SECONDA UNIVERSITA DI NAPOLI

Di.S.T.A.Bi.F.

SPETTROSCOPIA

Telerilevamento

La tecnica che impiega la luce per ottenere informazioni sulle

propriet fisiche o chimiche di un campione prende il nome di
spettroscopia; si occupa quindi della misurazione e
dellinterpretazione della luce assorbita o emessa da un
campione.
2

Prevede lutilizzo di uno spettro, definito come la gamma di

colori o bande spettrali che si osservano per dispersione della
luce bianca.

La spettroscopia utilizzata nellanalisi chimica sia a scopo qualitativo

che quantitativo.
I metodi spettroscopici possono essere suddivisi in base al tipo di analiti
esaminati o al tipo di luce utilizzata. Se gli analiti studiati sono molecole
si parla di spettroscopia molecolare mentre lo studio degli atomi o
degli elementi prende il nome di spettroscopia atomica.
La classificazione pi comune tiene conto del tipo di radiazione utilizzata
e del modo in cui questa radiazione interagisce con la materia.

La spettroscopia nasce nel 1672 grazie a Isaac Newton che utilizz un

prisma per separare un fascio di luce solare bianca nei colori rosso,
arancione, giallo, verde e blu.

Permise di capire che la luce emessa da un certo materiale correlata

alla composizione chimica del campione.
1752: Acqua di mare + alcool, la fiamma generata assume una
colorazione gialla (presenza del sodio).
1826: Diversi sali aggiunti ad un campione davano fiamme di colori
5
diversi.

La velocit della luce nel vuoto una costante fisica (c) uguale a
299792458 m/s. La velocit della luce in un mezzo diverso dal vuoto
viene indicata con il simbolo v. Il rapporto tra c e v un parametro
noto come indice di rifrazione (n).

Assorbimento e rilascio della luce della materia

Telerilevamento passivo

Il rilascio di luce da parte della materia prende il nome di emissione.

Atomi, ioni o molecole passano da uno stato eccitato ad uno stato a pi bassa
energia.

Quando una sostanza chimica per rilassamento torna dallo stato eccitato ad
uno stato a pi bassa energia, deve rilasciare tale energia. Uno dei modi in cui
ci avviene attraverso lemissione di un fotone di luce. Il fotone emesso
avr unenergia esattamente uguale alla differenza di energia tra lo stato
eccitato iniziale e quello a pi bassa energia finale della sostanza in
esame.
La rappresentazione grafica della luce emessa dalla materia a differenti valori
di lunghezza donda, frequenza o energia prende il nome di spettro di
emissione.
La differenza di energia tra lo stato eccitato e quello a pi bassa energia di una
certa sostanza spesso un valore caratteristico di tale sostanza. La quantit
di luce emessa sar direttamente correlata alla quantit di sostanza.
8

Assorbimento: trasferimento di energia da un campo elettromagnetico a

unentit chimica.

Richiede che lenergia del fotone che deve essere assorbito sia esattamente
uguale al dislivello energetico esistente tra lo stato a bassa energia e lo stato
eccitato della sostanza in esame.
Intensit luce emessa dal campione < intensit luce assorbita
La luce rimanente che ha attraversato il campione si dice che ha subito un
fenomeno di trasmissione:
passaggio di radiazione elettromagnetica attraverso la materia non associato a
variazioni energetiche.
luce trasmessa + luce assorbita = luce ingresso campione
9

Il grafico dellintensit della radiazione assorbita (o trasmessa) da un

campione a diversi valori di lunghezza donda, frequenza o energia
detto spettro di assorbimento.

Sia la clorofilla a che la clorofilla b non assorbono luce tra 500 e 600 nm,
perci tali pigmenti e le piante che li contengono appaiono di colore
verde/giallo.
10

In natura il colore di qualsiasi oggetto che assorbe luce

determinato dai restanti tipi di radiazione luminosa trasmessa (o
riflessa) dalloggetto stesso.

11

ANALISI QUANTITATIVA IN SPETTROSCOPIA

12

La SPETTROFOTOMETRIA molecolare UV/Visibile

interessata ai fenomeni di assorbimento delle radiazioni
luminose della regione dello spettro elettromagnetico
appartenenti al campo del visibile (380 780 nm) e del
vicino UV (200 380 nm). Viene interessato anche lUV
lontano (10 200 nm), anche se in questo caso si opera
sotto vuoto o in atmosfera di gas inerte, perch lossigeno
atmosferico copre i segnali delle altre sostanze.

