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INTRODUZIONE

1.1 Bioetanolo : cenni storici.

Henry Ford, gi negli ultimi anni del diciannovesimo secolo, progettava macchine alimentate da bioetanolo ottenuto dal grano. Tuttavia i carburanti di origine fossile, grazie al loro basso prezzo, dominarono il mercato degli inizi del 900. Questa situazione si prolung per decenni fino allarrivo della crisi petrolifera degli anni 70 che mise in evidenza limportanza e lesigenza di risorse energetiche alternative rappresentate soprattutto dal bioetanolo. Gli ultimi decenni vedono inoltre un consumo eccessivo di combustibili fossili sopratutto nelle aree urbane e questo ha contribuito al raggiungimento di alti livelli di inquinamento. Come primo passo per la risoluzione di questo problema, il bioetanolo viene utilizzato, negli Stati Uniti, come additivo nelle benzine E10 (contenente il 10% di etanolo e il 90% di benzina senza piombo), E85 (85% etanolo, 15% benzina). Questo permette di ridurre le emissioni di monossido di carbonio e idrocarburi che sono generati nella

combustione del carburante. Nel 1990 il Clean Air Act, approvato dal Congresso Americano, impone un contenuto minimo di etanolo nelle benzine utilizzate nelle aree metropolitane pi inquinate. Grazie allapprovazione di questi emendamenti e alle successive sovvenzioni statali si pens che le attivit di ricerca e la produzione di bioetanolo potessero essere promosse e sviluppate adeguatamente. Tuttavia la presenza sul mercato dellMTBE, ha rallentato lo sviluppo del combustibile di origine vegetale. LMTBE un etere che viene utilizzato nelle benzine per linferiore

tossicit rispetto al benzene ed al piombo tetraetile. Inoltre rispetto alletanolo presenta vantaggi economici e prestazionali. La produzione statunitense di etanolo comunque continuata a crescere negli anni, in particolare prevista per il 2007 una produzione di 6,2 Miliardi di galloni (pari a 28,2 miliardi di litri).

Figura 1 Crescita costante della produzione statunitense di etanolo.

Il primo produttore mondiale di etanolo rimane sempre il Brasile, dove i costi di produzione sono inferiori del 50% rispetto agli Stati Uniti. Questa immensa differenza dovuta principalmente al fatto che in Brasile, grazie alle condizioni climatiche favorevoli, viene utilizzata la canna da zucchero. Questa materia prima una fonte maggiore di zuccheri fermentabili ed piu semplice da coltivare e processare rispetto al grano statunitense. Inoltre i sussidi statali e le pesanti tassazioni sulle benzine tradizionali, hanno contribuito alla formazione negli anni di

un

efficiente

sistema

produttivo.

Oggi

il

Brasile

possiede

la

tecnologia

lattrezzatura per produrre regolarmente 16 miliardi di litri di etanolo allanno. Essendo inoltre il maggiore esportatore, grazie alla crescente domanda mondiale, si prevede un raddoppio della produzione nei prossimi 10 anni. Infatti nel mondo letanolo si propone come combustibile alternativo, per linteresse e lattenzione a ridurre le emissioni di CO2. In Europa la Svezia la nazione dove il mercato del bioetanolo si sta sviluppando maggiormente. La realt italiana vede le associazioni agricole impegnate a siglare accordi per aumentare la produzione di bioetanolo promettendo anche un aiuto rilevante allagricoltura. Sempre in Italia si sta sviluppando un progetto riconosciuto a livello europeo che vede letanolo utilizzato in celle a combustibile, per la produzione di elettricit, in una miscela di acqua al 90% ed etanolo al 10%. Questa tecnologia alquanto promettente perch permetter di abbattere i costi di distillazione nel costoso processo di produzione, unico svantaggio dellutilizzo del bioetanolo.

