INTERAZIONI

MORFOLOGIA

CELLULA LEUCEMICA

GENOTIPO
METABOLISMO

FENOTIPO
 Citogenetica Convenzionale

Citogenetica molecolare
FISH in interfase
FISH in metafase
Multi-FISH
CGH (ibridazione genomica comparativa)
CGH microarray
 Citogenetica Convenzionale

Prenatale Postnatale

- Amniocentesi - Citogenetica ematologica

- Villocentesi - Citogenetica oncologica
 DIAGNOSTICA PRENATALE

liquido amniotico
15°-16° settimana

villi coriali
10°-11° settimana
 INDICATIONS

Female with more than 35 years

Spontaneous abort

Parents request

Other child with chromosomal aberrations

Fetal malformation durin ecography control

Mother or father with balanced chromosomal aberration

 IN SITU TECHNIQUE

15-20 ml of amniotic liquid

centrifuge

Petri dishes

colony check under inverted microscope

harvesting directly on a dishes

color staining and banding

karyotyping of three metaphases for each colony

 Anomalie numeriche dei cromosomi sessuali

Klinefelter syndrome (XXY) Sindrome XXX

47 cromosomi femmine con XXX
Maschi Feconde, difficile identificazione
Sintomatologia assente alla nascita
sterilità

Turner syndrome (XO)

45 cromosomi
Femmine
Bassa statura, linfedema mani e piedi

XYY syndrome
Maschi con due Y
Normale fertilità
Numerical aberration of autosomal chromosomes

Down syndrome (trisomy 21)

Edwards syndrome (trisomy 18)

Patau syndrome (trisomy 13)

Multiple malformation (renal, cardiac)

Menthal retardation
Laboratorio di citogenetica ematologica

Campioni : midollo osseo

sangue periferico
linfonodo

COLTURE

RACCOLTA DELLE CELLULE

PREPARAZIONE DEI VETRINI E ANALISI

 PREPARAZIONE DELLE COLTURE

Midollo osseo: 19-25 X106 cellule

Sangue periferico: 19-25 X106 cellule

Linfonodo: 50-70X106 cellule

Terreno RPMI 1640

+20%FCS
+glutammina+pennicillina/streptomicina

Tempi: Coltura diretta

Colture a breve termine (24-48-72h)
 RACCOLTA

Trattamento con colchicina

Soluzione ipotonica (KCl 0,075M), 10 min. 37°C

Fissativo di Carnoy (metanolo/acido acetico 3:1)

pellet citogenetico

Citogenetica convenzionale Citogenetica molecolare

cariotipo FISH
 PREPARAZIONE dei VETRINI

Prelavaggio dei vetrini in etanolo

microscopio invertito

Fissaggio su piastra calda per alcuni secondi

Invecchiamento a 60°C overnight

Bandeggio

Cariotipizzazione
(15-20 metafasi)
Ciclo cellulare
G-BANDING KARYOTYPE
R-BANDING KARYOTYPE
 Human Chromosomes

p arm
centromere Male 46,XY

q arm telomere Female 46,XX

 Dimension and centromere position

submethacentric
methacentric acrocentric
REGION

BAND
 15
14 band 5p14
13

ISCN

An International System for Human Cytogenetic Nomenclature

CHROMOSOME BAND AND NOMENCLATURE

Region and band are numbered

15 consecutively from the centromere
14
outward along each chromosome
13
arm.

The centromere (cen) itself is

designed 10.

In designating a particulary band

1) the chromosome number
2) the arm symbol
3) the region number
4) the band number
Conventional Cytogenetics

Normal karyotype

Abnormal karyotype
Numerical abnormalities monosomies
trisomies
tetrasomies
Structural abormalities
translocations
deletions
inversions
Translocations reciprocal

non reciprocal
2 break on donor chromosome
1 break on recepient chromosome

t(8;21)(q22;q22)
terminal and interstitial deletions
pericentric inversion

inv
inv // del(16)(q22)
del(16)(q22)
 paracentric inversion

nl3
nl3 inv(3)(q21q26)
inv(3)(q21q26)
 Karyotype designation
International System for Human Cytogenetics Nomenclature
(ISCN 2009)
Examples
1) normal male 46,XY
2) normal female 46,XX
3) male with trisomy 8 47,XY,+8
4) female with monosomy 7 45,XX,-7
5) female with translocation 46, XX,t(9;22)(q34;q11)
between chr 9 and chr 22
6) male with a deletion on 46,XY,del(5q)(q13q33)
the long arm of chr 5
7) female with inversion 46,XX,inv(16)(p13q22)
involved chr 16
 Definition of “clone”

