HEMATOPOIESIS

HEMATOPOIESIS
WHO Integrated Classifications
Morphology: Immunology:
Cytology Immuno-cyto-
Histopathology histochemistry

Molecular
Cytogenetics Genetics
 Leucemia Acuta Mieloblastica

• De Novo
• Secondaria

Età > 18 anni

 LEUCOSI ACUTE

•LEUCOSI ACUTE “DE NOVO”: NON RICONOSCONO

UNA CAUSA EZIOPATOGENETICA CERTA.
•LEUCOSI ACUTE SECONDARIE: PATOLOGIE
CONGENITE. (Sindrome di Down, Anemia di Fanconi,
Atassia Telangectasia, etc..)
•LEUCOSI ACUTE SECONDARIE: IATROGENE O DA
ESPOSIZIONE A TOSSICI AMBIENTALI
•LEUCOSI ACUTE SECONDARIE: A DISORDINI
MIELOPROLIFERATIVI E SINDROMI
MIELODISPLASTICHE
“Leukemia is a genetic disease”

- point mutations/deletions
- chromosome gain / loss
-chromosomal translocations
-amplification
Citogenetica e Analisi Molecolare delle Leucemie

Diagnosi e Prognosi

Follow-up

Malattia Residua Minima

 Gruppi di rischio in relazione alla valutazione citogenetica

Favorevole Intermedio Sfavorevole

t(8;21) Normale del(5q)/-5

Inv16 +8 del(7q)/-7
del(16q) +6 t(9;22)
t(15,17) 11q23 3q,9q,11q,20q,21q,17p
+21 t(6;9)
+22 Cariotipo complesso (≥3 anomalie non
correlate)
del(12p)
-Y
 Leucemie Acute Mieloidi:
Anomalie citogenetiche e molecolari
 LEUCEMIA ACUTA PROMIELOCITICA ( M 3 )
AML con t (15;17) (q 22;q 12) ; (PML/RARα )
Nella LAM M3, che rappresenta 5-8% delle LAM, la popolazione
dominante a livello midollare è costituita da promielociti atipici, il
citoplasma è repleto di granuli di dimensioni rilevanti, di colore rosso
porpora al Romanowsky. Talora il loro numero è così elevato da
oscurare il nucleo. In una variabile percentuale di cellule sono
presenti numerosi corpi di Auer, sovente raccolti in fasci. I bastoncelli
di Auer sono spesso più larghi che nelle altre forme di LAM. Le
reazioni al Sudan nero e alla Perossidasi sono particolarmente intense
 Leucemia Acuta Promielocitica

I bastoncelli di Auer hanno in

microscopia elettronica una
morfologia caratteristica con
una disposizione esagonale di
strutture tubulari a periodicità
specifica di 250mµ in
contrasto con la periodicità 6-
20 di altre LAM.
 t(15;17)(q15;q21)
t(15;17)(q15;q21)

AML-M3 One of the rare leukaemia where

favorable prognosis treatment is an emergency for
fusion gene: PML RAR intra vascular coagulation
treatment with retinoic acid
A partial G-banded karyotype of two cells from a patient with APL
showing t(15;17)(q22;q21) /(top panel, while insert).
The bottom panel shows PML-RARα fusion (yellow)
in three interphase cells from the same patient
 Leucemie Acute Mieloidi:
Anomalie citogenetiche e molecolari
 t(8;21)(q22;q21)
t(8;21)(q22;q21)

AML-M2
favorable prognosis
fusion gene: AML1-ETO
 CBF LEUKEMIAS

t(8;21) / AML1-ETO
inv(16) / MYH11-CBFB

CBFB
Attivatore Trascrizionale

AML1
Geni target

MPO, IL-3, GM-CSF, CSF-1R

inv
inv (16)(p13q22)
(16)(p13q22)