1.1.1 Metodi di produzione del bioetanolo

Il bioetanolo viene prodotto attraverso un processo di fermentazione di diversi substrati derivati soprattutto da raccolti di canna da zucchero, barbabietola, grano e cereali. Linvestimento su questi materiali di partenza pu raggiungere il 40% del costo di produzione. Dalla canna da zucchero e dalla barbabietola possono essere ricavati glucosio e fruttosio per conversione del saccarosio presente, mentre cereali

e grano sono ricchi di amido che pu essere convertito in glucosio (J. Zaldivar, J. Nielsen, L. Olsson, 2001). La via preferita per la produzione del bioetanolo prevede lutilizzo di materiale amidaceo contenuto, oltre che in grano e cereali, anche in frumento, riso e orzo. Lamido un polisaccaride composto da due polimeri : lamilosio (circa 20%) e lamilopectina (circa l80%), entrambi composti da glucosio ma con differenze nella loro struttura. Lamilosio un polimero lineare in cui le unit di glucosio sono legate tra loro attraverso legami glicosidici 1-4; lamilopectina invece un polimero ramificato simile allamilosio ma ogni 24-30 unit presenta delle ramificazioni con legami glicosidici 1-6. Saccharomyces cerevisiae il lievito pi utilizzato per la produzione di bioetanolo ma non in grado di effettuare una fermentazione diretta sullamido. I materiali amidacei di partenza devono essere pretrattati al fine di ottenere una conversione dellamido in zuccheri fermentabili dal lievito.

Il pretrattamento del grano comprende tre fasi:

Fase I : prevede la pulizia del grano per rimuovere tutti i residui leggeri e consentire il recupero di co-prodotti quali il germe di grano e gli oli vegetali.

Fase II : consiste nella macinazione del grano per renderlo facilmente idratabile con acqua.

Fase III : attraverso una cottura iniziale il grano viene gelatinizzato in una miscela contenente circa 0,27 kg di grano per litro di acqua. Il processo di

cottura dura 10-30 minuti e si raggiunge una temperatura compresa tra i 135180 C. Le alte temperature permettono una sterilizzazione della miscela ed una minore degradazione degli zuccheri dovuta ad un minor tempo di cottura. Questo permette di migliorare le rese finali in etanolo. Il processo avviene inoltre mantenendo una pressione che maggiore di quella atmosferica. La miscela viene poi raffreddata al di sotto dei 65 C per evitare che gli enzimi vengano inattivati dalle alte temperature al momento della loro

somministrazione. Dopo il pretrattamento lamido contenuto nel grano viene degradato in zuccheri semplici. La scissione pu avvenire per via enzimatica o tramite idrolisi acida. Gli enzimi in grado di scindere lamido sono le amilasi e vengono utilizzati diversi metodi mirati ad ottimizzare le condizioni della degradazione enzimatica. A questo scopo possibile utilizzare amilasi microbiche prodotte dai ceppi Mucor rouxii, Mucor buolard o Rhizopus delemar. Queste colture vengono aggiunte al grano gelatinizzato e fatte crescere in coltura aerata a 40 C, condizioni ottimali per la produzione di amilasi extracellulari che idrolizzano lamido. Un altro metodo prevede la somministrazione di orzo germinato che, una volta riattivato con acqua calda, possiede alte attivit amilasiche. Lorzo germinato, dopo un passaggio in acqua calda, viene aggiunto al grano gelatinizzato. Grazie alle amilasi, lamilosio ed una parte di amilopectina, vengono idrolizzati a maltosio. Mentre la restante parte di amilopectina, contenente le ramificazioni, viene idrolizzata a destrine non fermentabili. Il maltosio liberato pu essere a questo punto utilizzato direttamente nella fermentazione. La degradazione dura 40 minuti e circa il 75-80% dellamido viene idrolizzato a maltosio mentre il residuo restante

