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RECETTORI DELLOLFATTO
di Vittoria Battistello ed Eleonora Bechelli
Un po di storia po
1965: Robert Gesteland mostr come differenti neuroni sensori olfattivi venissero depolarizzati da differenti odoranti. Negli anni successivi, John Amoore propose che questi neuroni possedessero delle proteine recettori in grado di variare la loro affinit ai differenti odoranti 1980: studi biochimici su ciglia isolate da epitelio olfattivo di ratto stimolato con composti odorosi dimostrarono: aumento dei livelli di cAMP nelle cellule 1988: Richard Axel e Linda Buck iniziarono la ricerca dei recettori olfattivi. 1989: tramite tecniche di cloning molecolare scoperte le strutture di 20 di questi GPCRs. 1991: identificazione nel ratto dei cDNA per i recettori olfattivi 2000: l individuazione sequenza del genoma umano e di quello del topo ha reso possibile la determinazione del numero di geni per gli OR in queste specie (Lancet e Zozulya per l uomo nel 2001, Firestein e Trask per il topo nel 2002). 2004: I ricercatori Axel e Buck vincono il premio Nobel per la Medicina. Hanno scoperto una grande famiglia di geni, formata da circa 1.000 geni diversi (il tre percento dei nostri geni) da cui origina un numero equivalente di tipi di recettori olfattivi.
In molte patologie neurologiche e psichiatriche (quali Alzheimer, Parkinson, schizofrenia) il sistema olfattivo precocemente coinvolto. Anzi, spesso i deficit olfattivi rappresentano proprio i primi sintomi con cui si manifesta la malattia. Conoscere meglio quindi il funzionamento di questo sistema risulta fondamentale per capire e curare (precocemente) le alterazioni che incorrono in caso di patologia. Alcuni ricercatori della Scuola di Medicina dell'Universit della Pennsylvania hanno collegato la perdita di odorato nei topi con i livelli eccessivi di una proteina chiave associata a disturbi come l'Alzheimer e il Parkinson. La perdita dell'olfatto ben documentata come uno dei primi segni clinici di queste malattie. Se le funzioni declinano in corrispondenza dell'aumento di questa proteina nelle regioni cerebrali associate all'odorato, la ricerca potrebbe convalidare l'uso dei test olfattivi per la diagnosi del morbo di Alzheimer.
La percezione degli odori inizia nel naso, dove sono percepiti da una larga famiglia di recettori per l olfatto.
I recettori del sistema olfattivo sono veri chemocettori Si trovano sulle ciglia dei neuroni sensoriali olfattivi Rigenerano in 60 giorni
I neuroni olfattivi si trovano nell epitelio olfattivo e terminano con ciglia situate nel muco della cavit nasale. Dalla porzione basale origina un assone che si dirige nella base cranica e forma connessioni sinaptiche nel bulbo olfattivo. Il segnale viene trasmesso ai glomeruli formati da cellule mitrali e a grappolo.
Il legame di molecole odorose produce un potenziale di recettore depolarizzante La depolarizzazione viene codificata in una scarica di potenziale d azione I neuroni olfattivi contattano i neuroni nel bulbo olfattivo Il neurone mitrale costituisce il secondo neurone della via.
COSA E UN ODORE? E
Nasi allenati distinguono 5000-10000 odori diversi L odore varia in base a: Gruppi funzionali (ottanolo: arancio; acido ottanoico: rancido) Lunghezza della catena (ottanolo: arancio; eptanolo: violetta) Stereoselettivita : (L-carvone: carruba; D-carvone: menta piperita) Effetti della concentrazione Indolo a basse concentrazioni ha odore floreale, concentrato ha odore putrido Amil acetato ha profumo di frutta a concentrazioni tra 0.1 mM e 10 mM
Riconoscimento combinatoriale: Ogni neurone esprime solo un recettore. Odori sono composti da pi molecole e ognuna di queste attiva un recettore . Recettori riconoscono piu molecole.
Una molecola odorante non viene riconosciuta in toto, ma va ad attivare pi recettori. Ad uno stadio successivo I segnali dei recettori vengono integrati e il profumo della molecola emerge.
Ogni odorante lega pi recettori e cosi genera un attivazione specifica per ogni profumo, questo spiega come un infinito numero di profumi pu essere percepito da un limitato numero di recettori.
Zozulya, S., Echeverri, F., Nguyen, T. (2001) Genome Biology 2, n6, 101-112
Attivazione dei recettori Attivazione della proteina Golf Attivazione della ACIII Attivazione di un canale CNG (nucletide-gated ione channel) Attivazione di un canale del Cl- Ca2+-dipendente Depolarizzazione del ciglio
Schmiedeberg, K., Shirikova, E., Weber, H., Schilling, B. (2007) Journal of Structural Biology 159, 400-412
Famiglia molto ampia (1000 geni nei mammiferi 2% del genoma) 636 geni conosciuti ad oggi:di cui 339 geni intatti, 297 pseudogeni Il 60% sono pseudogeni: perdita di capacita olfattiva durante l evoluzione OR si trovano su 21 cromosomi tranne Y, 20 e 8 Suddivisi in 172 sottofamiglie: ciascuna selettiva per classi di strutture Sequenza aminoacidica varia da 290 a 350 residui; conservati dal 20% al 60%
Sequenze conservate: Loop intracellular IC3 Giunzione tra T3 e IC2 Riflette interazioni con patners intracellulari ( proteina G) Sequenze variabili: Loop extracellulari EC1 ed EC3 Domini transmembrana TM3, TM5 e TM6 Estremit amino e carbossi terminale Riflette specificit di legame del recettore 4 cisteine conservate in EC1 ed EC3: formano ponti disolfuro interintramolecolari critici per riconoscimento dei legandi
Malnic, B., Godfrey, P. (2004) Proc.Natl.Acad.Sci USA 101, 2584-2589
mOR-EG: recettore del topo per eugenolo adatto per: Studio relazioni struttura attivit (anello benzenico) Analisi computazionale-docking simulation Basi molecolari del riconoscimento degli odori
Eugenolo
Vanillina
Gli studi di struttura-attivit per mOR-EG sono stati fatti su una serie di odoranti costruiti a partire dai ligandi conosciuti del recettore eugenolo e vanillina, con variazioni su R1, R2 e R3.
