UNIVERSITÁ DEGLI STUDI DI NAPOLI FEDERICO II

SCUOLA INTERUNIVERSITARIA CAMPANA

DI SPECIALIZZAZIONE ALL’INSEGNAMENTO
VIII CICLO

TESINA DEL CORSO

Chimica analitica

Prof. Andini
Destinatari: II anno (ISTITUTO TECNICO)

Tempi: 1 lezioni da 55 minuti

Collegamenti interdisciplinari: chimica dei materiali;scienze della terra,

fisica.

Prerequisiti:modulo1(introduzione alla chimica) modulo 2la materia e le sue

trasformazioni UNITA’:materia ed energia UNITA’: le trasformazioni fisiche.

Obiettivi: descrivere le caratteristiche e le applicazioni della

cromatografia.

Metodologia: lezione frontale, attività di didattica interattiva e

partecipata, lavoro di gruppo, esercitazioni di laboratorio.
Strumenti: lavagna, libro di testo, utilizzo di sussidi multimediali
Verifica: di tipo orale e corredata da test a risposta aperta e multipla.
CROMATOGRAFIA
(dal greco: chroma, colore + graphein, scrivere)
 Cromatografia
Il termine cromatografia indica un insieme di tecniche che
hanno lo scopo di separare una miscela nei suoi
componenti, per permetterne il riconoscimento qualitativo e
quantitativo.
Queste tecniche sono basate sulla distribuzione
differenziale dei vari componenti fra due fasi, una chiamata
fase fissa o fase stazionaria e l’altra chiamata fase mobile o
eluente, che fluisce in continuo attraverso la fase fissa
Le tecniche sono molto utilizzate, essendo particolarmente
utili nell’analisi di miscele complesse come sono la maggior
parte dei campioni di natura organica
 Nascita della cromatografia
La cromatografia è nata all’inizio del XX secolo come
tecnica per la separazione di pigmenti fogliari, inventata
dal botanico russo Mikhail Semenovich Tswett. Egli
intendeva separare i pigmenti presenti nella clorofilla;
fece un estratto di foglie verdi in etere di petrolio, lo
depositò in testa ad una colonna di vetro impaccata con
carbonato di calcio ed eluì, (cioè versò in continuo) con
solfuro di carbonio: i vari pigmenti si separano in bande
colorate, in particolare clorofilla A e B, carotene e
xantofilla

Tswett chiamò questa

tecnica cromatografia dal
greco scrittura del colore o,
visto il significato del suo
cognome in russo, scrittura di
Tswett
 INTRODUZIONE

• I metodi di separazione sfruttano le seguenti

caratteristiche chimico-fisiche:
• Carica
• Dimensioni
• Solubilità
• Affinità di legame con altre proteine
Il cromatografo ionico è sostanzialmente un
HPLC ed è composto da:

Riserva di Pompa tipo HPLC

eluente
Soppressore Integratore

Valvola Rivelatore a Conducibilità

Iniezione Colonna
 Scambio ionico
• La fase stazionaria è costituita da un polimero inerte
contenente siti attivi ionizzati o ionizzabili, i cui controioni
possono essere scambiati con altri ioni aventi carica dello
stesso segno. Il meccanismo di separazione è basato sulla
competizione per i siti di scambio tra gli ioni presenti nella fase
mobile e quelli presenti nel campione. Si parla di cromatografia
di scambio ionico (IEC)

• La cromatografia a
• scambio ionico è
• impiegata per la
• separazione di sostanze
• ioniche o ionizzabili
 CROMATOGRAFIA SCAMBIO
IONICO

• PRINCIPIO Attrazione che si verifica tra cariche

• di segno opposto

• La separazione è condotta su colonne impaccate con

resine scambiatrici di ioni.

