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MODULO 2

Flusso dellinformazione genetica nelle cellule


Lanaturachimica del materiale genetico. Mendel non conosceva la natura chimica
della molecola che permetteva di immagazzinare e trasmettere informazione
ereditaria. Miescher isola la nucleina da pus e sperma di salmone una sostanza
contenente fosforo. Allora alcuni ritenevano che il materiale genetico si trovasse
nel nucleo. Altri ritenevano che il materiale genetico fosse rappresentato dalle
proteine. Nonsi comprendeva infatti la natura delle proteine. Le proteine inoltre
erano molto pi complesse mentre il dna appariva molto semplice. Si aveva una
grqande variabilit di sequenza. Il dna si ritenevaun polimero semplice dato dalla
riproduzione monotona delle stesse proteine. Cominciarono esperimenti per
dimostrare quale delle due molecole fosse la trasportatrice del messaggio
genentico.
1928 esperimento di griffith: trasformazione batterica
Esperimenti usando pneumococco che esiste nel ceppo s liscio e ceppo r ruvido.
Quello liscio perch le cellule producono una cellula polisaccaridica che conferisce
laspetto liscio. Inietta cellula del ceppo s viventi nel topo. Il topo muore. Se invece
inietta le cellule vive del ceppo r nel topo i batteri non producono la morte nel topo.
Il ceppo r quindi non mortale. Poi uccide al calore le cellule del ceppos e le
inietta. Il topo sopravvive. Infine mescola cellule viventi del ceppo r con cellule del
ceppo s uccise con il calore. La miscela iniettata nel topo lo uccide. Prelevando il
sangue del topo si nota che crano solo cellule di tipo s con capsula
polisaccaridica. Conlcuse che doveva esistere un principio trasformante che
rimaneva attivo anche dopo luccisione delle cellule che trasformava gli r in s. non
sapeva per cosera il principio trasformante.
Avery riprende gli esperimenti di griffith: qual il componente responsabile
dellattivit trasformante? Vengon prese cellule del ceppo s e vengono frazionate in
tutte le componenti(lipidi, proteine, carboidrati, dna,rna) tutte queste componenti
vengono aggiunte a terreni in coltura a batteri di tipo r. solo quando veniva dato il
dna dei batteri s gli r si trasformavano in tipo s. la classe di molecole che porta
linformazione ereditabile il dna. Esperimento chiave che concludeva che la
molecola portatrice di informazione ereditaria era il dna. Cerano scettici che
sospettavano che il dna non fosse stato purificato bene. Riprova dellesperimento
precedente: vewngono presi gli s uccisi al calore e se ne ottiene un filtrato, messo
poi in tre provettecon culture di r. Nelle provette vengono messi enzimi(rnasi,
proteasi e dnasi). Aggiunto a fiaschette in cui venivano coltivate fiaschette.
Soltanto quella con la dnasi non si aveva trasformazione degli r in s. nelle altre due
si ha trasformazione. Rimanevano comunque degli scettici. I batteri s che possono
secernere la capsula morti danno dna che pu essere integrato dagli r che contiene
il dna per secernere la capsula polisaccaridica.
Esperimento di hersey e chase: batteriofago o fago t2: i batteriofagi si legano alla
membrana batterica e poi spremono il loro materiale genetico dentro la cellula
batterica. Il fago t2 viene usato perch formato da proteine che formano il
capside e dna nel materiale genetico. Vengono realizzati due ceppi cdi fagi