Katada, S., Hirokawa, T. (2005) The journal of neuroscience 25 (n7), 1806-1815
Sostituzioni su R1: Gruppi carichi come ammine e ac. Carbossilici non sono accettabili Idrogeno non d risposta Gruppo propenilico rende la molecola antagonista Gruppo metilico e ossidrilico portano a calo d attivit
Katada, S., Hirokawa, T. (2005) The journal of neuroscience 25 (n7), 1806-1815
Sostituzioni su R3:
-H;
-OH no risposta, suggerisce l importanza di interazioni idrofobiche aumenta con le dimensioni del sostiuente
EC50
Sostituzioni su R4: -CH3 H non danno risposta, richiesta la presenza di un atomo di O2 legato all anello Per altri sostituenti EC50 simile
- La disposizione dei tre sostituenti su anello aromatico importante - L eliminazione o aggiunta di un gruppo funzionale comporta la perdit di attivit
Ser113
Thr211 Asn207 Leu212 e Leu259 V calo attivit Ile256 L calo attivit V attivit inalterata Phe206 e Phe252 L calo attivit
V,A perdita attivit C diminuisce attivit T aumenta attivit V,A lieve calo attivit
Il sito di legame si trova in tasca idrofobica formata da TM3-TM5TM6, il residuo di ser113 funge da donatore di legame ad idrogeno e per questo anche come punto d ancoraggio per il ligando. Il residuo di phe252 in TM6 coinvolto nel legame con il g.f. in R1, e nella transizione successiva dalla forma inattiva alla forma attiva del recettore.
Katada, S., Hirokawa, T. (2005) The journal of neuroscience 25 (n7), 1806-1815
OR1A1-OR1A2: deorfanizzazione
In seguito alla scoperta di un nuovo recettore necessario deorfanizzarlo. Il processo di deorfanizzazione ha come scopo l identificazione della coppia ligando-recettore. Nel caso degli OR fondamentale per comprendere: input del sistema olfattivo, identificare sviluppi futuri necessari per comprendere come la variazione dell input influenzi l andamento dei segnali neuronali e il comportamento influenzato dagli odori.
Creazione di un modello 3D per OR1A1 e OR1A2 (basato su raggi x di rodopsina bovina) Docking di (S)-(-)citronella e (S)-(-)citronellolo: - si assegna una conformazione casuale ma stereochimicamente accettabile al ligando - posizionamento del ligando nel sito di legame - ricerca di una sovrapposizione non accettabile tra R-L - ottimizzazione - le migliori 20 conformazioni sono classificate in base all entalpia di legame ( VdW + HB)
Schmiedeberg, K., Shirikova, E., Weber, H., Schilling, B. (2007) Journal of Structural Biology 159, 400-412
Schmiedeberg, K., Shirikova, E., Weber, H., Schilling, B. (2007) Journal of Structural Biology 159, 400-412
SAR: Migliori sono terpenoidi citronellici e aldeidi alifatiche con catena lunga C7-C8 Alcol della stessa lunghezza sono 10 volte meno potenti Geraniolo risulta agonista a concentrazioni submicromolari (S)-(-)citronellolo attiva solo OR1A1 e il suo ortologo ( R)-(+)citronellolo attiva OR1A1, OR1A2 e Olfr43
Schmiedeberg, K., Shirikova, E., Weber, H., Schilling, B. (2007) Journal of Structural Biology 159, 400-412
Mutagenesi sito-diretta per individuare gli aa determinanti la diversa risposta al citronellolo 1. Presi 20 aa che sembrano coinvolti nell interazione col ligando 2. 5 di essi sono diversi tra OR1A1 e OR1A2, mutagenesi 3. Perdita di attivit solo per Gly108 e Asn109
Schmiedeberg, K., Shirikova, E., Weber, H., Schilling, B. (2007) Journal of Structural Biology 159, 400-412
Analisi del sito di legame: si analizza una cavit di 17 aa-TM (11 fanno interazioni idrofobiche) Mutagenesi sito-diretta: T277V perdita totale attivit G108A calo attivit ( interazioni steriche) N109K perdita attivit I205V calo attivit ( perdita interazione tra C=O di I e OH del lig)
Schmiedeberg, K., Shirikova, E., Weber, H., Schilling, B. (2007) Journal of Structural Biology 159, 400-412 400-
Citronellolo Interazioni per OR1A1, sono possibili 3 HB: migliore tra OH del citronellolo e N109. Interazioni per OR1A2: 1 HB e 1 repulsione sterica.
Citronella Interazioni per OR1A1: HB tra C=O e S112 Interazioni per OR1A2: HB tra C=O e S155
Schmiedeberg, K., Shirikova, E., Weber, H., Schilling, B. (2007) Journal of Structural Biology 159, 400-412