Il campione biologico: generalit

Per eseguire le analisi di biochimica clinica in maniera ottimale e per fruire al meglio del dato
analitico necessario che al laboratorio venga fornito il campione, siglato e raccolto in maniera
idonea in relazione allesame richiesto e il modulo di richiesta dettagliato ed interamente compilato.
Questo assicura che
1. venga eseguito lesame necessario,
2. che siano puntualizzati i valori di riferimento in base al sesso ed et del soggetto,
3. che siano valutate eventuali interferenze sul risultato,
4. che il risultato analitico sia prodotto nel minor tempo possibile.
Il campione biologico
Possono essere oggetto degli esami di laboratorio di biochimica clinica tutti i campioni biologici
(fluidi, tessuti, frammenti bioptici) purch siano rappresentativi dei sistemi da investigare.
La scelta del campione biologico dipende dalle indagini da eseguire.
I campioni di solito utilizzati sono i campioni di sangue e i campioni di urine. Per le indagini
ematologiche e biochimico-cliniche di routine si utilizza preferibilmente il sangue venoso, mentre il
sangue arterioso viene utilizzato per lo studio dei parametri dellequilibrio acido-base.
Per alcuni esami pu essere richiesto luso di specifici campioni biologici, quali: feci, fluido
cerebrospinale (LCS), biopsie di tessuto o cellule, calcoli, aspirato (fluido della pleura, asciti, fluido
sinoviale, fluido intestinale), liquido amniotico.
La richiesta degli esami di Biochimica Clinica
Il modulo di richiesta, oltre alle notizie anagrafiche (nome, cognome, provenienza, et, sesso) e
nosografiche (struttura clinica di provenienza, medico richiedente di riferimento), deve riportare sia
notizie reletave al paziente che relative al prelievo, quali:
1. il sospetto diagnostico; ci permette di definire lurgenza dellesame (dato che in alcuni
laboratori esistono linee analitiche separate per la routine e per le analisi urgenti);
inoltre, la conoscenza del sospetto clinico permette anche di prevedere i valori di alcuni
analiti, ed effettuare eventuali diluizioni del campione stesso;
2. lindicazione delleventuale terapia in corso, poich diversi farmaci possono creare
interferenze analitiche con i metodi usati per il dosaggio, oppure possono alterare
realmente i livelli ematici di un parametro di laboratorio;
3. la data e lora del prelievo; infatti, per numerosi analiti si possono verificare delle
variazioni dei livelli in diverse ore della giornata, in base alla presenza di ritmi
circadiani;
4. il tipo di indagine da eseguire (prelievo basale, prova da carico, prova funzionale, prova
circadiana).
Le etichette applicate alle provette devono essere del tipo inasportabile e devono riportare le
indicazioni necessarie allidentificazione univoca del paziente e dellesame richiesto. In molti
laboratori si iniziano ad utilizzare sistemi di identificazione mediante codice a barre, per ridurre gli
errori; inoltre, le linee guida internazionali oggi indicano la necessit di usare un doppio codice di
indentificazione (es. nome e data di nascita, oppure codice fiscale) perch, soprattutto nel caso di
indagini di biologia molecolare clinica pu capitare che nella stessa giornata vengano analizzati
campioni appartenenti a diversi membri di una famiglia con lo stesso nome.
Standardizzazione del prelievo venoso
La standardizzazione dei metodi di raccolta e di pre-trattamento dei campioni biologici una delle
fasi pi importanti e delicate dellintero processo analitico, in quanto preservare le peculiarit
chimiche, biologiche e morfologiche del campione stesso contribuisce al buon esito dellanalisi di
laboratorio.
Errori di campionamento rientrano nella cosidetta variabilit pre-analitica (che comprende la
modalit di prelievo, il trasporto, laccettazione, trattamenti preliminari e la conservazione).
Al fine di ridurre errori in fase pre-analitica importante che siano seguiti alcuni accorgimenti in
fase di raccolta del campione, sia da parte delloperatore che da parte del paziente che si sottopone
al prelievo.
In primo luogo, la sede in cui si intende eseguire il prelievo (un vaso sanguigno facilmente
accessibile) deve essere detersa e dinfettata con alcool al 70%, quindi fin quando la cute non lesa
ci si trova in condizioni di sterilit, per questo bisogna utilizzare strumenti sterili (ad es. provette ed
aghi monouso) e chimicamente inerti (ad es. provette di vetro). Le provette sono chiuse con tappi di
vario colore a seconda dei gruppi di esami da effettuare.
In secondo luogo, noto che il prelievo va effettuato sul paziente riposato e a digiuno da almeno 6-
8 ore, ma le condizioni che possono influenzare i risultati analitici sono molte, come ad esempio
lalimentazione, la postura, lattivit fisica e i ritmi cronobiologici, oltre che lazione farmacologica
e metabolica di alcuni medicamenti.
importante quindi, che il paziente sia ben informato dal madico su alcune importanti prescrizioni
da seguire prima di sottoporsi al prelievo (preparazione del paziente).
Digiuno
Gli effetti del digiuno sui risultati delle analisi di biochimica clinica sono molto importanti.
Infatti, bisogna ricordare che in fase post-prandiale i livelli di molti analiti nel siero aumentano, e
possono quindi condurre ad errori diagnostici. Ad esempio, nelle 2-3 ore successive al pasto, la
glicemia aumenta (infatti possibile valutare la tolleranza al glucosio in fase post-prandiale),
mentre la potassiemia e la fosforemia diminuiscono (a causa dei processi metabolici di utilizzazione
del glucosio).
Analogamente, dopo un pasto i livelli di trigliceridi ematici aumentano, e rientrano nei valori di
base 4-5 ore dopo il pasto.
A parte la variazione sui livelli ematici di molti parametri influenzati dal pasto, il digiuno
necessario per non alterare la lipemia, in quanto i sieri lipemici (cio che contengono elevati livelli
di trigliceridi) possono interferire con alcune metodiche analitiche, ad esempio con i metodi
colorimetricio-spettrofotometrici diretti che non prevedono una preliminare precipitazione delle
proteine.
Comunque, tranne in casi particolari, non necessario che il digiuno superi le 8 ore.
Nello stesso tempo, infatti, il digiuno non deve essere troppo protratto, poich anche il digiuno
troppo protratto causa alterazioni dei parametri di laboratorio, come ad esempio un aumento dei
livelli ematici di bilirubina, oppure un aumento degli acidi grassi circolanti (mobilizzati dalle
riserve del tessuto adiposo).
Ovviamente vi sono casi in cui il digiuno di 8 ore non pu essere osservato, ad esempio bambini
piccoli, oppure pazienti ricoverati in pronto soccorso cui necessario effettuare esami durgenza. In
questi casi bene ricordare quali sono i parametri di laboratorio influenzati dal pasto.
Alimentazione
Oltre al digiuno di 8 ore, anche lalimentazione dei giorni precedenti il prelievo importante.
Le principali prescrizioni dietetiche da seguire riguardano lapporto glucidico, per i pazienti che
devono essere sottoposti alla prova di tolleranza al carico glucidico. Questa indagine deve essere
necessariamente programmata, in quanto nei giorni che precedono la prova il paziente deve
assumere quantit equilibrate di glucidi.
Anche lapporto lipidico deve essere controllato, in quanto la concentrazione di trigliceridi
inflenzata da variazioni dietetiche dei giorni che precedono il prelievo.
Viceversa, lapporto proteico non molto rilevante, in quanto in soggetti sani lazotemia non
aumenta in relazione al carico proteico dei giorni immediatamente precedenti il prelievo.
Infine, per la determinazione del metabolismo basale (che pur essendo caduta un po in disuso come
valutazione di laboratorio viene ancora richiesta in alcuni centri), il paziente deve sottoporsi ad un
regime di restrizione proteica per almeno tre giorni.
Inoltre, alcuni alimenti interferiscono con la determinazione di specifici analiti, ad esempio:
I tiocianati (es., la senape) o composti simili al tiouracile interferiscono con il
metabolismo degli ormoni tiroidei, riducendone la concentrazione ematica;
Notevoli quantit di serotonina, ad esempio quelle contenute nelle banane e nellananas
fresco, aumentano il tasso di acido 5-idrossiindolacetico escreto con le urine in maniera
cos rilevante da far sospettare un tumore carcinoide;
La determinazione urinaria di aldosterone pu essere influenzata da una dieta ricca di
agrumi, caff, carote e spinaci.
Postura ed attivit fisica
Postura
Riposo a letto e postura influenzano la concentrazione di numerose sostanze nei liquidi biologici:
questo determinante per la valutazione dei dati di laboratorio dei pazienti ambulatoriali e degenti.
Ad esempio, in ortostatismo la concentrazione ematica di quasi tutti i parametri biochimico-clinici
pi elevata a causa della modificazione nella distribuzione dei liquidi biologici; infatti, il volume
plasmatico diminuisce del 10%, mentre il liquido interstiziale aumenta. Questo il motivo per cui
nei pazienti ambulatoriali risultano PIU`ELEVATI i valori di emoglobina, proteine totali e sostanze
legate a proteine (es., calcio, colesterolo, bilirubina).
In gravidanza, a causa delle variazioni nel flusso plasmatico renale, si riscontra aumento
dellescrezione urinaria degli estrogeni in clinostatismo e della noradrenalina in ortostatismo.
Postura ed attivit fisica (segue)
Attivit fisica
Il prelievo deve essere eseguito al mattino, in condizioni di riposo in quanto lattivit fisica intensa
pu influenzare alcuni analiti, come gli enzimi localizzati prevalentemente nella muscolatura
scheletrica: creatin chinasi (CK), aspartato aminotransferasi (AST), aldolasi, lattatodeidrogenasi
(LD). Anche altri parametri biochimico-clinici aumentano nel siero con lesercizio fisico, ad
esempio l ammoniaca, lacido lattico e lacido piruvico; inoltre, dopo esercizio fisico prolungato
sono stati riscontrati elevati valori di catecolamine urinarie.
Daltro canto, limmobilizzazione completa protratta a lungo, determina un processo di
demineralizzazione del tessuto scheletrico con aumento dellescrezione urinaria del calcio, del
fosforo e della idrossiprolina.
In conclusione possiamo dire che, in occasione del prelievo, opportuno giungere riposati, senza
aver compiuto intensa attivit fisica nelle ore (meglio nelle due-tre settimane) precedenti il prelievo.
Anche in questo caso, importante segnalare al laboratorio di aver svolto una attivit fisica intensa
se non possibile rimandare il prelievo.
Ritmi cronobiologici
Molti parametri di laboratorio sono influenzati direttamente o indirettamente dai ritmi
cronobiologici. Ad esempio, la VES, i livelli di ACTH, del cortisolo, delle gonadotropine, della
sideremia, della cloruremia, della calcemia, della 5-idrossitriptamina, lescrezione urinaria di
catecolamine, sodio, potassio e fosfati presentano variazioni cronobiologiche.
Queste variazioni di concentrazione ritmica possono presentarsi per periodi inferiori alle 24 h (ritmo
ultradiano) o per periodi pi lunghi, oltre le 24h (ritmo infradiano). Fra i ritmi infradiani si possono
ricordare quelli di circa 7 giorni, quelli d un mese e quelli un anno.
Il ritmo pi comune quello circadiano, che ha come sincronizzatore pi comune lalternanza luce-
oscurit, sonno-veglia, assunzione di cibo, oscillazioni nei livelli di alcuni ormoni trofici come
lACTH.
Ad esempio, sono state riscontrate variazioni della sideremia fino al 50% nelle 24 ore. In
particolare, il picco al mattino fra le 8,00 e le 10,00 e valori pi bassi nel tardo pomeriggio.
Inoltre, stato riscontrato che nei soggetti che lavorano durante la notte i valori pi elevati sono
spostati nelle ore pomeridiane, in fase col ciclo sonno-attivit, per cui il ritmo appare invertito.
Ritmi cronobiologici (segue)
Allo stesso modo, i livelli di ACTH variano nelle diverse ore del giorno, e di conseguenza anche i
livelli degli ormoni corticosteroidei (che sono controllati dallACTH) variano nel corso della
giornata. Anzi, in alcuni casi proprio per valutare il funzionamento di questo ritmo, viene richiesto
il dosaggio del cortisono e dellACTH in diverse ore del giorno.
Invece, un tipico esempio di ritmo circamensile quello mestrruale nelle donne; anche questo ritmo
pu influenzare alcuni parametri di laboratorio. Ad esempio, a seguito delle mestruazioni, per
qualche giorno i livelli di emoglobina possono essere pi bassi, oppure effettuando lesame delle
urine possibile trovare una maggior quantit di emoglobina ed eritrociti nelle urine. Anche in
questo caso, quindi, buona regola informare il laboratorio se gli esami vengono effettuati nel
periodo mestruale o nei giorni immediatamente successivi.
Assunzione di medicamenti
importante che nelle ore precedenti il prelievo siano interrotti gli eventuali trattamenti
farmacologici a cui il paziente stato sottoposto, in quanto alcuni farmaci o loro metaboliti possono
interferire sui risultati delle analisi di laboratorio. In alternativa, lassunzione di farmaci deve
assolutamente essere comunicata al laboratorio.
L interferenza sulla reazione analitica pu essere di natura fisica o chimica ed dovuta allazione
farmacologica, immunologica o tossicologica dei medicamenti.
Linterferenza chimica la causa pi diffusa ed anche pi critica. Sono stati riscontrati meccanismi
di interazione del farmaco con lanalita (ad esempio, leparina compete con lalbumina con il verde
di bromocresolo, colorante impiegato per la misura dellalbumina), di interazione con i reagenti (ad
esempio, L-dopa, metildopa, isoniazide, 6-mercaptopurina, acido ascorbico interferiscono sul
dosaggio dellacido urico, mentre lacido ascorbico interferisce sulla determinazione del glucosio),
e di interazione con la tecnica di misura (ad esempio, lo spironolattone interferisce nel dosaggio
fluorimetrico del cortisolo).
Assunzione di medicamenti (segue)
Esempi di interferenza fisica sono:
1. la vit. A e la riboflavina che, contenendo pigmenti gialli che vengono assorbiti nel tratto
intestinale, possono alterare la misura della bilirubina eseguita con metodo diretto;
2. i preparati di eparina che contengono sodio bisulfito riducono il picco di assorbimento del
verde di indocianina usato per la prova di cromosecrezione o di diluizione arteriosa.
Naturalmente, non devono essere sospesi i farmaci che sono stati prescritti dal medico per ottenere
un effetto metabolico specifico (ad esempio la somministrazione di insulina o dellallopurinolo), in
quanto la modificazione indotta sul dato di laboratorio attesa dal medico curante e come tale
giustamente interpretata.
Tipi di campione: sangue intero, plasma o siero
Per le indagini biochimico cliniche si pu utilizzare siero o plasma; il plasma si ottiene per
centrifugazione da un campione disangue intero a cui stato aggiunto un anticoagulante (per
esempio, citrato, eparina) immediatamente dopo il prelievo. Il plasma pu essere congelato per
successive analisi.
Il siero ha una composizione simile a quella del plasma, ma non contiene alcuni fattori della
coagulazione, poich si ottiene lasciando coagulare il campione di sangue prima della
centrifugazione. Per i test della coagulazione tutti i fattori coinvolti nella coagulazione devono
essere preservati, quindi il siero non pu essere utilizzato.
Bisogna sottolineare che rispetto al siero, il plasma ha minor rischio di emolisi.
Tipi di campione: sangue intero, plasma o siero (segue)
Limpiego del sangue intero al posto del siero (o plasma) per le determinazioni biochimiche
giustificato solo quando la concentrazione endoeritrocitaria della sostanza analoga a quella
presente nel plasma (assenza di fenomeni di membrana); tuttavia, anche in queste circostanze nelle
determinazioni su plasma si ottengono risultati di circa il 10-12% pi elevati rispetto a quelli su
sangue intero, a causa del diverso contenuto di acqua nel sangue intero (circa 80%) rispetto al
plasma (circa 93%).
A) Se si raccoglie il sangue in una provetta che non contiene anticoagulanti, e si permette la
formazione del coagulo, si pu ottenere, dopo centrifugazione, un campione di siero.
B) Se il sangue raccolto in una provetta contenente un anticoagulante, ed es. eparina, dopo
centrifugazione il supernatante costituito da plasma.