13

MONOCROMATORE

14

15

Lassorbanza il logaritmo negativo della trasmittanza

A = - log(T)
Secondo la legge di LAMBERT BEER lassorbanza A proporzionale
sia alla concentrazione della sostanza assorbente, sia allo spessore
dello strato attraversato, per cui pi elevata la concentrazione delle
molecole che passano dallo stato fondamentale a quello eccitato,
maggiore

sar

lassorbanza

(maggiore

sar

la

diminuzione

dellintensit del raggio incidente).

A=xbxC

16

17

Si applica alla
radiazione
monocromatica
ed lineare per
soluzioni diluite
< 0.01 M

18

19

20

21

Nell'analisi quantitativa spettrofotometrica fondamentale

conoscere come varia l'assorbanza in funzione della lunghezza
d'onda. Ci viene espresso molto chiaramente con il diagramma in
cui in ascissa si riportano i valori delle lunghezze d'onda e in
ordinata i corrispondenti valori dell'assorbanza. Si ottengono cos
delle curve (spettri) che variano da sostanza a sostanza e
presentano dei massimi caratteristici in corrispondenza di alcune
lunghezze d'onda.

22

Nell'analisi quantitativa lo spettro essenziale per la scelta

della lunghezza d'onda pi appropriata da utilizzare.
In genere verr scelta una lunghezza d'onda in modo che:
l'assorbimento sia massimo (per motivi di sensibilit, se
l'assorbimento alto possibile rilevare quantit piccolissime
di sostanza);
sia al centro di un picco 'largo' (per motivi di precisione, in
modo che piccole variazioni di lunghezza d'onda comportino
errori minimi sulla misura dell'assorbanza).
Nel caso di miscele di sostanze, la scelta per la determinazione
di una sostanza, cadr su una lunghezza d'onda dove le altre
sostanze assorbono il meno possibile.

23

SPETTROFOTOMETRI
Le misure di assorbanza devono tenere conto dellinevitabile
assorbimento dovuto al solvente e/o alla matrice in cui lanalita
disperso e alle pareti del contenitore della soluzione in esame.
In pratica lo strumento deve essere azzerato prima di ogni serie di
misure; bisogna indicare allo strumento ci che si considera come
assorbimento nullo.
Le diverse esigenze analitiche hanno portato alla realizzazione di
diversi tipi di spettrofotometri UV/Visibile:
strumenti monoraggio;
strumenti doppio raggio;
strumenti a serie di diodi;
strumenti a fibra ottica.

24

SPETTROFOTOMETRI
Gli spettrofotometri usati nellUVVISIBILE pi comuni sono il
monoraggio e il doppio raggio.
Lo SPETTROFOTOMETRO monoraggio si usa per lanalisi
quantitativa, ma pi sensibile alla temperatura, alla luce ed alla
stessa misurazione del bianco che deve essere ripetuta per ogni
misurazione.
Lo SPETTROFOTOMETRO a doppio raggio pi complesso e
costoso, ma consente una grande precisione e praticit anche nelle
analisi quantitative, poich registra il bianco una sola volta e poi
continua in automatico.
Uno spettrofotometro composto da:
1) SORGENTE di radiazione (lampade al Tungsteno o al
deuterio)
2) SELETTORE di lunghezze donda o MONOCROMATORE
3) PORTACUVETTE dove vengono inserite le CELLE
4) RIVELATORE trasforma lenergia radiante in un segnale
elettrico. I pi comuni sono detti celle (o cellule) foroelettriche.
5) LETTORE converte il segnale che proviene dal rivelatore in una
forma che pu essere usata dallanalista.

25

SCHEMA DI UNO STRUMENTO A

SINGOLO RAGGIO

IL MONOCROMATORE un
PRISMA o un RETICOLO DI
DIFFRAZIONE

Converte lIntensit
della radiazione in
Intensit di corrente

1) Si mette nella cuvetta il solvente e si misura lIntensit.

2) Si lava la cuvetta.
3) Si mette la soluzione e si misura lintensit.
4) Si fa il rapporto fra le due Intensit
26

SCHEMA DI UNO STRUMENTO A

DOPPIO RAGGIO
Il bianco (o riferimento) costituito
dal solvente senza la sostanza di cui
si vuol esaminare lassorbimento

La radiazione proveniente dal

MONOCROMATORE si divide in due raggi che
sono inviati contemporaneamente al campione
ed al solvente.

Il secondo raggio passa

attraverso il campione e
fuoriesce con lIntensit
trasmessa Icampione

Il computer
registra
entrambe in
modo alterno e
calcola il
rapporto.