A clone is defined as a cell population

derived from a single progenitor

For trisomies or structural rearrangements,

the same aberration has to be present in at
least two metaphases

For monosomies, the chromosome loss has

to be present in at least three metaphases
 Fanconi’s Anemia
(autosomica recessiva)
Test al DEB o alla MMC
(test di fragilità cromosomica)

- Linfociti T di sangue periferico

- Colture cellulari 72/96 h

cariotipo costituzionale
analisi di rotture e presenza di figure quadri- tetra- radiali
dopo coltura con DEB (diepossibutano) e/o MMC (Mitomicina C)

% cellule con rotture spontanee e indotte da agenti

 Fanconi anemia
chromosomal fragility

• Spontaneous

• Inducted by Mitomycin C, diepoxibuthan (DEB)

break gap tri-quadriradial

 WHO
World Health Organitazion
Classification of Tumors
2001

morfologia, immunofenotipo,
genetica, clinica
 AML
PROGNOSIS
Translocation Genes FAB Prognosis

t(15;17)(q22;q11) PML-RARA M3 Favorable

t(8;21)(q22;q22) ETO-AML1 M2 Favorable

inv(16)(p13q22) MYH11-CBFB M4eo Favorable

inv(3)(q21q26) EVI1 M1 Unfavorable

t(8;16)(p11;p13) MOZ-CBP M4-M5 Unfavorable

t(6;9)(p23;q34) DEK-CAN M2-M4 Unfavorable

t(3;5)(q25;q35) NPM-MLF1 M6 Unfavorable

 ALL
PROGNOSIS

Translocation Genes Type of ALL Prognosis

t(9;22)(q34;q11) BCR-ABL B-ALL, mixed ALL Unfavorable

t(11;…)(q23;…) MLL B-ALL, T-ALL Unfavorable

t(4;11)(q21;q23) MLL-AF10 B-ALL, mixed ALL Unfavorable

t(12,21)(p13;q22) ETV6-AML1 PRE-B ALL Favorable

t(8;14)(q24;q32) MYC-IgH L3 Unfavorable

t(14; )(q11; ) TCR T-ALL Unfavorable

 CARIOTIPI NORMALI

Lesioni genetiche criptiche Mutazioni geniche

RAS

AML1 MLL
traslocazioni inserzioni
telomeriche c-KIT FLT3 WT1 NPM1
microdelezioni
 t(12;21)(p13;q22)
t(12;21)(p13;q22)

Cryptic
Cryptic Cryptic
Cryptic
Translocation
Translocation Translocation
Translocation &&Deletion
Deletion

Cytogenetics
t(12;21) often remain undetected
 CARIOTIPO

Diagnosi

Monitoraggio della malattia (MRD)

Limiti
 Citogenetica Convenzionale

Citogenetica molecolare
FISH in interfase
FISH in metafase
Multi-FISH
CGH (ibridazione genomica comparativa)
CGH microarray
 Utilità nell’utilizzo della citogenetica molecolare

Cariotipo normale

Assenza di cellule in metafase (I-FISH)

Traslocazioni non discriminabili all’analisi del cariotipo

Affiliazione di linea di lesioni specifiche (FICTION)

Studio di traslocazioni rare (M-FISH)

Studio di cariotipi complessi (Multi-FISH/CGH)

Citogenetica: studio delle piastre metafasiche
anomalie cromosomiche (numeriche e strutturali)

Citogenetica molecolare: Ibridazione In Situ in Fluorescenza (FISH)

FISH in interfase
FICTION
FISH in metafase
Multi-FISH
Micro-FISH
Ibridazione Genomica Comparativa (CGH)

Biologia molecolare: Southern Blot

PCR (Polymerase chain reaction)
Microarray (studio dell’espressione genica)
Ibridazione In Situ in Fluorescenza (FISH)