Anticoagulanti
Limpiego di anticoagulanti indispensabile per la misura dei fattori della coagulazione nel plasma
e per tutte le analisi su sangue intero, come lesame emocromocitometrico e la velocit di
eritrosedimentazione (VES). I pi diffusi anticoagulanti sono: eparina, EDTA, citrato di sodio ed
ossalato. Ciascuno di essi ha delle indicazioni ma anche delle controindicazioni.
Eparina: mucopolisaccaride acido, in commercio come sale di litio, di sodio o di potassio. E
considerato lanticoagulante naturale, in quanto presente a bassi livelli nel sangue e nei tessuti.
Agisce inibendo la trombina, in associazione con lantitrombina III, e altri fattori della
coagulazione.
Altera la morfologia e la colorazione dei leucociti.
Provoca aggregazione delle piastrine.
EDTA (acido etilendiaminotetracetico): Esplica la sua azione anticoagulante sequestrando lo ione
calcio, formando con esso dei sali insolubili. Rappresenta lanticoagulante di scelta per lesame
emocitometrico. E, infatti, il migliore per studiare la morfologia delle cellule del sangue.
Non altera il volume degli eritrociti.
Non provoca emolisi.
Riduce al minimo la lisi dei leucociti.
Limita laggregazione piastrinica.
E rapidamente solubile nel sangue.
Anticoagulanti (segue)
Un eccesso di EDTA provoca il raggrinzimento degli eritrociti.
Citrato di sodio: impiegato per la misura della VES, per lo studio dei fattori della coagulazione e
della funzionalit piastrinica. Esplica la sua azione anticoagulante come lEDTA.
Ossalato: sale di sodio, potassio o ammonio. lanticoagulante chelante del calcio usato pi
raramente. Pu essere usato per le analisi emocoagulative in alternativa al citrato.
Nella prossima diapositiva mostrato uno schema delle provette pi usate in biochimica clinica.
Identificazione delle provette