/ CBFB-MYH11
 CBF LEUKEMIAS

t(8;21) / AML1-ETO
inv(16) / MYH11-CBFB

CBFB
Attivatore Trascrizionale

AML1
Geni target

MPO, IL-3, GM-CSF, CSF-1R

 de novo AML t-AML

OS of 1091 patients with de novo AML according to cytogenetic risk groups. OS of 93 patients with t-AML according to cytogenetic risk groups.
Leukemia 2004;18,120-125 Leukemia 2004; 18,120-125
P
e
r
c
e
n
t
 Leucemie Acute Mieloidi:
Anomalie citogenetiche e molecolari
 MUTAZIONE

E’ UNA VARIAZIONE NELLA NORMALE SEQUENZA DEL DNA

ALCUNE MUTAZIONI SONO RESPONSABILI DELLO

SVILUPPO DI EMOPATIE MALIGNE

L’ESPOSIZIONE AD AGENTI FISICI (RADIAZIONI

IONIZZANTI), CHIMICI (BENZENE) O AMBIENTALI
(VIRUS) PUO’ AUMENTARE LA FREQUENZA DI TALI
MUTAZIONI
 Plasma membrane

FOSFOPROTEINA
NUCLEOLARE
CON FUNZIONI
DI TRASPORTO
DI RNA E
PROTEINE FRA
Nucleus NUCLEO E
CITOPLASMA

Nucleolus Cytoplasm
 NPM

CRM1

CRM1 NPM
 Mutazione A
RIPRODUCIBILITA’

WT

965
959

WT GATCT CT G GC AG T G G A G G AAGTCTCTTTAAGAAAATAG
A GATCT CT G TCTG GC AG T G G A G G AAGTCTCTTTAAGAAAATAG
Figure 5. Kaplan-Meier analysis of AML with normal karyotype and different NPM1 and FLT3-
LM status

Schnittger, S. et al. Blood 2005;106:3733-3739

Copyright ©2005 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

 NPM1 mutated AML

Age: Adults

Sex: Female

Karyotype: Normal ( > 90%)

Immunophenotype: CD34-

Associated genetic events: FLT3-ITD (≥ 40%)

Prognosis Low Risk

 Leucemia

Trattamento
(Chemio-TMO-Altri Agenti)

Refrattaria Remissione

Malattia Minima Residua

(Recidiva)
 1000000

NPM mut.A copies/10^4 ABL copies

100000 NR
NR
10000 PR

1000

100 CR

10

1
Diagnosis Post-induction

Gorello P. et. al Leukemia. 2006 Jun;20(6):1103-8

 AML

Diagnostic WORK-UP for SPECIFIC SUBSET

Individualized Therapy

Genomic Identity Card

Malattia minima residua:
Con questa espressione si intende il tentativo di identificare, con sofisticate
tecniche di biologia molecolare, cellule leucemiche residue, anche quando a
livello del sangue periferico e del midollo osseo la malattia appare in remissione.
Questo approccio però può essere utilizzato quando la cellula leucemica
possiede una anormalità molecolare (marcatore). Ciò permette un follow-up più
sensibile dei pazienti in remissione e, di sapere precocemente se c’è necessità
di terapie aggiuntive.
Malattia Residua Minima

Meto

Immunofe
Leucemia Acuta Mieloblastica

Mutazioni Geniche

NPM1 nucleoporina (trasporto nucleo/citoplasma)

FLT3 tirosinchinasi
recettori per fattori di crescita
KIT
RAS transduzione del segnale
RECEPTOR FAMILY
FLT3
Extra Cellular
KIT

Cell Membrane

Tyr Kinase Intra Cellular

domains

Phosphorilation - Dimerisation -
Signal Transduction ( RAS; STAT; MAPK…)
Science 20 October 2006. Vol.314 no.5798, pp.433-434
 LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE

DE NOVO CONGENITE SECONDARIE

NPM1 PTPN11 MLL

FLT3 NF1 MDR

CEBP-α AML1 P53

PU.1 GATA JAK2

AML1 RAS Loss Rb

RAS

C-KIT
Complex Karyotype, del (5q); -5; del(7q);-7
PTPN11
Citogenetica e Analisi Molecolare delle leucemie