PRINCIPIO

APPLICAZIONI

VANTAGGI

TECNICA
 PRINCIPIO

La FISH è una tecnica di studio del

DNA con cui, sequenze specifiche di
acido desossiribonucleico possono
essere studiate direttamente su
cromosomi, nuclei, cellule intere e
sezioni di tessuto.
 FISH: metodica

+
DNA target Sonda marcata con aptene

DENATURAZIONE RIVELAZIONE

Ab
I) anti-aptene

II) Ab
IBRIDAZIONE
 APPLICAZIONI

Caratterizzazione di anomalie cromosomiche sia numeriche

che strutturali

Identificazione dei geni coinvolti nei punti di rottura dei

riarrangiamenti cromosomici

Definizione dell’entità di un clone cellulare aberrante

Studio di cellule con cariotipo normale per l’identificazione di

eventi molecolari criptici

Studio combinato fenotipo/genotipo per l’identificazione della

linea cellulare a cui la cellula anormale appartiene
 VANTAGGI

Studio molecolare su cellule intere e su preparati

citogenetici

Localizzazione cromosomica di eventi molecolari aberranti

Definizione quantitativa del clone cellulare anormale

Classificazione morfologica e/o fenotipica delle cellule

anormali
 ANALISI

ANALISI IN MICROSCOPIA A FLUORESCENZA

FILTRI A SINGOLA BANDA PER LO STUDIO DI

SINGOLI FLUOROCROMI

FILTRI A DOPPIA E TRIPLA BANDA PER LO STUDIO

SIMULTANEO DI PIU’ SONDE MARCATE CON
FLUOROCROMI DIVERSI

TELECAMERA PER LA CATTURA DEI SEGNALI

SOFTWARE DI ANALISI DI IMMAGINE

 DNA TARGET

Campioni cellulari di sangue periferico, midollo osseo,

sezioni di tessuto

Preparato citogenetico (cellule fissate dopo lisi della

membrana cellulare), citocentrifugati, apposizioni
cellulari

Le cellule che si vogliono studiare vengono poste su

vetrini
Tipologia delle sonde di DNA utilizzabili in FISH

sonde per sequenze ripetute: regioni centromeriche

regioni pericenromeriche
regioni telomeriche

sonde per sequenze specifiche: locus-specifiche

gene-specifiche
riarrangiamento-specifiche

sonde per interi cromosomi (painting)

sonde specifiche per il braccio corto o lungo del cromosoma

sonda Multi-FISH (24 paintings)

sonde da microdissezione cromosomica

 Sonde di DNA

A doppia elica
A singola elica

Vettori : Tipo Dimensioni (kb)

cosmidi 35-45
plasmidi 35-45
PAC 100-300
BAC >300
YAC 100-1000
 I-FISH

Studio di casi con cariotipo normale

Studio di casi con cariotipo non valutabile

Valutazione della MRD durante il trattamento

 FISH in interfase

DNA target:
nuclei fissati
citocentrifugati di cellule intere
apposizioni di tessuto
sezioni di tessuto
cellule intere marcate con anticorpi specifici (FICTION)

Sonde utilizzabili:
sonde centromeriche e pericentromeriche, sonde per
regioni specifiche, sonde per riarrangiamenti genici
specifici
t(9;22) (q34;q11) t(2;5)(p32;q35)

BCR

ABL Ph- NPM

Ph+
Pattern di ibridazione normale

Pattern di ibridazione alterato

 I-FISH:STUDIO
-ANOMALIE NUMERICHE
monosomie / trisomie

amplificazioni

-ANOMALIE STRUTTURALI

delezioni / duplicazioni

traslocazioni /inversioni
 del(5)(q)

LSI CSF1R (5q31)/LSI D5S721:D5S23 (5p15)

 del(7)(q)

LSI D7S486 (7q31)/CEP 7 (centromero)

C
C -- 33 MLF1
MLF1
MLL gene - 5’ - 3’
MLL amplification
I-FISH nei trapianti sex-mismached

C-X C-Y
 FISH in METAFASE

Studio di traslocazioni/geni di fusione

Definizione citogenetica di riarrangiamenti

cromosomici criptici

Studio dei punti di rottura di traslocazioni

rare/nuove e ancora non definite sul piano molecolare

Identificazione di nuovi geni coinvolti nella patogenesi

di malattie onco-ematologiche, sindromi congenite
ecc...
 FISH in METAFASE

DNA target:
Piastre metafasiche

Sonde utilizzabili:
sonde centromeriche e pericentromeriche,
sonde per regioni genomiche specifiche (loci e/o
geni), sonde per riarrangiamenti genici specifici, sonde
microdissettate da cromosomi, sonde painting per
interi cromosomi o per un singolo braccio cromosomico,
Kit MULTI-COLOR
 GENE
CLONING