LEZIONE 2
Raccolta delle urine
ll campione di urina pu essere raccolto secondo distinte modalit, in relazione al tipo di indagine da eseguire, allet ed allo stato del
paziente.
Possono essere distinte 3 diffrenti modalit di raccolta dellurina:
1. Raccolta del primo mattino, il campione idoneo per lesame standard (fisico, chimico e microscopico) delle urine:
lurina pi concentrata, quindi sono pi evidenti eventuali alterazioni).
2. Seconda minzione o mitto intermedio, si utilizza per le analisi di chimica clinica ma soprattutto per le indagini
colturali); si utilizza un recipiente monouso di capacit variabile (a seconda dei test da eseguire) e sterile per le
indagini culturali.
3. Raccolta temporizzata o delle 24 ore, la modalit di campionamento ideale per gli studi di clearance, oppure se
devono essere dosate sostanze escrete con ritmi variabili durante il giorno o quando necessario aumentare
laccuratezza di misura per sostanze presenti in concentrazione ridotta. Per evitare errori di campionamento, bisogna
scartare le urine della prima minzione del mattino e raccogliere in un unico recipiente tutte le urine emesse durante le
24 ore successive. Alcune determinazioni possono essere anche effettuate su campioni raccolti per periodi pi brevi.
In ogni caso, terminata la roccolta il campione di urine deve inviato rapidamente al laboratorio, altrimenti necessario conservarlo in
frigorifero. Va sottolineato, infine, che per alcune determinazioni analitiche (in particolare alcuni ormoni) necessario mantenere le
urine ad un valore di pH acido o alcalino, per cui pu essere necessario aggiungere al raccoglitore alcune sostanze prima di iniziare la
raccolta.
Liquido cefalorachidiano
Il liquor riempe tutti gli spazi liberi dallencefalo e dal midollo spinale allinterno della dura madre.
Quantit: nelladulto pu raggiungere al massimo i 160 mL, nel neonato i 40/60mL.
Pressione liquorale: varibile da soggetto a soggetto ed modificata in modo determinante dalla postura.
Aspetto: incolore, limpido e senza tracce di sangue (cosiddetto aspetto di acqua di roccia).
Modalit e sede di prelievo: mediante puntura lombare nello spazio intervertebrale compreso fra la quarta e la quinta vertebra
lombare. Il prelievo pu essere effettuato con il paziente in posizione seduta con il busto flesso in avanti o in decubito laterale con la
testa flessa sul torace e gli arti inferiori flessi sulladdome. Bisogna ricordare che la scelta della posizione del paziente influenza i
valori della pressione liquorale, che risulta pi alta nella posizione seduta.
Campione: max 12-15 mL nelladulto, da suddividere in pi provette, di cui una sterile per gli esami colturali
Precauzioni: per qualsiasi tipo di indagine bisogna consegnare sollecitamente il campione al laboratorio, entro unora dal prelievo;
se necessario, le provette devono essere conservate a 37C, ma solo per un breve periodo di tempo.
Liquido sinoviale
Il liquido sinoviale un ultrafiltrato del sangue attraverso la membrana sinoviale delle grosse articolazioni. privo di proteine ad alto
peso molecolare, ma contiene ialuroproteine. Ha funzione lubrificante e nutritiva nei confronti delle cartilagini che rivestono i capi
articolari delle ossa.
Indicazioni: indagini di laboratorio mirate ad approfondire e trattare le alterazioni delle articolazioni.
Quantit: in condizioni normali la puntura delle cavit intraarticolari d luogo a punctio sicca a causa della quantit molto ridotta
di liquido sinoviale e della sua elevata viscosit, infatti i valori di riferimento nelladulto sono di 3/3,5 ml; in condizioni potologiche
(infiammazioni articolari, versamenti ematici) si presenta una tumefazione articolare sostenuta dallaumento della quantit di fluido
intraarticolare, circa 25 ml.
Pressione liquorale: varibil da soggetto a soggetto ed modificata in modo determinante dalla postura.
Aspetto: limpido e senza tracce di sangue.
Liquido sinoviale (segue)
Modalit di prelievo: artrocentesi, aspirazione in siringa sterile.
Provette: differenti a seconda del tipo di indagini da eseguire, in particolare:
con eparina: per indagini di microbiologia;
senza anticoagulante: per indagini di chimica clinica ed immunologia;
con EDTA: per indagini cito-ematologiche.
Precauzioni: necessario impedire la naturale tendenza del fluido sinoviale a coagulare, dato lalto contenuto in mucopolisaccaridi
acidi (acido ialuronico e proteine).
Liquidi di versamento delle cavit sierose
Le cavit sierose (pleurica, pericardica e peritoneale) contengono un fluido simile al siero per colore e caratteristiche chimico-fisiche,
che si forma continuamente per ultrafiltrazione del plasma e viene riassorbito attraverso i capillari delle sierose, in modo che la
quantit e la composizione restano costanti.
Versamento endocavitario: aumento della quantit del fluido intracavitario a seguito di condizioni patologiche, quali:
lesioni infiammatorie, neoplastiche o traumatiche degli organi endocavitari;
patologia infiammatoria o neoplastica delle sierose stesse.
Prelievo a scopo terapeutico: per evitare la compressione degli organi endocavitarisi effettua lo svuotamento per aspirazione
mediante puntura cutanea.
Prelievo a scopo diagnostico: 50 mL divisi in provette diverse:
con EDTA per analisi citologiche;
con eparina in contenitori sterili per esami microbiologici e colturali;
in vetro per esami di chimica clinica.
Liquido amniotico
Lamnios un annesso embrionale che circonda e protegge lembrione. Si forma principalmente per secrezione attiva da parte della
membrana amniotica, delle vie respiratorie ed urinarie del feto, oltre che ad altri organi fetali. Poich lamnios continuamente
ricambiato, il suo riassorbimento avviene per mezzo dell apparato respiratorio del feto, per deglutizione o per intermediazione della
membrana amniotica stessa.
Aspetto: lievemente opalescente e di colore citrino molto tenue.
Lanalisi del liquido amniotico consente di evidenziare:
1. alterazioni cromosomiche (dopo la coltura degli amniociti),
2. alterazioni genetiche (dopo la coltura degli amniociti ed estrazione del DNA),
3. difetti strutturali (es., spina bifida, anencefalia);
4. Anomalie metaboliche ereditarie;
5. Stato di maturit polmonare (tramite il rapporto lectina/sfingomielina);
6. Paternit e sesso del nascituro.
Liquido amniotico (segue)
LAmniocentesi
il prelievo transaddominale di 20-30 ml di liquido amniotico (con AGO 20-22G). Si esegue a partire dalla 14a settimana di
gravidanza: se eseguita prima della XIV settimana aumenta il rischio di deformit fetali, di fallimento della procedura e di aborto
(amnios e corion non sono ancora fusi). Comporta un rischio di aborto dell1%, dipendente dalla manualit delloperatore.
Precauzioni: per le analisi citogenetiche o biochimiche necessario usare provette sterili di materiale plastico per evitare che le
cellule aderiscano alle pareti e non siano pi recuperabili.
Feci
Indagini:
Ricerca del sangue occulto;
Ricerca di parassiti e/o loro uova;
Presenza di enzimi e/o sostanze parzialmente digerite;
La ricerca del sangue occulto
E il test pi eseguito, in quanto ritenuto essere un indicatore precoce della presenza di polipi o tumore del colon.
Caratteristiche: test qualitativo, colorimetrico.
Modalit di raccolta del campione: il paziente raccoglie con una spatolina una piccola porzione di fesi e le depone su un
cartoncino.
Precauzioni:
A) Falsi positivi: ogni sorgente di sangue dar un risultato positivo, quindi il sangue proveniente da emorroidi sanguinanti, ragadi
anali e il sangue mestruale interferir con il test. Inoltre, nei giorni che precedono il test importante seguire alcuni accorgimenti
riguardanti lalimentazione (dieta ad alto contunuto di fibre, evitare carni rossi, rape, radicchi e rafano) e lassunzione di alcuni
farmaci (acido acetilsalicilico ed antiinfiammatori non steroidei potrebbero provocare piccole erosioni gastriche).
B) Falsi negativi: causati dallincostante sanguinamento dei polipi, quindi il paziente avr cura di ripetere la raccolta del campione
per tre giorni consecutivi. Inoltre, nei giorni che precedono il test non bisogna assumere Vitamina C, in quanto essa pu interferire
con la reazione del test, convertendo un risultato positivo in falsamente negativo.
Errori di campionamento
Gli errori effettuati nella fase di raccolta del campione biologico in molti casi possono invalidare i risultati dellintero processo
analitico!
Gli errori che vengono commessi pi comunemente sono in relazione alla tecnica del prelievo stesso, ad esempio:
Emolisi del campione di sangue in seguito a venopuntura.
Emoconcentrazione, causata da stasi prolungata, se il laccio emostatico non rimosso subito dopo la venopuntura.
Erronea scelta del contenitore per il campione biologico (esempio, provetta con lanticoagulante non idoneo allanalisi
richiesta).
Sito inappropriato di prelievo (es., prelievo arterioso e non venoso).
Conservazione sbagliata del campione (es., ritardo nellinvio del campione al laboratorio).
Campione insufficiente (es., errore di raccolta delle urine per lesame delle urine delle 24 h; non corretto bilanciamento
della quantit di sangue prelevata con lanticoagulante gi presente nella provetta).
Errori nel campionamento a tempo.
Trasporto del campione biologico al laboratorio
E molto importante che i tempi non siano eccessivi perch influenzano la stabilit del materiale e quindi laccuratezza della
misura.
In generale, dal momento in cui si effettua il prelievo importante eseguire:
immediatamente i test su fattori della coagulazione;
la centrifugazione entro 1 h;
lesame emocromocitometrico entro 7 h;
La VES non oltre 24 h dal prelievo.
Non tutti gli analiti presentano la stessa STABILITA in un campione di SANGUE INTERO conservato A TEMPERATURA
AMBIENTE.
Ad esempio:
ORMONI 1 settimana
Na+, ACIDO URICO, COLESTEROLO, TRIGLICERIDI 3gg
AMILASI, TRANSAMINASI 2-3 gg
GLUCOSIO, LIPASI meno di 4h
AMMONIO rapido aumento
GLUCOSIO diminuisce a tutte le temperature, perch viene metabolizzato
K
+
aumenta a causa della lisi eritrocitaria e piastrinica
Trasporto del campione biologico a distanza
Vi sono dei casi in cui necessario inviare un campione biologico in laboratori distanti (es. laboratori di riferimento per lanalisi
molecolare di malattie rare, etc.). In questi casi necessario rispettare alcune norme.
I contenitori impiegati per la spedizione devono essere di dimensioni idonee, infrangibili e muniti di tappi a tenuta sicura.
Durante il trasporto vanno evitate eccessive vibrazioni per i loro effetti dannosi sui fattori della coagulazione e sugli elementi figurati
del sangue.
Se il campione esige una conservazione a bassa temperatura indispensabile laggiunta di ghiaccio sintetico o secco o azoto liquido
nella spedizione, in modo da mantenere il campione alla temperatura prevista per il tempo necessario al trasporto.
Ogni campione deve giungere al laboratorio gi accuratamente etichettato:
indicati dati identificativi del soggetto;
inchiostro indelebile su etichetta ben adesa al tubo.
indicati data e ora del prelievo.
Il laboratorio pu rifiutare i campioni:
non etichettati o etichettati in modo improprio;
danneggiati durante il trasporto;
non raccolti e conservati correttamente;
contaminati esternamente.
Conservazione del materiale biologico
Quando il laboratorio non in grado di eseguire immediatamente tutti gli esami richiesti, il campione biologico deve essere
conservato nel modo migliore in modo che non intervengano variazioni nella sua composizione o nelle sue propriet.
La natura delle variazioni che possono alterare la composizione di un campione biologico riconducibile a:
1. Cause di tipo fisico: avvengono in tempi lunghi e riguardano fondamentalmente dei cambiamenti fra fasi differenti
(liquido-solido, liquido-vapore, ecc.), ad esempio, levaporazione.
2. Cause di tipo chimico-fisico: avvengono in tempi brevi o medi e sono processi chimico-fisici in grado di indurre
modificazioni o nella composizione o nella struttura di alcuni costituenti biochimici, ad esempio, leffetto
fotochimico, denaturazione e aggregazione.
3. Cause di tipo biochimico o biometabolico: avvengono in tempi brevi o brevissimi. Al momento del prelievo vengono
a mancare i sistemi biologici di regolazione generale e cambiano drasticamente le condizioni ambientali, pertanto le
sostanze che in vivo si trovano in uno stato metabolico dinamico possono subire ampie modificazioni nella
concentrazione; analogamente il venir meno dei sistemi energetici limita la possibilit di mantenimento dei gradienti
e/o delle compartimentazioni. Le modificazioni nel tempo dopo il prelievo di alcune sostanze possono essere di entit
drammatica sia in aumento (H+, acido lattico, NH4+), sia in diminuzione (glucosio).
Prescrizioni per la conservazione dei campioni
RAPIDA SIERATURA E TEMPESTIVA SEPARAZIONE DEL SIERO O DEL PLASMA DALLA PARTE CORPUSCOLATA:
Ci consente la riduzione delle interferenze metaboliche quali il consumo di glucosio da parte degli enzimi glicolitici cellulari, la
produzione di acido lattico, la produzione di ioni ammonio da enzimi cellulari, ecc.
REFRIGERAZIONE DEI CAMPIONI A 4 C: E raccomandata ogni qualvolta lesecuzione delle analisi prevista oltre le 4 ore
dopo il prelievo poich rallenta i processi metabolici e, quindi, le variazioni di pH.
Per alcuni analiti necessario un raffreddamento pi spinto (-20 C).
CONSERVAZIONE AL BUIO: Alcune sostanze biologiche (ad es. bilirubina, riboflavina, b-carotene, ecc.) sono degradabili da parte
delle radiazioni solari.
RIDUZIONE DEL CONTATTO DEL MATERIALE BIOLOGICO CON LAMBIENTE ESTERNO MEDIANTE LUSO DI
PROVETTE CON TAPPO A TENUTA: evita lalcalinizzazione dei campioni causata dallevaporazione della CO2; minimizza
levaporazione dei campioni; riduce il rischio infettivo per il personale