diversamente marcati, uno nella parte proteica con lisotopo s35 e un altro ceppo
di fagi marcato nella componente nucleica p32. Come ci si procurano i due ceppi di
fagi diversamente marcati?il fosfato e il solfato vengono usati per la sintesi dei
componenti. I terreni di coltura saturi di questi materiali permettono
incorporazione.
Una volta ottenuti i due ceppi vengono mescolati con i batteri. I fagi infettano le
cellule batteriche. Il liquido viene messo in un frullatore. I fagi allesterno dei batteri
sono separati falle stesse cellule batteriche. La parte proteicha che si trova
allaesterno della cellula si allontana.viene poi misurata la radioattivit del
sovranatante che contiene i capsidi virali. Nel caso della 35 s si aveva radiattivit
nel sovranatante.il 32p presentava radiattivita nel sedimento.le generazioni
successive presentavano radioattivit. dimostrato quindi che il materiale genetico
il dna.
1944 4 1952 charhaff usa metodicromatografici per dimostrare che:cellule diverse
di una stessa specie hanno stessa percentuale delle 4 basi. La percentuale non
varia in base alleta al tipo di tessuto ecc.. la composizoine in basi del dna varia da
specie a specie. I
A:Tstesso numero.
G:C hanno lo stesso numero.
Purine a g la quantit di purine la stessa delle pirimidiene.
Pirimidine tc
Whatson e cric propongono ilmodellostrutturale del dna a doppiaelica.
I due filamenti sono antiparalleli con basicomplementari.ladoppia elica vre3bbeavuto
diametrio troppo piccolo per due purine e troppo lungo per pirimidine. 3 tra citosina e
guanina legami idrogeno.2 legami a idrogeno tra purina e pirimidina.
Questo modello faceva intuire come potesse avvenire replicaiozne del dna. Ogni
filamento fa da stampo dopo la seprqazione, cos si ha replicamento semiconservativo
Dna-b avvoglimentoinsensodestrosrso. Conformazione meno stabile dna z
Interconversione tra forma rilassata e superavvolgimento, siaindna circolare che
lineare.- il superavvolgimento condiziona la capacit della molecola di interagiere con
altre molecole.ilsuperavvolgimento negativo o positivo. Il positivo favorisce un
maggiuioravvoglimento e favorisce la non accessibilit- il negativo permette alle
proteine coinvolte nella trascrizione di accedere..
Intervconversione tra stato avvolto e rilassato catalizzato dalle topoisomerasi,
inducono rotture transitorie su dna.
Topoisomerasi 1<: fa una rottura e il filamento intatto passa attravewrso la rottura e
poi si ha nuovamente la saldatura. La topoisomerasi 2 habisogno di atpeffettuadue
tagli transitori sulladopia molecola. La regione intatta viene fatta passare attraverso la
rottura.

I due filamenti della doppia elica possono essere separati per denaturazione e
riassociati per rinaturazione. Allaumentare della temperatura lenergia termica induce
la denaturazione rapida della molecola. La molecola si scinde nei due filamenti una
volta raggiunta la t critica.
La temperatura dipende dalla quantit di coppie cg>(che hanno tre legfamia
idrogeno e quindi formano un colegamento molto pi forte.
Rinaturazione del dna: raffreddamento dna nativo
Dimensioni delgenoma: espressa come numero di coppie di base nucleotidiche. E.coli
contiene contienemoltissmime coppie di basi.
Mettendole in una tabella curioso notare che la quantita di pb nei mammiferi molto
inferiore di quella dei protisti.
Con gli enzimi di restrizione pissiblie studiare il dn.talgiano il dnaalivello di siti
specificiche possono essere specificamente studiati. I pezzi tagliati vengono messi su
un gel. Viene applicata una differensza di potenziale. Si ha migraizone die segmenti di
dna attraverso lanodo. Dopo un tempo suffucente viene rimosso il gel.il bromuro di
etidio che viene poi aggiunto rende fosforiescenti i frammenti del dna. I frammenti pi
corti stanno vicino allanodo.
Modello direplicazione proposto dawatson e cric: apertura della doppia elica.ogni
filamento fadastammpo per la sintesi del filamento complementare.la duplicazione
semiconservativa era ffiancata da altre due ipotesi
Replicazione conservativa: le due eliche si aprono e formano i due filamenti figli. Le
parentiali poi si richiudono su se stesse e anche le figlie.
Replicazione dispersiva: le eliche sono formate da frammenti di dna vecchio e nuovo
dispersi su ogni filamento.
Meselson e stahl :partono dal principio di poter riconoscere in base al peso molecolare
la catene vecchie e nuove. N14 isotopo leggeri poteva essere sostituito con n15. Era
stabiole come isotopo e quindi non influiva nella sintesi del dna. Lincorporazione
dellisotopo pesante determina aumento di dna che pu essere misurata mediante
centrifugazione.
Centrifugazione in cloruro di cesio>: provette in centrifuga. Mettiamo conc. Di cloruro
di cesio e dna con diverse densit. Quando si centrifuga il cloruro di cesio forma un
gradiente. Grigio chiaro in altor e in basso grigio scuro. Il dna andr a galleggiare nel
punto della provetta dove la densit della soluzione si equivale alla sua.
Venivano usati batteri di e coli in mezzo di coltura contente 14n.messo in provetta il
loro dna con cloruro di cesio. Si ottiene la banda di dna leggero. Quando i batteri sono
fatti crescere in metodo di coltura con azoto 15.(dna sempre estratto e poi
centrifugato non viene centrifugato il batterio) viene una banda di dna pesante.
Esperimento di meselson e st: batteri fatti crescere in n15. Poi centrifugato. Si nota
che stratifica in 1. Entrambi i filamenti di n15. La crescita viene poi fatta proseguire in
un mezzo di coltura contenente n14. Aspettano il tempo di una replicazione 20 minutie