Diagnosi e prognosi
Follow-up
Malattia residua minima

LIMITI della citogenetica convenzionale

Assenza di mitosi
Citogenetica molecolare: FISH
Cariotipo normale
Riarrangiamenti criptici
Amplificazione genica
ANALISI MOLECOLARE: RT-PCR e sequenziamenti
J Mol Med (2007) 85:227-235
Krivtsov AV. Nat Rev Cancer. 2007 Nov;7(11):823-33
 Leucemie Acute Mieloidi:
Anomalie citogenetiche e molecolari
 CBF LEUKEMIAS

t(8;21) / AML1-ETO
inv(16) / MYH11-CBFB

CBFB
Attivatore Trascrizionale

AML1
Geni target

MPO, IL-3, GM-CSF, CSF-1R

 DHPLC

Profilo wild type

Assorbanza

Profilo mutato

Tempo di eluizione

Profilo wild type

Leucemia Acuta Mieloblastica

Mutazioni Geniche

NPM1 nucleoporina (trasporto nucleo/citoplasma)

FLT3 tirosinchinasi
recettori per fattori di crescita
KIT
RAS transduzione del segnale
 Nt. 959 A.A A.A
288 290

WT ctattcaagatctctg gcagtggaggaagtctctttaagaaaatag -DLWQWRKSL.

(NM_002520)

Mut.A tctgTCTGgcagtggaggaagtctctttaagaaaatag -DLCLAVEEVSLRK.

NES

Nt. 964 A.A A.A

(Deletion 5 nt.) 288 290

WT ctattcaagatctctggcagt ggaggaagtctctttaagaaaatag -DLWQWRKSL.

(NM_002520)

Mut.E cagtCTCTTGCCCaagtct -DLWQSLAQVSLRK.

(insertion 9 nt.)
NES
Differenziazione: interazione tra fattori
di crescita e fasi del ciclo cellulare

FLT3-L, SCF
 Class II alterations target transcriptional
regulators of hematopoiesis.
Impaired transcriptional activity

Block in cellular differentiation & maturation

Fusion genes involving: Point mutations involving:

- Core binding factor (CBF) - Core binding factor (CBF)
- Retinoic acid receptor α (RARα ) - CCAAT/enhancer binding
- Homeobox factors (HOX) protein (CEBP/α )
- Co-activators: CBP/p300 - PU.1
- NPM1
“LOSS OF FUNCTION MUTATIONS”
 Classificazione FAB delle LAM
FAB Anticorpi monoclonali

M0 minima differenziazione CD34, CD13 e/o CD33

HLA-DR, anti-MPO

M1 senza maturazione CD11, CD13, CD33, MLA-DR (CD19)

M2 segni di maturazione CD11, CD13, CD33, MLA-DR (CD19)

M3 promielociti leucemici CD19, CD33 (CD2) (CD34)

M4 maturazione granulocitaria CD11, CD13, CD33, CD14

e blasti monocitari HLA-DR, CD68

M5 monoblasti e monociti CD11, CD13, CD33, CD14

HLA-DR, CD68

M6 eritroblasti e mieloblasti Glicoforina, HLA-DR

Antigeni ABH

M7 blasti megacariocitari CD41, CD42a, CD42b, CD61

 Panel of antibodies for the diagnosis of
acute leukaemias

Myeloid

First line:

Second line:

Bain BJ. Clin Lab Haematol 2002 Feb;24(1):1-13

 PML/RARA blocca la
differenziazione mediata da fattori di
crescita (es. PU.1)
A very simplified model of action of transcription
factor fusions associated with acute leukemia.

Co-Act. Co-Rep.

TF Co-Act.
TF Co-Rep.

Co-Rep. Co-Act.

TF-fusion Co-Repr. TF-fusion Co-Act.

[e.g. CBF, X-RARα ] [e.g. MOZ, CBP]

Deregulation of target gene expression

 Geni coinvolti

ETO
8q22
localizzazione nucleare
fattore di trascrizione

AML1
21q22
localizzazione nucleare
fattore di trascrizione per vari geni che regolano l’ematopoiesi