LEZIONE 3
Variabilit analitica
Se uno stesso campione biologico viene analizzato ripetutamente (nello stesso laboratorio o in laboratori differenti) anche utilizzando
lo stesso metodo di analisi e gli stessi strumenti, non si ottengono gli stessi valori.
La variabilit analitica uno dei fattori responsabili delle differenze che si osservano tra i valori analitici ripetuti e dipende dal
metodo analitico utilizzato. Qualunque metodo di misura, basato su qualunque principio, mostra una variabilit. La variabilit
analitica legata a due componenti: lACCURATEZZA (o INACCURATEZZA) e la PRECISIONE del metodo di misura .
ACCURATEZZA: E il grado di concordanza tra la stima ed il valore vero della grandezza. Il termine accuratezza si riferisce alla
affidabilit di una metodica, quindi riflette labilit di un metodo a riprodurre i valori dei campioni di riferimento a concentrazione
nota.
INACCURATEZZA: rappresenta lo scostamento tra la stima ed il valore vero. Linaccuratezza la discordanza tra la media dei
valori ottenuti misurando un campione a concentrazione nota per un analita ed il valore vero dello stesso, ottenuto mediante metodi
Gold standard. E dovuta allerrore sistematico (errore ripetuto). Per effetto dellerrore sistematico tutti i valori sono
uniformemente pi alti o pi bassi del valore vero.