 costituito dalle destrine. Un problema di questo metodo sono le possibili contaminazioni batteriche provenienti dallorzo germinato non sterilizzato. Infatti la sterilizzazione viene impossibile in quanto causerebbe linattivazione delle amilasi. I batteri contaminanti possono quindi competere con i lieviti per il maltosio ed abbassare quindi le rese finali in etanolo. Lidrolisi acida invece prevede laggiunta di acidi deboli alla miscela amidacea. Lacido solfidrico diluito pu essere somministrato in fase di gelatinizzazione del grano dopo neutralizzazione della miscela con calcio carbonato ed un successivo rapido raffreddamento. Questa tecnica permette di liberare unalta frazione di zuccheri dallamido ma comporta anche la distruzione di parte dei nutrienti naturali indispensabili al lievito per la successiva fermentazione. Questo comporta successivi costi aggiuntivi per laggiunta di estratto di lievito o di grano come fonte di nutrienti cellulari. Oltre allalto costo iniziale del materiale amidaceo, la produzione di bioetanolo utilizzando lamido come substrato richiede altri costi, rendendo il processo ancora molto oneroso. Per questo motivo nuovi tentativi mirano allutilizzo di materie prime meno costose. Ogni anno grandi quantit di biomassa, di diversa provenienza, vengono

accumulate in natura causando problemi di inquinamento. I materiali lignocellulosici rappresentano una grande porzione di questi prodotti di scarto. Inoltre sono reperibili a basso costo ed il loro utilizzo risolve anche problemi di smaltimento. La lignocellulosa un polimero molto abbondante in natura, ricopre circa il 50% della biomassa mondiale (10-50 miliardi di tonnellate). Malgrado tutti questi vantaggi il suo utilizzo come substrato per la produzione di bioetanolo molto complicato. Infatti la sua complessa struttura rende questo

polimero molto resistente alla degradazione sia per via enzimatica che per via chimica. La lignocellulosa composta da tre polimeri : La cellulosa (circa 45% del peso secco), lemicellulosa (circa il 30% del peso secco) e la lignina (circa il 25% del peso secco).

Figura

Diversa

composizione

delle

tre

frazioni

che

compongono

la

lignocellulosa : Cellulosa, Emicellulosa e Lignina. G : Glucosio, Gal : Galattosio, Man : Mannosio, X: Xilosio, Ara : Arabinosio. (J. Zaldivar, J. Nielsen, L. Olsson, 2001).

La cellulosa il polimero ad alto peso molecolare pi abbondante del pianeta; composto da molecole di glucosio anidro legate fra loro da legami glicosidici 1-4. La sua struttura secondaria e terziaria permettono lassociazione con molecole di lignina, emicellulosa, proteine e amido, implicando una maggiore resistenza alla degradazione. Tuttavia la cellulosa pu essere idrolizzata sia enzimaticamente che per via chimica.

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Gli enzimi utilizzati sono le cellulasi che sono distinguibili in classi diverse a seconda del legame che idrolizzano:

Le endoglucanasi scindono i legami 1-4 allinterno della struttura della cellulosa

Le esoglucanasi separano una molecola di glucosio o cellobiosio ad una delle due estremit della molecola.

Le glucosidasi idrolizzano invece il cellobiosio a glucosio.

Lemicellulosa un eteropolimero altamente ramificato la cui composizione dipende dal tipo di tessuto da cui proviene. Le unit che formano questo eteropolisaccaride sono esosi (galattosio, mannosio, ramonsio, fruttosio), pentosi (xilosio e arabinosio) e acido glucuronico. Lidrolisi dellemicellulosa pi semplice rispetto alla cellulosa ed effettuata tramite emicellulasi oppure chimicamente con acidi o basi diluite (J. Zaldivar, J. Nielsen, L. Olsson). La lignina una macromolecola di carattere fenolico prodotta dalla deidratazione di tre alcoli monomerici. Per liberare dalla lignocellulosa le unit monomeriche fermentabili, il polimero deve essere processato in due fasi: la prima fase prevede lutilizzo di microrganismi, che degradando la lignina, permettono la liberazione di cellulosa ed emicellulosa. Una seconda fase di depolimerizzazione viene effettuata tramite un trattamento enzimatico per ottenere il glucosio dalla cellulosa.