27

Azzeramento e taratura dello strumento

Per una soluzione con concentrazione infinita si deve avere T=0 e
A mentre per una soluzione con concentrazione nulla si deve
avere T=1 e A=0.
Interponendo sul cammino dei raggi luminosi uno schermo
perfettamente

opaco

(che

rappresenta

una

soluzione

concentrazione infinita) lo strumento deve segnare 0 sulla scala

delle trasmittanze; per la maggior parte degli strumenti, questa
operazione automatica e quindi non necessario eseguirla (in caso
contrario esister un dispositivo atto ad imporre la condizione T=0.
La taratura a concentrazione nulla (A=0) viene invece effettuata con
il cosiddetto azzeramento contro il bianco.
28

Significato dell'azzeramento contro il bianco

Quando il raggio di luce monocromatica investe la celletta contenente il
campione, avvengono diversi fenomeni: riflessione, rifrazione, assorbimento
da parte delle pareti della celletta, del solvente e di tutti i reattivi aggiunti per
formare il composto colorato, e ovviamente della sostanza in esame.
L'assorbanza effettivamente misurata risentirebbe quindi di numerosi fattori
non legati alla concentrazione della sostanza in esame, portando quindi ad
errori nella determinazione della concentrazione di quest'ultima.
Per aggirare questo problema, prima di misurare l'assorbanza del campione
in esame, si azzera l'assorbanza introducendo il bianco, cio una celletta
identica a quella del campione e che contiene una soluzione il pi possibile
simile a quella del campione ma in cui assente la sola sostanza in esame.
29

Non effettuando l'azzeramento contro il bianco si perder la

proporzionalit diretta tra A e concentrazione, cio non si
otterr una retta passante per l'origine nel grafico C-A.

30

31

Alcune frodi comuni:

a) extravergini contenenti oli raffinati, di oliva e di semi;
b) oli con parametri analitici non conformi alla
classificazione;
c) oli di semi commercializzati come oli di oliva.

32

Analisi spettrale U.V.

Questo esame, oltre a fornire utili elementi di giudizio
sulla qualit di un olio, ha permesso di risolvere
definitivamente il problema del riconoscimento dell'olio
rettificato eventualmente aggiunto all'olio di oliva vergine,
sfruttando il fatto che gli oli naturali di pressione non
contengono doppi legami coniugati che invece si formano,
sia

pure

in

misura

minima,

durante

la

rettifica,

particolarmente nella fase di decolorazione su terre

attive.
33

Ne

consegue

che

rettificati

presentano

valori

di

assorbimento nell'UV, particolarmente nella zona intorno ai

270 nm, notevolmente superiori a quelli degli oli vergini. Infatti
i gruppi etilenici isolati, oppure i gruppi carbossilici degli acidi
grassi, presentano massimi di assorbimento tra 175 e 185
nm, cio al di fuori della zona utilizzabile dello spettro UV che
inizia, come noto, a lunghezze d'onda superiori a 200 nm.
Invece la formazione di idroperossidi in acidi grassi polinsaturi
provoca uno slittamento del doppio legame con formazione di
un sistema dienico coniugato che assorbe a 232 nm.
34

Durante la rettifica degli oli lampanti perossidati, il passaggio

su terre attive provoca la formazione di trieni coniugati (aventi
una banda di assorbimento, con tre massimi, intorno ai 270
nm) verosimilmente per decomposizione di un idroperossido
linoleico.
Anche la formazione di composti chetonici, per ossidazione
ancora pi spinta, provoca un maggiore assorbimento che si
manifesta attorno ai 270 nm.
L'esame UV viene condotto sull'olio disciolto in opportuno
solvente (cicloesano o isottano) nell'intervallo compreso tra i
220 e i 280 nm. Le lunghezze d'onda pi significative sono
232, 262, 268 e 274 nm.

35

36

Il comportamento spettrale notevolmente diverso nei tre tipi di

olio, ci permette di individuare anche piccole aggiunte di
rettificato o di sansa, all'olio di oliva vergine.
Lassorbimento dellolio doliva vergine decresce rapidamente
verso valori molto bassi nella zona di lunghezza donda compresa
tra 260 e 280 nm. Landamento della curva praticamente
parallelo all'asse delle ascisse. In ordinata sono riportati i valori di
assorbanza.
Nel caso del rettificato, e nel caso dell'olio di sansa, i valori di
assorbanza in tale zona sono molto pi elevati, la curva assume
un andamento caratteristico con tre massimi, dovuti alla presenza
dei trieni, dei quali il pi accentuato quello centrale a 268 nm.
37