Dalla variabilit totale alla variabilit analitica.

Precisione e imprecisione
La precisione il grado di concordanza tra misure replicate effettuate sul medesimo campione.
SE IL METODO E PRECISO, la variazione dei valori segue una distribuzione gaussiana:
Il 68% delle osservazioni cade tra la MEDIA e 1DS
Il 95 % delle osservazioni cade tra la MEDIA e 2DS
Limprecisione dovuta allerrore casuale (inevitabile, involontario, di piccola entit).
Per effetto dellerrore casuale, i valori analitici replicati risultano occasionalmente superiori o inferiori al valore vero. La precisione si
misura in termini di deviazione standard o di coefficiente di variazione.
Deviazione standard (DS) o di coefficiente di variazione:
La DS viene generalmente espressa in CV%
E la variazione rispetto alla media, ossia di quanto si discostano dalla media i valori riscontrati nelle ripetute misurazioni dello stesso
campione.
CV%= DS/media X 100

Esempio di una distribuzione gaussiana dei valori.

Precisione ed accuratezza
PRECISIONE ED ACCURATEZZA SONO TRA LORO INDIPENDENTI.
Infatti, come mostrato nella figura:
Un risultato inaccurato pu essere molto preciso, cio andando a ripetere pi volte una determinazione sullo stesso
campione con lo stesso metodo, otteniamo risultati sempre vicini tra loro, ma tutti lontani dal valore atteso.
Un risultato impreciso pu essere molto accurato, cio otteniamo sempre risultati vicini a quello atteso, ma
abbastanza diversi tra loro.
Per la maggior parte dei parametri di laboratorio il CV inferiore all1%.
Ovviamente laccuratezza e la precisione di un metodo variano al variare della concentrazione dellanalita. Se la concentrazione
troppo bassa oppure troppo alta, il metodo di misura avr maggiori difficolt a fornire risultati accurati e precisi.
Il controllo dellimprecisione e dellinaccuratezza del metodo deve quindi essere eseguito a diversi livelli di concentrazione.

1) Impreciso e inaccurato 2) Preciso ma inaccurato 3) Impreciso ma accurato 4) Preciso e accurato

Controllo di qualit
Allo scopo di tenere sotto controllo lefficienza dei metodi di misura, ed in particolare la precisione e laccuratezza, si utilizzano i
sistemi di controllo di qualit. Nei sistemi esterni o extralaboratorio, il laboratorio riceve, periodicamente, campioni di controllo
a concetrazione ignota e li analizza insieme ai campioni da paziente.
Nei sistemi di controllo interni o intralaboratorio si utilizzano invece campioni di controllo a concentrazione nota, che vengono
analizzati insieme ai campioni da paziente. In genere, il controllo interno effettuato per ogni serie analitica, ed buona norma usare
campioni che hanno concentrazioni diverse, in tutto il range di valori che si possono ottenere da un paziente.
I risultati ottenuti dai campioni di controllo interno, vengono periodicamente inseriti in una carta di controllo, tipo quella riportata
nelle figure. La figura in alto indica un metodo controllato; come si vede i valori ottenuti nei vari giorni oscillano intorno alla
media (a causa della variabilit analitica), ma loscillazione limitata (entro 1 DS), ed avviene in modo random al di sopra e al di
sotto della media.

Esempio di metodo controllato.

Controllo di qualit (segue)
Invece, nella figura sono mostrati alcuni esempi di metodo fuori controllo.
Nel pannello A mostrato un caso in cui i risultati del controllo nei diversi giorni forniscono risultati sempre pi alti; nel pannello C
riportato un esempio della situazione opposta. Ci indica che insorto un errore sistematico che determina un risultato anomalo.
Per esempio, una pipetta che gradualmente si sta starando, e quindi fornisce risultati sempre pi alti o sempre pi bassi perch la
quantit di campione o di reagente inserito nella provetta di reazione sempre maggiore o sempre minore.
Il pannello B mostra un esempio di risultati precisi (sempre vicini tra loro) ma poco accurati, perch si collocano sempre dallo stesso
lato della media. Ci potrebbe dipendere da un errore sistematico in cui, per esempio, lo strumento di misura tarato male.
Il pannello D, infine, mostra che in una delle determinazioni il risultato fuori 1 DS; probabilmente in quella seduta analitica
insorto una anomalia non sistematica ma limitata a quella seduta.
Come si vede, quindi, lesecuzione del controllo di qualit pu orientare molto bene il personale del laboratorio alla manutenzione
delle strumentazioni e a mantenere lefficienza delle procedure analitiche.

Esempi di metodo fuori controllo.

Caratteristiche dei metodi analitici
I METODI ANALITICI i distinguono in base al loro grado di accuratezza in:
METODO DEFINITIVO: Risultato definitivo. Migliore approssimazione al valore vero.
o Es: Spettrometria di massa
METODO DI RIFERIMENTO: Metodo con inaccuratezza trascurabile.
o Es: Spettroscopia di assorbimento
METODO AD ERRORE NOTO: In cui lentit dellerrore stabilita (mediante comparazione con un metodo di
riferimento).
I metodi di riferimento e quelli definitivi sono indaginosi, costosi e difficilmente applicabili alla routine; essi vengono utilizzati per
fissare i valori di un determinato numero di campioni che vengono utilizzati come standard oppure come campioni da usare nei
programmi di controllo di qualit.
La maggior parte dei metodi usati in laboratorio sono quindi i metodi ad errore noto, che consentono di ottenere risultati ben
utilizzabili nella gestione clinica dei pazienti, purch si adottino le strategie corrette di controllo di qualit.
Altre caratteristiche dei metodi analitici
Altri parametri importanti del metodo di misura sono la sensibilit analitica e la linearit.
Sensibilit analitica o limite della capacit analitica: minima concentrazione di analita che il metodo permette di distinguere dal
bianco.
Il metodo deve essere molto sensibile quando:
Si misurano analiti presenti in piccolissime concentrazioni (nanomoli, picomoli), e ci riguarda soprattutto analisi di
ormoni o farmaci;
Piccole variazioni delle concentrazioni di analita sono significative da un punto di vista clinico, ad esempio
determinazioni degli elettroliti, oppure determinazioni collegate allequilibrio acido-base.
La linearit lambito di concentrazioni o di attivit in cui il valore finale prodotto da un sistema proporzionale alla quantit da
misurare, entro una certa tollerabilit. La linearit importante quando si misurano analiti i cui valori possono (in alcune condizioni
patologiche) oscillare in un range molto ampio, e raggiungere concentrazioni molto elevate rispetto ai valori di riferimento. Per
esempio gli enzimi sierici come le transaminasi possono raggiungere valori anche 100 volte pi elevati rispetto ai valori di
riferimento. Quindi, necessario che il metodo analitico sia in grado di misurare in modo accurato e preciso anche grandi
concentrazioni della sostanza. Quando i valori ottenuti sono superiori al limite di linearit del metodo, occorre diluire il campione e
poi ripetere la misura, riportando il valore allinterno del range di linearit del metodo.
Specificit analitica
La specificit analitica la capacit di un metodo di determinare solamente il costituente che si intende misurare senza risentire di
interferenze.
INTERFERENZA: situazione in cui componenti differenti, pur non generando di per s un segnale, amplificano o deprimono il
segnale generato nel metodo dal componente oggetto della misura.
ASPECIFICITA ed INTERFERENZA costituiscono gli effetti da matrice.
La MATRICE costituita da tutto quanto, nel campione, circonda il componente o la grandezza oggetto della misura (ad es. glucosio
sierico: matrice acqua, proteine, componenti organici, ecc.).
Diversi farmaci, ed alcuni alimenti possono causare interferenze nelle misurazioni analitiche in biochimica clinica, e per ogni metodo
di laboratorio sono note le sostanze (anche farmacologiche) che provocano interferenza. Proprio per questo motivo importante che
il laboratorio sia informato delleventuale assunzione di farmaci da parte del paziente (vedasi lezione sul prelievo di campione
biologico).
LEZIONE 4
Variabilit biologica
Oltre alla variabilit analitica discussa nella precedente lezione, i risultati analitici possono variare in base alla variabilit biologica.
In altri termini, una serie di fattori legati allindividuo possono essere responsabili del fatto che, i valori di un parametro analitico
possano variare nello stesso individuo (anche se non sono intervenute patologie), oppure siano differenti da soggetto a soggetto.
Variabilit biologica controllabile:
Influenze fisiologiche a lungo termine (et, sesso, fattori ambientali e climatici, obesit, stato nutrizionale, stile di
vita, gravidanza);
Influenze fisiologiche a breve termine (postura, veglia, sonno, esercizio fisico, variazioni cicliche);
Assunzione di farmaci, droghe;
Risposte fisiopatologiche dellorganismo (febbre, stress, ansia, dolore);
Influenze genetiche.