• Scambiatrici di anioni Scambiatrici di cationi

 Cromatografia di
scambio ionico

Scambio anionico
A pH maggiore del pI (almeno una
unità) la proteina è carica
negativamente e lega la colonna a
scambio anionico.
L’eluizione avviene con [Cl-] crescente
o abbassando il pH (più difficile da
controllare).
Scambio cationico
A pH minore del pI (almeno una unità)
la proteina è carica positivamente e
lega la colonna a scambio cationico.
L’eluizione avviene con [Na+]
crescente o alzando il pH.
 In generale le specie che presentano più cariche
tenderanno a legarsi più fortemente alla resina

È necessario l’impiego di uno ione competitore

perché gli analiti vengano rilasciati: ELUENTE
 Visualizzazione della separazione
Ponendo all’uscita della colonna
un rivelatore che misuri la
concentrazione del soluto nell’eluato
(cioè la fase mobile che esce dalla colonna)
e riportando il segnale in funzione
del tempo si può ottenere un
cromatogramma
La posizione dei picchi
sull’asse dei tempi,
o tempo di ritenzione,
serve per identificare i componenti
del campione
L’area sottesa dai picchi è proporzionale
alla quantità di ogni singolo componente
e può essere utilizzata a scopo quantitativo.
 Tempo di ritenzione

Il tempo di ritenzione tR è il tempo che impiega un componente della miscela

iniettata ad uscire dalla colonna o, tecnicamente, ad essere rivelato come picco
dal detector. Un tipico cromatogramma per una miscela a due componenti ha
due situazioni diverse:
• il picco a sinistra rappresenta un soluto che non ha alcuna interazione con
la fase stazionaria ed esce al cosiddetto tempo morto, tM
• il picco a destra rappresenta un soluto che ha, invece, interazione con la
fase stazionaria ed esce al tempo tR > tM
Cromatografia di scambio ionico
Le resine a scambio ionico sono costituite da un reticolo irregolare
tridimensionale di catene di natura organica unite tra loro da legami
incrociati.
Solitamente uno scheletro
Su questa matrice sono fissati dei
polistirenico è ottenuto per
raggruppamenti ionici (quali –SO3-,COO-,
copolimerizzazione dello stirene
-NR3+) in grado di interagire con uno ione
con il divinilbenzene. Il contenuto
metallico o per semplice scambio ionico
di divinilbenzene può variare
o mediante formazione di legami
dall’ 1 al 16% e determina il
di coordinazione (resine complessanti o
grado di reticolazione (cross-
chelanti).
linking).
Lo scambiatore si dice cationico
quando contiene delle cariche Lo scambiatore si dice
negative e i cationi sono attratti anionico quando contiene dei
elettrostaticamente da questi gruppi carichi positivamente
siti di carica opposta. in grado cioè di legare degli
ioni di carica negativa.

Gli anelli benzenici possono venire modificati per produrre una resina a scambio
cationico contente gruppi solfonato (-SO3-) oppure una resina anionica contenente
gruppi ammonici (-NR3+).
Se al posto dello stirene si usa acido metacrilico si ottiene una resina con gruppi attivi
carbossilici e scheletro acrilico divinilbenzenico (-COO-).
CROMATOGRAFIA SCAMBIO
IONICO
Ampio intervallo di pH di utilizzo
La comune
definizione Cationico Anionico
delle resine ioniche
è fatta -N+(CH3)3
Forte -SO3- H+
sulla base della OH-
acidità del loro
Debole -COO- H+ -N+H3 OH-
gruppo attivo.

Ridotto intervallo di pH di utilizzo

 Resine con alto gradodi reticolazione
sono rigide e poco porose,lente nel
raggiungere l’equilibrio, anche se la
Il grado di reticolazione nelle resine
selettività e la capacità sono
a scambio ionico è variabile maggiori rispetto alle resine
ed è scelto in funzione delle caratteristiche con basso grado di reticolazione
che deve presentare lo scambiatore. (dette anche macroporose)
sono più
veloci ad equilibrarsi,
ma che si rigonfiano d’acqua.

