,
peli, unghie, capelli, seta (collageno, cheratina, fibroina)
 DENATURAZIONE
La funzionalità biologica di una proteina è strettamente correlata alla sua struttura.
Nella normali condizioni di pH e temperatura la proteina si trova nella struttura
terziaria, che corrisponde al minimo di energia libera. Se tali condizioni vengono
modificate si ha un parziale srotolamento con conseguente denaturazione e perdita
della struttura terziaria

Valori estremi di pH
alterano la carica
netta della proteina
Calore: vengono rotti i Solventi organici modificano modificandone i
legami piu’ deboli a 60°C le interazioni idrofobiche legami
 STRUTTURA QUATERNARIA
1. La struttura quaternaria riguarda proteine costituite da più
catene polipeptidiche uguali oppure diverse; ogni catena è
chiamata subunità (2-12)
2. Le subunità sono tenute insieme da legami non covalenti (forze
elettrostatiche, legami a idrogeno e interazioni idrofobiche)
Strutture quaternarie simmetriche
SINTESI DI PEPTIDI E PICCOLE PROTEINE (100)

Estrazione dalle cellule, reso difficile dalla bassa

concentrazione

Ingegneria genetica

Sintesi chimica normale oppure in fase solida (Merrifield):

permette di ottenere un peptide fino a 100 aa in qualche
giorno con una buona resa (una cellula impiega 5 secondi)
 O H O
+ N H C
C NH4
R OH R O
H
ammonia ammonium carboxylate salt
carboxylic acid
(solid)
PREPARAZIONE DEL DIPEPTIDE ALA-LEU
 Tutti i passaggi
sono ad alta
resa
I sotto prodotti
si rimuovono
tramite semplici
lavaggi
Il peptide resta
ancorato alla
resina
Procedura
completamente
automatizzata

 Si protegge il gruppo amminico dell’aa c-terminale

 Attacco dell’aa al gruppo reattivo della resina
 Rimozione del gruppo protettivo
Il gruppo carbossilico del 2 aa e’ attivato con DCC, mentre il gruppo
amminico e’ protetto con Fmoc
Gruppo amminico del 1 aa attacca il gruppo carbossilico del 2
formando un dipeptide
Si riparte da capo………