Dalla variabilit totale alla variabilit biologica.

Variabilit biologica (segue)
Variabilit biologica non controllabile:
Variabilit intra-individuale: i valori misurabili in un determinato momento in un individuo sono il risultato di un
equilibrio dinamico che tende a mantenerli costantemente aggiustati ad un valore detto punto omeostatico;
Variabilit inter-individuale: il punto omeostatico non uguale per tutti gli individui di un gruppo omogeneo.

Confronto tra variabilit biologica intra- ed inter- individuale per alcuni analiti.

Traguardo analitico
Sommando gli effetti della variabilit analitica e di quella biologica, si ottiene una variabilit totale, il cui effetto chiamato
differenza critica. La differenza critica indica di quanto un determinato valore di laboratorio pu cambiare, senza indicare il
cambiamento dello stato fisiopatologico di un individuo.
Poich la variabilit biologica non pu essere modificata, per ridurre la differenza critica necessario ridurre la variabilit analitica,
ossia cercare di ottenere metodi di laboratorio sempre pi accurati e precisi.
Lobiettivo analitico (o traguardo analitico) definito da una variabilit analitica inferiore o uguale alla met della variabilit
biologica intra-individuale per ciascun parametro di laboratorio:
CVA = 1/2 CVI
Dove CVA = Variabilit analitica e CVI = Variabilit biologica individuale.
Ad obiettivo raggiunto, limprecisione analitica incide per meno del 12% sulla variabilit totale del risultato.
La differenza critica
La differenza critica (Dcr) quindi la differenza minima tra due valori ottenuti sullo stesso paziente che pu essere considerata
significativa; permette di stabilire con una probabilit definita se la differenza fra due risultati per uno stesso paziente deve essere
considerata significativa.
I PARAMETRI DA CONOSCERE per il calcolo della differenza critica sono la variabilit analitica-CV(a) e la variabilit biologica-
CV(b).
Su base statistica si valuta che la differenza di misure successive nel tempo di uno stesso analita significativa (o critica) quando il
suo valore 2.77 x CVt.
Differenza critica % = K x CV(t)
K= 2.77 per p< 0,05 (lerrore commesso nel definirle diverse ha un livello di probabilit di 0,05);
CV(t)= CV(a
2
) + CV(b
2
);
K x CV(t);
2,77 x CV(a
2
) + CV(b
2
) p<0,05
Con il fattore 2,77 vi sono 5 probabilit su 100 che la differenza osservata sia dovuta a fluttuazioni casuali dei risultati e 95 su 100
che indichi variazioni significative.
Esempio di calcolo della differenza critica
Bisogna stabilire se la terapia eseguita stata efficace o meno sapendo che:
La variabilit analitica del colesterolo del 3%
La variabilit biologica del colesterolo del 6%
Il valore del colesterolo prima della terapia di 210 mg/dl
Il valore del colesterolo dopo la terapia di 185 mg/dl
CV(t)= CV(a
2
) + CV(b
2
)
CV(t)= CV(3
2
) + CV(6
2
)
CV(t)= CV(9) + CV(36)
CV(t)= 45
CV(t)= 6.7
Differenza critica % = 2.77 x CV(t)
Differenza critica % = 2.77 x 6.7 = 18.6%
Quindi, la differenza critica stata valutata pari al 18.6 %. La differenza osservata tra i due valori di colesterolo (210 e 185) del
12%, di conseguenza non possiamo affermare che la terapia stata EFFICACE, perch la differenza dei valori ottenuti potrebbe
dipendere soltanto dalla variabilit analitica e biologica.
Intervalli di riferimento
Quando si effettua una determinazione di laboratorio, per poter interpretare il risultato necessario seguire due passaggi:
1. Se il test gi stato effettuato nellindividuo, per verificare se nel risultato presente una variazione significativa (per
esempio dovuta alleffetto di una terapia, oppure di una dieta, o altro) si effettua il calcolo della differenza critica e si
vede se la differenza del risultato, rispetto alla precedente determinazione, superiore alla differenza critica. In tal
caso si pu affermare che esiste una reale differenza nel valore dellanalita, dipendente dalle diverse condizioni
fisiopatologiche dellindividuo.
2. Se la prima volta che si esegue il test in un individuo, occorre valutare se il risultato compreso negli intervalli di
riferimento per la popolazione sana, oppure se risulta pi elevato o pi basso.
Quindi, per ogni determinazione di laboratorio che preveda un risultato quantitativo, necessario conoscere gli intervalli di
riferimento.
Sarebbe opportuno che ogni laboratorio calcolasse gli intervalli di riferimento per ciascun analita. Tuttavia, nel nostro laboratorio pu
essere sufficiente utilizzare i valori di riferimento calcolati in altri laboratori, purch:
1. I soggetti impiegati per il calcolo dei valori di riferimento appartengano allo stesso gruppo etnico che afferisce al nostro
laboratorio (poich per alcuni parametri di laboratorio hanno diversi valori di riferimento in base al gruppo etnico: ad
esempio, i valori di riferimento per la creatinkinasi sierica, enzima rilasciato dai muscoli, saranno pi elevati in
individui africani che hanno una massa muscolare pi sviluppata).
2. I valori di riferimento siano stati calcolati con la stessa metodologia analitica impiegata nel nostro laboratorio.
La popolazione di riferimento
Una popolazione di riferimento per calcolare gli intervalli di riferimento si sceglie in base a criteri di partizione e criteri di
esclusione.
I criteri di partizione sono:
Numero di soggetti sufficientemente elevato;
In buono stato di salute (almeno per quanto riguarda i metabolismi o gli organi valutati dallanalita in questione);
Et, Sesso, Fattori ambientali;
Altri fattori biologici: variazioni cronobiologiche.
I criteri di esclusione sono:
Malattie sistemiche e disordini fisiopatologici;
Assunzione di agenti farmacologicamente attivi, quali la terapia farmacologica, assunzione di contraccettivi,
tossicodipendenza, alcolismo e tabagismo;
Modificazione dello stato fisiologico, ad esempio la gravidanza, lesercizio fisico intenso, lassunzione di cibo prima
del prelievo;
Esposizione a fattori di rischio.
Calcolo degli intervalli di riferimento
Per intervallo di riferimento si intende un intervallo che includa una FRAZIONE PREFISSATA della popolazione di riferimento.
Tra gli individui normali ci si aspetta che i valori dei singoli analiti abbiano variazioni compatibili con la normale variabilit tra un
soggetto ed un altro.
Se questa variabilit veramente casuale questi valori seguiranno una distribuzione NORMALE o GAUSSIANA.
Considereremo come intervalli di riferimento quelli compresi nellintervallo tra la media e due deviazioni standard a destra o a
sinistra della media; in questo modo avremo considerato i valori presenti nel 95% della popolazione di riferimento.

Distribuzione gaussiana.