quello di una seconda 40 minuti. Gli viene prelevato dna, poi centrifugato: trovano una
banda intermedia tra dna pesante e dna leggero. I batteri trasferiti su n14 avranno un
parentale con n15 e uno nuovo con n14. Alla seconda generazione dopo 40 minutisi
trovano due bande, una intermedia e una che stratifica dove stratifica il dna leggero
entrambi n14,
la seconda generazione ha batteri con il filamento parentale n15 e n14 e batteri col
solo dna n14.questo esperimento serviva per dimostrare che lipotesi
semiconservativa era giusta e potevano essere confutate le altre due ipotesi,
conservativa(alla prima divsione dovevano esserci due straficazioni una n14 e una n15
ma risultava una sola banda) e dispersiva(ci sarebbe statA comunque una banda
intermedia con questo modello ma alla seconda generazione i risulatati erano in
contrasto perch non si aveva ununica stratificazione tra ibrido e leggero.
La replicazione dledna: ci sono differenze per la replicazione nei procarioti che hanno
dna circolare mentre gli eucarioti hanno molecole di dna lineare. Replicazione del
dnaciroclare dei batteri: proteine iniziatrici si attaccano allorigine di replicazione(unico
nei batteri, molti negli eucarioti)
Le proteine iniziatrici svoglono la doppia elica usando atpepermettono laccesso ai
singoli filamenti. Replicazione bidirezionale con due forcelle di replicazioni. Nei batteri
la replicazione detta teta per la forcella che ha la forma dellalfabeto greco. Finita la
replicazione le due molecole rimangono unite ma le topoisomerasi operano dei tagli e
le due molecole si separano. La molecola di dnaadersice alla memebrana della cellula.
La membrana aumenta e poi si ha la diivsione per scissione binaria.
Negli eucarioti ci sono tanti punti di origine di replicazione da cuisi originano i
repliconi(bolle direplicazione) i repliconi si fondono e abbiamo filamento parentale e
neosintetizzato. Diversi gruppi di proteine iniziatrici. 1Complesso orc(riconoscimento
dellorigine e lega ogni inizio di repplicazione.
2Complesso mcm (dnaelicasi che svolgono la doppia elica)
2Caricatori delelicasi: mediano legame mcm allorc.
Queste proteine123 si chiamano complessodiautoinizio. Quando il complesso si forma
il dnapuo fare la replicazione.
Nei punti di inizio si trovano sempre coppie a-t che contenendo solo due legami a
idrogeno e quindi sono piu facili da rompere.
Il processo di autorizzazione alla replicazione dledna. Dopo che il dnasi replicato
alloriginedi replicazione non pu piu replicarsi dal quel punto fino alla ifne della
meiosi. La geminina inibisce il processo di autorizazionee sisntetizzata durante la
fase s. pu essere bloccato anche da cdk.fosfroilazione delle proteine.il processo
attivo in g1 e poi bloccato alla fine di g1 fino alla fase m.(salta s g2 e m)
Unione di nucleotidi mediante complementariet ei nucleotidi

Dnapolimeras: catalizza lallungamento. Si formaunlegmaefosfoesterico tra il gruppo


tre primo oh dellultimo nucleotide e il cinque prtimo fosfato delldesossiribonucleoside.
Nei batteri esistono denapolimerasi 1 2 3 4 5 ma quella piu attiva la tre, principlae
enzima della replicazione. Le 2 4 5 hanno ruoli specializzati associati alla riparazione
del dna.
Negli eucariotisono stati scoperti diversi tipi di dnapolimerasialfa teta epsilon.la
gamma stanella replicazione del mitocondriale. Le altre servono per correzione dna
danneggiato e replicaizonedna. La PCR usa la tac polimerasi isolata nel batterio
termusacquaticus
La delta quella del dna genomico. La dna polimerasi va solo in direzione 5 3. Come
fa un enzima a replicare la molecola che va da 53 e lantiparallelo
Filamento anticipato o guida. La replicazione procede senza interruzionementre un
iflamentoinritardo dove si formano frammenti di okazaki e la sintesi discontinua. La
sintesi continua per il filamento anticipato mentre discontinua nella direzione
opposta per il filamento ritardato. Perch non si ha un enzimacheisntetizza al
contrario-? Perch haanche funzione esonucleasica di correizonedelle bozze. La
risposta legata alla necessita di correzione durante la replicazione dledna.
Come avviene la sintesi del dna: batteri: ladna polimerasi non puo sintetizzare dna
partendo da solo mahabisogno di un innesco, tratto di dna o rna. Filamento di rna a
cuisi possono aggiunegere nucleotidi. Nei batteri la primasi si lega a uno stampo e
sintetizza un iniziatore. Nei batteri subentra la dna polimerasi 3 che aizona attaccando
nucleotidi allrna iniziatore.
Subentra allora dna polimerasi uno che degrada linnesco e sintetizza il dna. Subentra
la dnaligasi che unisc ei filamenti di dna.
Il filamento ritardato ha frammento okazaki che vengono poi legati con legame
fosfodiestere.
Proteine coinvolte nello svoglimento dellelica: ligasitopoisomerasi(creano
puntidirotazoine creando mlecole a doppio o singolo iflamento) nelle
colilagirasiintriducesuperavvolgimenti positivi che rilassano la doppia elica.
Ci sono proteine che impedisocnocheildna si richiud. A questo punto formata la
forcelladireplicaiozne.
Il dnadelfilamentoritardatoripeigatoa ansa permettendo
allednapolpresentisufilanteritditrovarsiaccantoeprocederenella stessa dir. Anche se i
filamenti nella molecola parentaleerano orientati conpolarita diversa
Quando completata la replicazione su ogni dna figlia rimasto un innesco. Quando
gli inneschirimasti vengono eliminati non cunadna polimerasi in grado di aggiungere
nucleotidi a 3 oh. Nel corso dellevoluzione allora si sono sviluppati i
telomeri,estremit del cromosoma. Sono sequenze altamente ripetute allestremit di
goni cromosoma lineare. Ttaggg un esempio di telomero umano. Contengono da 100
a 500 copie ripetute di questa sequenza. Dnanon codificante che garantisce che anche
le la molecola di dna si accorcia un po durante la formazione non per de la sua