Through breakpoint narrowing

 BAC regione 1q24

1q24

1q24
SONDA PAINTING PER IL CROMOSOMA 12
 MULTI-FISH

Ibridazioni in situ in fluorescenza utilizzando

simultaneamente 24 painting cromosomici che
identificano con colori diversi le 22 coppie di
cromosomi autosomici e i due cromosomi
sessuali X e Y
 MULTI-FISH

Definizione di cariotipi complessi

Identificazione del materiale cromosomico che

partecipa in traslocazioni non bilanciate

Identificazione di marcatori cromosomici e

cromosomi ad anello

La MULTI-FISH ha il vantaggio di identificare

con un singolo esperimento tutti i riarrangiamenti
cromosomici presenti al cariotipo
MULTI-FISH
 add(1)(p36) marker
marker

add(9)(q34)
marker

add(15)(p)

marker

add(1)(p36) marker Multi-Banding add(9)(q34) add(15)(p)

t(5;9) t(5;15)
t(1;6) der(1)
 MICRO-FISH

Tecnica di FISH con sonde generate con

procedura di microdissezione cromosomica e PCR
Produzione di sonde di DNA ottenute da regioni
cromosomiche specifiche

IL DNA cosi isolato viene amplificato con metodica

di PCR

Le sonde che possono essere generate sono:

painting per interi cromosomi, per un braccio
cromosomico, o per singole bande cromosomiche
 MICRO-FISH

Studio di riarrangiamenti cariotipici non definibili

sulla base della citogenetica convenzionale
utilizzando sonde generate da cromosomi normali

Sonde microdissettate da cromosomi coinvolti in

riarrangiamenti genici (traslocazioni, inserzioni,
marcatori, rings) per identificare le regioni
genomiche coinvolte nel riarrangiamento specifico
1)
Microdissezione cromosomica
da piastre metafasiche con
l’ausilio di un microscopio
ottico invertito

2)
Recupero della banda
cromosomica microdissettata
e amplificazione + marcatura
con metodica di PCR

3)
Utilizzo della sonda generata
per esperimenti di FISH in
metafase
1p36
 Le metodiche fino ad ora descritte
(I-FISH; M-FISH; multi-FISH)
lavorano su cellule lisate (sol. ipotonica)

Impossibilità di associare la lesione genetica

al tipo di cellula che la possiede

sviluppo di una serie di tecniche affini

per questo fine
 FICTION
(Fluorescence Immunophenotype and
interphase Cytogenetics as a Tool for
Investigation Of Neoplasms)

•Analisi simultanea del genotipo e del fenotipo

cellulare

•Permette l’affiliazione di linea di ciascuna

anomalia genetica

•Può individuare anomalie genetiche di tipo

numerico o strutturale
 FICTION

Preparati cellulari: citocentrifugati

strisci di sangue midollare e periferico
sezioni di tessuto in paraffina

Caratterizzazione immunofenotipica:

anticorpo primario contro l’antigene cellulare che si vuole studiare;

cascata con 3 anticorpi policlonali legati ad un fluorocromo rosso (cy3), blu
(amca), o giallo (fluoresceina);
valutazione microscopica della fluorescenza;
fissaggio delle cellule (Sol Carnoy e paraformaldeide)

Denaturazione simultanea cellule (su vetrino) e sonda

Protocollo della I-FISH
 FICTION
IMMUNOFENOTIPO:
marcatura indiretta con anticorpi
monoclonali specifici per antigeni
di membrana

I-FISH con sonde centromeriche

o locus specifiche

ANALISI in microscopia a
CD13 fluorescenza
BCR/ABL
 PLURIPOTENT STEM CELL

MYELOID MIXED PROGENITOR

PROGENITOR LYMPHOID

THYMUS

PROG. PROG. PROG. PROG.

ERYTROID MEGACA.GRANULO/MONOCYTE EOSINOPHILS

B T

RED PLATELET MONO GRANU BASO EOSIN LYMPHOCYTES

CELLS