Utilizzo degli intervalli di riferimento
Nelluso degli intervalli di riferimento occorre ricordare alcuni punti fondamentali:
1. Per molti analiti, gli intervalli di riferimento possono variare in base allet. Se ci accorgiamo di un evento del genere
durante la valutazione dei valori ottenuti nella nostra popolazione, dovremo ricalcolare gli intervalli di riferimento in
un congruo numero di soggetti appartenenti alle diverse fasce det.
2. Per molti analiti, gli intervalli di riferimento possono variare in base al sesso. Se ci accorgiamo di un evento del genere
durante la valutazione dei valori ottenuti nella nostra popolazione, dovremo ricalcolare gli intervalli di riferimento in
un congruo numero di soggetti appartenenti ai due sessi.
Ovviamente per gli analiti i cui intervalli di riferimento variano in base allet e al sesso, il laboratorio dovr riportare sul referto, di
volta in volta, gli intervalli di riferimento corrispondenti allet e al sesso del soggetto in esame.
Il CONFRONTO DEL RISULTATO ottenuto CON I VALORI DI RIFERIMENTO permette di discriminare subito una condizione
(normale o patologica), tuttavia esistono dei limiti dei valori di riferimento:
Variazioni significative si possono verificare anche nellambito di valori di riferimento considerati normali. Ad
esempio, se in un individuo si verifica un aumento di creatinina in 10 gg da 54 a 108 (Val. Rif: 45-110 mmol/L), pur
essendo sempre valori compresi negli intervalli di riferimento, probabile che si sia verificato un danno renale che ha
causato un aumento dei valori di creatinina.
Utilizzo degli intervalli di riferimento (segue)
Alcuni analiti hanno una distribuzione asimmetrica (es. la bilirubina sierica), e quindi non corretto calcolare gli intervalli di
riferimento con la procedura dellanalisi statistica parametrica (o gaussiana).
Poich gli intervalli di riferimento sono pari alla media ottenuta nella popolazione di riferimento pi o meno 2 DS. il 5% dei soggetti
normali presenter valori dellanalita al di fuori delle 2 DS (cio al di fuori degli intervalli di riferimento) pur non avendo nessuna
patologia in atto. In questo caso ricordiamo la regola che lesame di laboratorio da solo non serve mai a formulare o escludere una
diagnosi, ma va valutato nel contesto clinico di ogni paziente.
Per alcuni parametri non corretto parlare di intervalli di riferimento, ma si parla di valori decisionali, valori desiderabili o altro.
Nella lezione sul metabolismo lipidico mostreremo come, per il colesterolo e per i trigliceridi sierici invece di utilizzare gli intervalli
di riferimento si utilizzino i valori desiderabili.

LEZIONE 5

Validit diagnostica dei test di laboratorio
Un buon test di laboratorio dovrebbe essere in grado di distinguere i soggetti affetti da una malattia rispetto ai sani. Questi parametri
vengono indicati come sensibilit diagnostica e specificit diagnostica che non vanno confusi con i parametri di sensibilit e
specificit analitiche discussi nelle precedenti lezioni.
E importante sottolineare che la sensibilit e la specificit sono interdipendenti. I valori di sensibilit e specificit diagnostica del test
si calcolano con le formule:
Sensibilit diagnostica = VP/(VP + FN)
Specificit diagnostica = VN/(FP +VN)
Dove VP (veri positivi) la percentuale di soggetti affetti, positivi al test; FP (falsi positivi) la percentuale di soggetti sani positivi
al test; FN (falsi negativi) la percentuale di soggetti affetti negativi al test; VN (veri negativi) la percentuale di soggetti sani,
negativi al test.


Esempio
Facciamo un esempio:
Abbiamo 100 soggetti diabetici e 100 soggetti sani; eseguiamo la glicemia, e verifichiamo che in 90 diabetici la glicemia superiore
al massimo valore di riferimento (100 mg/dL), ma vi sono 15 soggetti sani che hanno la glicemia alterata.
Quindi:
VP: 90/100 (soggetti diabetici con test alterato);
FP: 15/100 (soggetti sani con test alterato);
FN: 10/100 (soggetti diabetici con test normale);
VN: 85/100 (soggetti sani con test normale).
Quindi, la sensibilit diagnostica sar:
90 / (90 + 10) = 90%
La specificit diagnostica sar:
85 / (15 + 85) = 85%


Valore predittivo
Oltre ai parametri di sensibilit e specificit diagnostiche, per conoscere il veale contributo diagnostico di un test di laboratorio, si
utilizzano i parametri di predittivit positiva e negativa.
Predittivit positiva (PP)
Se eseguo il test di laboratorio su una popolazione P, in cui presente la malattia ma non tutti sono affetti, il mio esame quanto in
grado di predire quali sono i soggetti malati?
PP = VP/(VP + FP)

Predittivit negativa (PN)
Se eseguo il test di laboratorio su una popolazione P, in cui presente la malattia ma non tutti sono affetti, il mio esame quanto in
grado di predire quali sono i soggetti sani?
PN = VN/(VN + FN)


Esempio
Utilizzando ancora i numeri del precedente esempio sulla glicemia e i soggetti diabetici, calcoliamo i valori di predittivit:
Predittivit positiva (PP)
PP = VP/(VP + FP)
PP = 90 / (90 + 15) = 85.7%
Predittivit negativa (PN)
PN = VN/(VN + FN)
PN = 85 / (85 + 10) = 89.5%
Quindi, se effettuo la glicemia ed ottengo un risultato positivo, avr l85.7% di probabilit che il paziente sia affetto da diabete. Se
viceversa trovo un valore normale, avr l89.5% di probabilit che il soggetto sia sano.
Ancora una volta dobbiamo ricordare che il test di laboratorio, da solo, non in grado di escludere o confermare con certezza una
diagnosi.


Distribuzione della concentrazione di un analita
Valori di un analita nei soggetti sani (sinistra) e malati (destra)
Quando si effettua un test di laboratorio, la situazione pi frequente che valori molto alti di analita indicano in genere la presenza di
una malattia; valori molto bassi, indicano invece lassenza di malattia, e valori intermedi possono essere compatibili sia con la
presenza che con lassenza di malattia.
Se andiamo a rappresentare questa situazione con un grafico, osserviamo che le due popolazioni, quella dei sani (a sinistra nella
figura) e quella dei malati (a destra nella figura) si distribuiscono secondo due gaussiane che si sovrappongono in corrispondenza dei
valori intermedi del test di laboratorio.
A questo punto, possiamo variare il valore soglia o cut-off del test per cercare di separare meglio le due popolazioni.

Valori di un analita nei soggetti sani (sinistra) e malati (destra).

Effetto dello spostamento del cut-off
Se torniamo allesempio della glicemia e del diabete, possiamo decidere di usare come valore soglia un valore di 140 mg/dL di
glicemia (come mostrato nella figura in alto). In questo caso, vi saranno pochissimi soggetti sani che hanno una glicemia superiore
a 140 mg/dL, per cui avremo pochi soggetti falsi positivi. Il test avr unaltissima specificit diagnostica (perch tutti i soggetti
positivi al test sono realmente malati) tuttavia vi saranno diversi diabetici con glicemia inferiore a 140 mg/dL che non saranno
riconosciuti dal test. Il test avr quindi una bassa sensibilit diagnostica.


Effetto dello spostamento del cut-off (segue)
Se invece usiamo un valore soglia pi basso, per esempio 90 mg/dL di glicemia, vi saranno pochissimi diabetici con glicemia
inferiore a 90 mg/dL, quindi il test avr unaltissima sensibilit diagnostica. Tuttavia, vi saranno molti soggetti normali con glicemia
superiore a 90 mg/dL, e quindi avremo una serie di falsi positivi. Cio il test avr una scarsa specificit diagnostica.
A seconda del problema clinico, possiamo decidere di privilegiare la sensibilit diagnostica oppure la specificit diagnostica, e nelle
prossime diapositive vedremo degli esempi.


Validit diagnostica dei test di screening
Negli screening, necessario identificare tutti i soggetti affetti, anche se questo pu significare un aumento di falsi positivi. Quindi,
usiamo un valore soglia basso, che permetta un forte aumento della sensibilit diagnostica.
Ad esempio, nello screening effettuato sui donatori di sangue, per escludere i campioni infetti, necessario adottare test provvisti
della massima sensibilit diagnostica: infatti, se da un lato tollerabile lo scarto di una quota considerevole di campioni non infetti
(falsi positivi), dallaltro indispensabile tutelare chi riceve la donazione e quindi non si pu correre il rischio di trasfondere sangue
infetto risultato falsamente negativo ai test.
Nello screening neonatale per la fenilchetonuria (una malattia genetica in cui carente un enzima del metabolismo degli aminoacidi)
occorre diagnosticare la malattia alla nascita perch occorre tempestivamente porre il paziente in restrizione dietetica, per evitare
danni irreparabili al sistema nervoso. Utilizzeremo quindi un test con un valore soglia basso, allo scopo di avere la massima
sensibilit diagnostica ed esser certi di individuare tutti i pazienti affetti; successivamente potremo usare un secondo test pi specifico
per escludere quelli sani che risultavano positivi al test di screening (falsi positivi).
Validit diagnostica della mioglobina e della cTroponinaI
Per la diagnosi di infarto del miocardio, sono disponibili due marcatori biochimici, la mioglobina e la troponina.
Il dosaggio della miogobina presenta una sensibilit diagnostica del 98% e una specificit diagnostica del 55%.
Il dosaggio della cTroponina I presenta una sensibilit diagnotica pari all85% e una specificit diagnostica del 100%.
Inoltre (vedasi lezione sui marcatori dellinfarto), la mioglobina aumenta nel siero pi precocemente rispetto alla troponina.
In un pronto soccorso assolutamente necessario riconoscere quanti pi soggetti possibile affetti da infarto. Quindi, la strategia pi
idonea quella di utilizzare la mioglobina (che ha unelevata sensiiblit diagnostica) e successivamente la troponina (molto
specifica).