Lemicellulosa invece viene trattata con metodi chimici e fisici per la liberazione di esosi e pentosi. Il glucosio liberato da cellulosa e emicellulosa fermentato efficientemente mentre la conversione dei pentosi piu difficoltosa, specialmente

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se nella miscela presente contemporaneamente glucosio; purtroppo lemicellulosa composta appunto da una frazione di glucosio rilevante e questo rende molto difficile la completa fermentazione dei monomeri presenti. La lignina non utilizzabile per la produzione di bioetanolo perch nessun microrganismo conosciuto in grado di utilizzare i monomeri che la compongono (J. Zaldivar, J. Nielsen, L. Olsson, 2001). La degradazione della lignocellulosa porta inoltre alla formazione di composti che possono avere effetti inibitori verso i microrganismi utilizzati nella fermentazione. Il meccanismo di azione di tali inibitori dipende dalla loro struttura chimica. Il furfurolo un composto normalmente presente negli idrolizzati con acidi diluiti e pu raggiungere una concentrazione di 2-3 g/litro. Il metabolismo di

Saccharomyces cerevisiae inibito fortemente dalla presenza di questo composto sia in condizioni fermentative che in condizioni di crescita (I. Horvth, C. Franzn, M. J. Taherzadeh et al. 2003). La presenza di furfurolo crea uninibizione dellacetaldeide deidrogenasi con conseguente accumulo di acetaldeide, dannoso alla cellula. Leffetto di questi inibitori pu causare quindi una perdita rilevante nella resa finale in etanolo. Tuttavia Saccharomyces cerevisiae mostra dei meccanismi di difesa nei confronti del furfurolo; in condizioni di anaerobiosi in grado di convertirlo in alcool furfilico mentre in aerobiosi ossidato ad acido furonico (I. Horvth, C. Franzn, M. J. Taherzadeh et al. 2003). Esistono comunque altri metodi per evitare laccumulo di tali composti durante i processi di pretrattamento della lignocellulosa. Rimane comunque di grande interesse utilizzare microrganismi in grado di sviluppare meccanismi di resistenza verso questi inibitori, evitando cosi costi aggiuntivi nel processo di produzione. Questi microrganismi devono resistere

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anche ad alte concentrazioni di etanolo nelle soluzioni industriali e devono essere in grado di fermentare sia esosi che pentosi in maniera produttiva. Un valido utilizzo della lignocellulosa ed in particolare dellemicellulosa

permetterebbe infatti di moderare i costi di produzione del 25%. Purtoppo al momento non si conosce alcun microrganismo con tali caratteristiche; sono quindi in corso studi di ingegneria metabolica che mirano a migliorare la produzione e le propriet dei microrganismi. Questo tipo di interventi vengono sviluppati su microrganismi come Pichia stipitis, Zymomonas mobilis, Klebsiella oxytoca e Escherichia coli, per permettere un utilizzo appropriato di fonti di carbonio alternative da parte di questi potenziali microrganismi per la produzione di bioetanolo.

1.2 Il glucosio : fonte energetica primaria

1.2.1 La via glicolitica

La glicolisi un processo metabolico mediante il quale una molecola di glucosio viene scissa in due molecole di piruvato al fine di generare molecole ad alta energia. Rappresenta il mezzo per ottenere energia piu sfruttato in natura ed prevalentemente utilizzato nei lieviti per la conversione degli esosi fosfato in piruvato. Le reazioni che compongono la glicolisi avvengono nel citoplasma e sono catalizzate da enzimi che ricoprono il 65% delle proteine solubili.

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