L’affinità maggiore per la fase resina è per ioni:

1) a carica elevata,
2)a piccolo raggio di idratazione,
3) molto polarizzabili (polarizzabilità
è capacità della nuvola elettronica di uno ione a venire deformata
da cariche vicine e a formare un dipolo).
 Come sono fatte le resine scambiatrici?
Sono costituite da gruppi carichi legati covalentemente ad una matrice di supporto

MATRICI
polimeri di stirene
chimicamente:
CM-cellulosa GRUPPI IONICI FUNZIONALI
DEAE-cellulosa gruppo solfonato
derivati del destrano ammine quaternarie
e dell’agarosio gruppo carbossilico
(Sephadex e Sepharose) dietilammonio

Scambiatori forti Scambiatori deboli

 S
RESINA SUPPORTO GRUPPO TIPO
C
FUNZIONALE
A
DEAE Sepharose CH2CH2N+H(CH2 Scambio anionico M
(Pharmacia) Agarosio CH3) 2 (debole) B
DEAE Bio-Gel A dietilaminoetil I
(Bio-Rad) A
(DEAE)
T
QAE Sephadex Dietil-(2- Scambio anionico
C50 (Pharmacia)
Destrano idrossipropil) (forte)
O
R
aminoetil (un
I
ammina
quaternaria)
P
CM Sepharose -CH2COO- Scambio cationico
(Pharmacia)
Agarosio Carbossimetil (debole)
I
U’

SP Sephadex C50 -(CH2) 3SO3- Scambio cationico C

(Pharmacia)
Agarosio Sulfopropil (forte O
M
U
N
I
 AGAROSIO

Carbossimetilcellulosa
 LE COLONNE
Sono il cuore dello strumento.
La separazione avviene per una serie di
equilibri di scambio tra fase stazionaria e fase
mobile (eluente).
Gli ioni con carica netta più elevata (al pH
dell’eluente) vengono trattenuti più fortemente
A parità di carica vi è un ordine di selettività
che dipende dal tipo di fase stazionaria
(dipende dalle costanti di scambio).

Forti Deboli
 ELUENTE
La fase eluente deve contenere elettroliti forti, composti ionici completamente
dissociati, in grado di competere con gli analiti nello scambio con la resina.
Gli analiti vengono eluiti più velocemente quanto più è alta la
concentrazione di competitori.
Se rimane costante durante tuttal’analisi -> Eluizione Isocratica
Se cambia di composizione durante l’analisi ->
Gradiente di Eluizione

Concentrazione
Forza Ionica dei costituenti

pH
 RIVELATORE
Dato che si determinano ioni, il rivelatore universalmente utilizzato
è costituito da una piccola cella conduttimetrica.
Applicando una piccola ddp tra i due
elettrodi, fluisce una corrente proporzionale
alla conducibilità dell’eluente + analita.
Problema: poiché i rivelatori a
conducibilità rispondono a tutti gli ioni e
l’eluente è costituito da una soluzione
elettrolitica concentrata, il suo segnale
coprirebbe quello degli analiti.

Come è possibile
ovviare al problema?
 SOPPRESSIONE
• La conducibilità dell’eluente viene eliminata mediante un Soppressore
• L’unità di soppressione può essere costituita da:
• Cartucce usa e getta
• Micromembrana rigenerata controcorrente
• Micromembrana rigenerata elettroliticamente
• Il soppressore è uno scambiatore di ioni di segno opposto rispetto agli analiti ed ha lo
scopo di diminuire il segnale di fondo dato dagli ioni contenuti nell’eluente.
Cromatografia di scambio ionico
Cromatografia di scambio ionico

VANTAGGI
Per grandi volumi,
Grandi quantità di proteina (1-5 g proteina per 100 ml),
Matrice molto robusta,
Condizioni molto flessibili, possibili molte variazioni.

SVANTAGGI
Proteine allo stesso Ph
e concentrazioni di sali della colonna.
Ciò può essere scomodo
poiché poi occorre passare in dialisi per togliere i sali.