Sensibilit e specificit diagnostica della mioglobina.


LEZIONE 6
Funzioni del rene
Le principali funzioni del rene sono:
Eliminare dallorganismo prodotti di rifiuto e sostanze tossiche idrosolubili (soprattutto prodotti azotati e creatinina);
Regolare il volume e la composizione del liquido extracellulare;
Funzione metabolica (gluconeogenesi);
Funzione endocrina (produzione di renina, eritropoietina, trasformazione dei precursori della vitamina D nella forma
attiva 1,25 di idrossi colecalciferolo).
Lunit funzionale del rene il Nefrone che effettua la filtrazione del sangue (1.1-1.3 dL/min, pari a 170 L/die).
La filtrazione glomerulare dipende, per ciascuna sostanza, da:
Flusso ematico renale;
Pressione nei capillari glomerulari;
Pressione nella capsula di Bowman;
plasmatica;
coefficiente di filtrazione glomerulare.
Nefrone
Il nefrone comprende, oltre al glomerulo, il tubulo contorto prossimale, lansa di Henle, il tubulo contorto distale e il dotto collettore.

Il tubulo contorto prossimale provvede a:
riassorbimento attivo della maggior parte dei soluti filtrati (glucosio, bicarbonati, potassio, 2/3 del sodio, proteine) e di
un volume isosmotico di acqua;
Secrezione di creatinina, steroidi e loro derivati glicuronidi.
Lansa di Henle, cui perviene urina isosmotica provvede:
al processo di moltiplicazione in controcorrente che genera lipertonicit midollare, indispensabile per regolare
leliminazione dellacqua e formare urina concentrata.
Nefrone (segue)
Il tubulo contorto distale, cui perviene urina ipotonica provvede a:
microregolazione della composizione dellurina:
riassorbimento del sodio mediato dallaldosterone
secrezione di K
+
e H
+

Il dotto collettore:
regola losmolalit urinaria mediante riassorbimento di acqua senza soluti, per azione della vasopressina;
forma urina ipertonica (1200-1400 mOsm =500 ml/die) in caso di antidiuresi;
forma urina ipotonica (30 mOsm = 16 ml/min) in caso di diuresi da acqua.
Velocit di filtrazione glomerulare
La filtrazione glomerulare varia quindi sulla base di diversi parametri, ma soprattutto alterata in alcune patologie.
Valutazione della filtrazione glomerulare
Si basa sul concetto di clearance. La clearance il volume plasmatico da cui una sostanza completamente rimossa (cleared) durante
il transito renale, nellunit di tempo.
Clearance = Concentrazione Urinaria/Concentrazione sierica x Flusso urinario x 1,73 (superficie corporea).
Valori di riferimento:
Neonati 10 mL/min/m
2

2-8 settimane 13,6-44,6 mL/min/m
2

12-20 settimane 124 mL/min/m
2

1 anno-adulto 100-140 mL/min/m
2

Dopo i 50 anni diminuisce di 13 mL/min/m
2
ogni 10 anni.
Clearance
Caratteristiche ideali di una sostanza per la valutazione della clearance:
liberamente filtrata dal glomerulo;
eliminata solo per filtrazione renale;
n secreta n riassorbita dal rene;
non tossica;
facilmente determinabile.
La sostanza che pi si avvicina a queste propriet ideali la creatinina, come si vede anche dalla figura. Quindi, per la misurazione
della filtrazione glomerulare possibile effettuare la clearance della creatinina.

Confronto tra analiti nella determinazione della clearance.

Clearance della creatininaDeterminazione della clearance della creatinina
Determinazione della clearance della creatinina
1. Prelevare 2 campioni di sangue (prima e dopo la raccolta delle urine);
2. Raccogliere le urine delle 24 h e misurare il volume urinario totale (V, espresso in mL/min);
3. Misurare la superficie corporea in metri quadri;
4. Dosare la creatinina sierica (S) ed urinaria (U);
5. Applicare la formula:
o Clearance della creatinina = Crea (U)/Crea (S) x V x (1,73/superficie corporea)
Cause di errori nella determinazione della clearance della creatinina:
Inaccuratezza analitica della determinazione della creatininemia;
Interferenze dovute alla dieta e alla massa muscolare;
Inaccuratezza nella misurazione del volume urinario;
Coefficiente di variabilit biologica 11%;
Differenza critica 33%.
Creatininemia
La clearance della creatinina un test accurato per valutare la filtrazione glomerulare, tuttavia piuttosto indaginoso (in particolare
necessario raccogliere le urine delle 24 ore) e, come abbiamo visto nella precedente diapositiva, risente di alcune fonti di errore.
Quindi, possiamo ricorrere al dosaggio della creatinina sierica i cui livelli correlano bene con la filtrazione glomerulare e con la
clearance della creatinina (vedi figura).
La creatinina un catabolita della creatina (pool della creatina 120 g, di cui il 98% si localizza a livello muscolare). La creatina
sintetizzata nel rene e nel fegato (da arginina, glicina e metionina), attraverso il circolo diffonde ai tessuti, soprattutto quello
muscolare, dove viene fosforilata ed utilizzata come riserva energetica. Linterconversione tra creatinina e fosfocreatinina una
caratteristica peculiare della contrazione muscolare.
Per tale motivo la concentrazione sierica di creatinina dipende molto dalla massa muscolare, poco dalla dieta.
Intervalli di riferimento: 0.81.2 mg/dL
Quindi, nelle fasi iniziali di malattia pu essere utile effettuare la clearance, poi, nel monitoraggio del paziente con insufficienza
renale pu essere utilizzata la creatinina sierica.

Correlazione tra creatininemia e clearance.

Urea
Il dosaggio sierico dellurea pu contribuire alla valutazione della filtrazione glomerulare, anche se la creatinina un indice pi
sensibile e specifico.
Lurea sintetizzata a livello di fegato, rene e cervello dal catabolismo proteico. A livello renale viene filtrata e riassorbita per circa il
50%. Se la VFG diminuisce, aumenta il riassorbimento.
La concentrazione plasmatica dellurea dipende da:
Velocit di produzione (apporto proteico, catabolismo tissutale, funzione epatica);
Velocit di eliminazione (velocit di filtrazione glomerulare, funzione renale).
I valori di riferimento sono pi bassi nel bambino, perch il catabolismo proteico ridotto.

Limitazioni
La quantit prodotta presenta notevoli variazioni in relazione alla dieta e alla funzionalit epatica.
Lurea riassorbita passivamente nel tubulo distale insieme allacqua: in condizioni di diuresi viene escreta una quantit maggiore di
urea; in antidiuresi la concentrazione plasmatica aumenta. Questo spiega la tendenza allaumento dellurea prima di quello della
creatinina nei pazienti con alterazioni prerenali della funzione renale.
Cistatina C
La Cistatina C un polipeptide cationico di circa 13 kDa appartenente alla famiglia delle cisteine proteasi, quindi coinvolta nel
catabolismo proteico.
sintetizzata in maniera costante in tutte le cellule, e non sono registrati livelli aumentati durante gli stati infiammatori.
A livello renale viene filtrata, riassorbita in tutto il tubulo e degradata ad aminoacidi.
La concentrazione plasmatica correla strettamente con la VFG, quindi risponde pi prontamente alle variazioni di VFG.
Metodo di dosaggio: immunonefelometrico.
Sembrerebbe pi sensibile della creatininemi nel segnalare una riduzione della filtrazione glomerulare, ma non vi sono ancora chiare
evidenze.
Valutazione della VFG
In conclusione, possiamo dire che i 4 indici per la valutazione della velocit di filtrazone glomerulare (VFG) hanno una diversa
sensibilit diagnostica. In ordine decrescente, la loro sensibilit e:
Clearance della creatinina
Quando la VFG < 100 mL/min/1,73 m
2

Cistatina C
Quando la VFG < 80 mL/min/1,73 m
2

Creatininemia
Quando la VFG < 50 mL/min/1,73 m
2

Uremia
Quando la VFG < 30 mL/min/1,73 m
2