informazione. La telomerasi catalizza la formazione di copie addizionali della sequenza


telomerica.la telomerasi una polimerasi speciali costituita da parte proteica e tratto
di rna.
Si forma legame telomerasi dna per appaiamento di basi complementari.vengon
aggiunti nucloetidi allestremit 3
Danno e riparazone del dna il dna la sede dellinformazione
genetica.questamolecoladeveesseremoltostabile?no dinamica soggetta a alterazioni
struttura chimica e sequenza delle basi. Lesioni e danni al dnachehanno conseguenze
Bloccare replicazione e trascrizione o creare basi modificate che non compromettono
la replicazionemavengono trasformati in mutazioni ereditabili
La sopravvivenza dipende dalla possibilit di correggere gli errori.
Le mutazioni per permettono nahce la variabilit genetica se non risultano mortali.
Instabilit genetica: pu tradursi in cancoro e malattie genetiche o in biodiversit.
(bilancio della vita)
Lesioni spontanee al dna(errori durante la replicaizone) inserzione scorretta di
nucleotidedurante la replicazione causa il mismatch se non viene riparato prima della
successiva replicazione diventa mutazione
Citosina diventa uracile se gli vinee tolto il gruppo amminico.
Possono venire rimosse putine o possono avvenireossidazioni
Cambiamentichimicispontanei. Le basic a g hanno gruppi amminici che possono venire
rimossi spontaneamente incondizioni particolari di ph e t. laddotto 8-oxo g pu
appaiarsi sia cona che con c
Deaminazione della citoina produce uracile che si appaia con adenina durante
replicazione adenina appaia timina dnado origine a ta al posto di cg
Nel dna alcune citosine sono metilate naturalmente e esistono come 5mc che
deaminata diventa timina.
La depurinazione ossia perdita di base purinica. Se ne va una g e rimane un sito
apurinico nel filamento neosintetizzato viene incorporato un nucleotide con una base a
caso e frequentemente una adenina.la base errata viene usata come stampo e per
esempio potrebbe andarci una timina
Lesioni indottte da fattori esogeniu quali rqdiazioni ionizzanti. Ultravioletti e e agenti
chimici.
Agenti fisici: raggi x gamma e cosmici.
I ragi x fanno rotture su entrambi i filamenti di dna. I raggi uv sono meno penetranti
delle radiazioni ionizznti ma provocano la fusione di due pirimidine adiacenti. Si
formano dimeri di clorobutano pirimidina

Agenti chimici: analoghi delle basi 5 bromo uracile che forma legami con ladenina ma
con la forma ionizzata si possono formare legami anche con guanina. Agenti
idrossidanti: aggiunta di un gruppo oh alla citosina porta alla formazione di
idrossicitosina che si pu appaiare con adenina. Agenti alchilanti: la metilazione della
posizione o6 porta alla formazione di etilguanina che si pu appaiare con timina.
Agenti intercalanti>: vengono incorporati nella molecola di dna che portano a frame
shift.
Analoghi delle basi azotate sono mutageni chimici. Il 5 bromo uracile possiede un
atomo di bromo anziche un gruppo metilico. Il 5 bromo uracile genera un errore di
replicazione. Nel corso della replicazione il 5 bromo uracile viene incorporato al posto
della timina. Alla replicazione successiva il 5 bromo uracile pu appaiarsi con
guanina.mutazione per transizione della coppia ta a cg.
Agenti intercalanti; proflavina bromuri di edidio acridina: si inseriscono tra basi
adiacenti in uno i n entrambi i filamenti a doppia elica.